環(huán)狀RNA在肺動脈高壓中的研究進展

黃殊倫，唐昊，吳艷

作者單位：無錫市人民醫(yī)院、南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 無錫214000

肺動脈高壓（PH）是由多種已知或未知原因引起的肺動脈壓異常升高的臨床病理生理綜合征。隨著病情的進展，PH會導致右心室負荷過重，右心室衰竭，最終導致死亡，是一種預后欠佳、病死率高、嚴重危害社會公眾健康的疾病。肺動脈收縮和肺血管重構是PH的主要病理生理基礎。肺血管由肺動脈內皮細胞（PAEC）、肺動脈平滑肌細胞（PASMC）等細胞構成。在免疫和炎癥等內在因素或缺氧和藥物等外界因素的影響下，PAEC、PASMC和成纖維細胞等出現(xiàn)異常增殖、代謝失調等情況，共同參與肺血管重塑、血管收縮過程［1-3］。目前，對PH的治療以擴張血管為主，靶向藥物因價格昂貴、適應證有限、副反應多等缺陷，在臨床應用受到很大限制。因此需要深入研究PH的發(fā)病機制，尋找新的生物標志物和治療靶點。

近年來，環(huán)狀RNA成為探索各類疾病發(fā)病機制的研究熱點。環(huán)狀RNA廣泛分布于各個器官系統(tǒng)，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA對PAEC、PASMC等細胞的功能具有調控作用，參與PH的發(fā)生發(fā)展過程，有望為PH新型生物標志物和治療靶點的開發(fā)提供理論依據。本研究就環(huán)狀RNA在肺動脈高壓中的作用機制綜述如下。

1 環(huán)狀RNA生物發(fā)生及功能

環(huán)狀RNA是一種由外顯子或內含子反向剪接形成的閉合環(huán)狀RNA分子。和線性RNA相比，環(huán)狀RNA不易降解，表達更穩(wěn)定，且擁有更長的半衰期，這些特性賦予環(huán)狀RNA作為生物標志物的潛能。其生物發(fā)生機制包括套索驅動的環(huán)化［4］、內含子配對驅動的環(huán)化［4］和RNA結合蛋白（RNA-binding protein，RBP）驅動的環(huán)化［5］。環(huán)狀RNA具有多種生物學功能：①海綿吸附作用，環(huán)狀RNA能夠靶向結合微RNA或RBP，從而調控它們的下游靶基因［6］；②編碼蛋白作用，環(huán)狀RNA能夠充當一些短肽和蛋白質的翻譯模板［7-8］；③調節(jié)線性RNA生成的作用，環(huán)狀RNA由剪切形成，它的生成與線性RNA的剪切存在競爭關系，環(huán)狀RNA和線性RNA通過競爭剪接位點來互相調節(jié)彼此的形成。此外，環(huán)狀RNA還可以調控親本基因的轉錄與表達［7］、作為分子支架募集生物分子［9］。

2 環(huán)狀RNA調控PASMC功能

PASMC是構成肺血管壁的主要細胞之一，在缺氧和（或）遺傳易感性等因素的影響下，出現(xiàn)凋亡抵抗、增殖活躍和鈣化等異常特征［2］，參與PH的病理過程。

2.1 環(huán)狀RNA與PASMC異常增殖 PASMC的異常增殖是肺血管重塑的重要特征之一，而環(huán)狀RNA對PASMC增殖的調控作用是近年來PH研究領域的熱點。在缺氧誘導的PASMC中，環(huán)狀RNA-谷氨酸代謝型受體1（circ-Grm1）的表達量顯著增高，circ-Grm1能夠與PