肺結(jié)核88例外周血單核細(xì)胞中白細(xì)胞分化抗原36水平及其臨床意義

陳志富，李利娟，蔣蜀玫

作者單位：廣安市人民醫(yī)院，a感染科，b全科醫(yī)學(xué)科，c骨科，四川 廣安638000

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌（MTB）引起的一種慢性肺部感染性疾病，通過打噴嚏、空氣飛沫和咳嗽等多種方法在人與人之間傳播，是造成世界上成千上萬人死亡的最重要傳染病之一，其發(fā)病率一直呈上升趨勢，有效的臨床防治是降低肺結(jié)核發(fā)病率的重要手段［1-2］。脂類代謝是一種必需的代謝過程，越來越多的證據(jù)表明脂代謝在肺結(jié)核發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，MTB可以控制其細(xì)胞壁的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，影響宿主在感染過程中免疫應(yīng)答［3］。另外的研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核病病人血脂相關(guān)指標(biāo)的水平與健康者相比明顯下降［4］。白細(xì)胞分化抗原36（CD36）屬于B族清道夫受體家族，可與多種配體結(jié)合，包括凋亡細(xì)胞、血小板反應(yīng)素-1和脂肪酸，其生物學(xué)功能包括脂質(zhì)攝取、免疫識別和分子黏附等［5］。據(jù)研究報道，CD36在脂質(zhì)代謝中起著至關(guān)重要的作用，與人體免疫功能密切相關(guān)，并且CD36參與了結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展過程［5-6］。然而對于CD36在肺結(jié)核病人中的表達(dá)水平及其與機(jī)體脂代謝的關(guān)系知之甚少。因此，本研究檢測了肺結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中CD36的水平和血脂相關(guān)指標(biāo)的水平，旨在分析CD36與脂代謝的關(guān)系，以及對疾病發(fā)生發(fā)展的影響，為肺結(jié)核的預(yù)防和治療提供理論指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究共納入廣安市人民醫(yī)院2020年3月至2021年9月期間住院治療的肺結(jié)核病人88例作為研究組，男性48例，女性40例，年齡范圍20～63歲，年齡（41.98±10.63）歲。根據(jù)是否耐藥分為非耐藥肺結(jié)核（52例）和耐藥肺結(jié)核（36例），耐藥肺結(jié)核中單耐藥21例、多耐藥15例。單耐藥：肺結(jié)核病人感染的MTB，經(jīng)體外藥物敏感性試驗（DST）證實，是對1種一線抗結(jié)核藥物耐藥的肺結(jié)核；多耐藥：肺結(jié)核病人感染的MTB，經(jīng)體外DST證實，對至少2種一線抗結(jié)核藥物耐藥的肺結(jié)核，且排除同時對利福平和異煙肼耐藥的病人［7］。根據(jù)痰涂片結(jié)果分為痰涂片陰性（40例）和痰涂片陽性（48例）。所有病人依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》［8］標(biāo)準(zhǔn)確診為肺結(jié)核，具備結(jié)核病影像學(xué)表現(xiàn)特征，均為初治病人。被診斷患有艾滋病、腎臟疾病、免疫系統(tǒng)疾病和任何呼吸系統(tǒng)疾?。ɡ缏宰枞苑渭膊?、纖維化、慢性支氣管炎、哮喘或肺癌）的受試者都被排除在本研究之外。選取88例同期于廣安市人民醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康者作為對照組，男性46例，女性42例，年齡范圍18～60歲，年齡（40.75±11.09）歲。研究組和對照組的性別（χ2=0.09，P=0.762）、年齡（t=0.75，P=0.454）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 外周血單核細(xì)胞分離 所有參與者使用真空采血管在禁食狀態(tài)下抽取外周血5 mL。取1 mL血液使用乙二胺四乙酸進(jìn)行抗凝，加等量肝素的無血清緩沖液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加在與血液等量的淋巴細(xì)胞分離液上，室溫下以2 000 r/min離心20 min，吸去最上層的血漿，收集乳白色淋巴細(xì)胞層，加入含肝素的離心管中混勻，200×g離心10 min，經(jīng)兩次沉淀洗滌后得到單核細(xì)胞，用于CD36水平檢測。剩余血液離心分離血清，轉(zhuǎn)移到新的試管中用于血脂水平檢測。

1.2.2 外周血單核細(xì)胞中CD36表達(dá)水平的檢測用TRIzol試劑（深圳子科生物科技有限公司，貨號15596018）提取外周血單核細(xì)胞總RNA，然后，根據(jù)說明書步驟用PrimeScript RT試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，貨號RR036A）反向轉(zhuǎn)錄1 μg總RNA為第一鏈互補(bǔ)DNA。用SYBR Green Master Mix試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號MT0017）進(jìn)行實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），qRT-PCR在ABI 7500熒光定量儀上（美國ABI生物公司）完成。用于qRT-PCR的特異引物序列見表1。β-肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參基因用于標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用2-ΔΔCt法計算CD36的相對表達(dá)水平。

表1 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.2.3 血清中血脂水平的檢測 血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、載脂蛋白AI（ApoAI）、載脂蛋白B（ApoB）水平利用免疫比濁法在全自動生化分析儀上（美國貝克曼公司，型號BECKMAN COULTER AU5800）完成測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)處理使用SPSS 24.0軟件完成。計數(shù)資料用例表示，比較采用χ2檢驗；計量數(shù)據(jù)用表示，兩組采用獨(dú)立樣本t檢驗分析比較各組之間外周血單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平及血清中血脂水平的差異；采用Pearson法分析研究組CD36的表達(dá)水平與血脂水平的相關(guān)性；采用多元線性回歸分析外周血單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血單核細(xì)胞中CD36及血清中血脂水平的比較 研究組外周血單核細(xì)胞中CD36表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05），血清中TG、TC、LDLC、HDL-C、ApoAI和ApoB水平均明顯低于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組外周血單核細(xì)胞中CD36及血清中血脂水平的差異比較/

表2 兩組外周血單核細(xì)胞中CD36及血清中血脂水平的差異比較/

注：CD36為白細(xì)胞分化抗原36，TG為三酰甘油，TC為總膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，ApoAI為載脂蛋白AI，ApoB為載脂蛋白B。

ApoB/（g/L）1.16±0.26 0.94±0.21 6.18＜0.001組別對照組研究組t值P值例數(shù)88 88 CD36 1.06±0.32 1.80±0.42 13.15＜0.001 TG/（mmol/L）1.79±0.54 1.12±0.29 10.25＜0.001 TC/（mmol/L）4.45±0.55 4.05±0.91 3.53 0.001 HDL-C/（mmol/L）1.57±0.39 1.13±0.32 8.18＜0.001 LDL-C/（mmol/L）2.43±0.44 2.05±0.57 4.95＜0.001 ApoAI/（g/L）1.63±0.28 1.42±0.42 3.90＜0.001

2.2 耐藥和非耐藥肺結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中CD36及血清中血脂水平的比較 耐藥肺結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中CD36表達(dá)水平顯著高于非耐藥肺結(jié)核（P＜0.05），血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平均明顯低于非耐藥肺結(jié)核（P＜0.05）。見表3。

表3 耐藥和非耐藥肺結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中CD36及血清中血脂水平的比較/

注：CD36為白細(xì)胞分化抗原36，TG為三酰甘油，TC為總膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，ApoAI為載脂蛋白AI，ApoB為載脂蛋白B。

ApoB/（g/L）1.00±0.23 0.86±0.18 3.06 0.003類別非耐藥肺結(jié)核耐藥肺結(jié)核t值P值例數(shù)52 36 CD36 1.65±0.39 2.01±0.47 3.91＜0.001 TG/（mmol/L）1.19±0.32 1.02±0.25 2.67 0.009 TC/（mmol/L）4.22±0.96 3.82±0.84 2.02 0.046 HDL-C/（mmol/L）1.20±0.34 1.04±0.29 2.30 0.024 LDL-C/（mmol/L）2.17±0.60 1.88±0.53 2.34 0.022 ApoAI/（g/L）1.51±0.43 1.30±0.40 2.32 0.023

2.3 痰涂片陽性和陰性肺結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中CD36及血清中血脂水平的比較 痰涂片陽性病人外周血單核細(xì)胞中CD36表達(dá)水平顯著高于痰涂片陰性（P＜0.05），血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平均明顯低于痰涂片陰性（P＜0.05）。見表4。

表4 痰涂片陽性和陰性肺結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中CD36及血清中血脂水平的比較/

表4 痰涂片陽性和陰性肺結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中CD36及血清中血脂水平的比較/

注：CD36為白細(xì)胞分化抗原36，TG為三酰甘油，TC為總膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，ApoAI為載脂蛋白AI，ApoB為載脂蛋白B。

ApoB/（g/L）1.04±0.24 0.85±0.19 4.14＜0.001類別痰涂片陰性痰涂片陽性t值P值例數(shù)40 48 CD36 1.60±0.38 1.97±0.45 4.12＜0.001 TG/（mmol/L）1.22±0.34 1.03±0.25 3.02 0.003 TC/（mmol/L）4.27±0.95 3.86±0.88 2.10 0.039 HDL-C/（mmol/L）1.21±0.33 1.06±0.31 2.20 0.031 LDL-C/（mmol/L）2.23±0.62 1.90±0.53 2.69 0.009 ApoAI/（g/L）1.55±0.45 1.31±0.39 2.68 0.009

2.4 研究組外周血單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平與血脂水平的相關(guān)性 根據(jù)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，研究組外周血單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平分別與血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表5。

表5 肺結(jié)核88例外周血單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平與血脂水平的相關(guān)性分析

2.5 外周血單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平的多元線性回歸分析 以外周血單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平為因變量，TG、TC、HDL-C、LDL-C、ApoAI、ApoB為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示，經(jīng)校正其他影響因素后，TG降低、HDL-C降低、ApoB降低是外周血單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平的影響因素（P＜0.05），見表6。

3 討論

肺結(jié)核是一種嚴(yán)重威脅人類身心健康的傳染性疾病之一，傳染性較強(qiáng)，由于需要長期服用藥物，治療周期較長，對病人的生活質(zhì)量及家庭的經(jīng)濟(jì)狀況造成嚴(yán)重影響，是全球面臨的公共衛(wèi)生健康問題。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷地進(jìn)步，肺結(jié)核病的治愈率有了明顯的提高，但根據(jù)最新的全球肺結(jié)核病報告數(shù)據(jù)表明，我國仍是全球肺結(jié)核第三高負(fù)擔(dān)國家［9-10］。肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，并且臨床治療效果受多種因素的影響，預(yù)防和防治是當(dāng)前治療肺結(jié)核的重點(diǎn)，深入了解肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展的有關(guān)因素，將有助于制定更好的臨床治療措施。

CD36是一種單鏈跨膜糖蛋白，位于人類7號染色體，存在于許多細(xì)胞的表面，如血小板、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞，在多種疾病的病理過程中具有重要作用，其高表達(dá)可促進(jìn)機(jī)體對脂質(zhì)的攝入和吸收，加速以巨噬細(xì)胞為首的慢性炎癥反應(yīng)［11］。除此之外，CD36可以維持正常脂質(zhì)代謝，可作為外源長鏈脂肪酸受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在脂代謝中發(fā)揮作用［12-13］。近年來，關(guān)于CD36在脂類代謝異常相關(guān)疾病中的作用受到研究人員的關(guān)注?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)報道了血清CD36在糖尿病、動脈粥樣硬化中表達(dá)水平顯著升高，參與腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展，可能作為潛在的治療靶點(diǎn)［14］。此前有研究顯示，MTB感染能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞CD36的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集，在MTB感染巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用［15］。有人指出，過氧化物酶增殖物活化受體γ（PPARγ）能夠增強(qiáng)CD36的表達(dá)，在體外增強(qiáng)人巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌的生長，結(jié)核病病人外周血單核細(xì)胞CD36基因和蛋白表達(dá)水平升高［16］。本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病人的外周血單核細(xì)胞中CD36的表達(dá)水平升高，符合前人所報道的研究結(jié)果，說明其可能在肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。同時發(fā)現(xiàn)耐藥肺結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中CD36表達(dá)水平較非耐藥肺結(jié)核高，痰涂片陽性病人外周血單核細(xì)胞中CD36表達(dá)水平較痰涂片陰性高，說明CD36的高表達(dá)可能與肺結(jié)核病人疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。

脂質(zhì)是機(jī)體內(nèi)重要的成分，決定了機(jī)體的營養(yǎng)狀況和免疫功能，脂質(zhì)及其代謝物通過免疫系統(tǒng)對結(jié)核病抗性產(chǎn)生有益作用［17-18］。血脂含量可以反映體內(nèi)脂代謝的情況，在脂代謝途徑中起著至關(guān)重要的作用。正常情況下，人體血漿中的血脂水平（TC、TG、HDL-C、ApoAI等）能夠良好地保持著動態(tài)平衡，在疾病的因素下出現(xiàn)血脂異常。MTB感染可以通過多種方式控制宿主體內(nèi)的脂質(zhì)，MTB感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積累，以促進(jìn)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，另一方面以宿主脂質(zhì)作為主要營養(yǎng)源。在慢性感染期間，MTB對脂質(zhì)的利用導(dǎo)致巨噬細(xì)胞脂代謝異常，也是導(dǎo)致TB病人血脂水平低的原因。現(xiàn)有的文獻(xiàn)已經(jīng)表明，與正常受試者相比，肺結(jié)核病人的血液中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平下降［19-20］。本研究與以往研究結(jié)果一致，與對照組相比，肺結(jié)核病人血清的TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平明顯降低。同時發(fā)現(xiàn)耐藥肺結(jié)核病人血清中血脂水平均明顯低于非耐藥肺結(jié)核，痰涂片陽性病人血清中血脂水平均明顯低于痰涂片陰性。上述結(jié)果表明，血脂水平是影響肺結(jié)核發(fā)生發(fā)展的重要因素，適當(dāng)水平的血脂對免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)作是必要的。上述文獻(xiàn)報道了CD36在大量疾病中與脂代謝有關(guān)，在肺結(jié)核中的研究較少。既往研究發(fā)現(xiàn)，在MTB感染過程中PPARγ從不同水平調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，且結(jié)核病病人機(jī)體血脂水平的下降與PPARγ調(diào)節(jié)CD36表達(dá)有一定的關(guān)系［16］。因此本研究分析了CD36與肺結(jié)核病人脂代謝的關(guān)系，對肺結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中的CD36水平與血清中血脂水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CD36水平分別與血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoAI和ApoB水平呈負(fù)相關(guān)，且線性回歸分析結(jié)果顯示，TG降低、HDL-C降低、ApoB降低是外周血單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平的影響因素，表明CD36表達(dá)可能調(diào)節(jié)血脂水平影響肺結(jié)核病人脂代謝過程，在肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，肺結(jié)核病人CD36水平較高，血脂水平較低，均與病人是否耐藥及痰涂片結(jié)果有關(guān)，CD36表達(dá)參與了肺結(jié)核病人脂代謝過程，在肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，提示通過研究MTB的生理代謝，對發(fā)現(xiàn)新的結(jié)核病治療的分子靶點(diǎn)，篩選新藥具有重要意義。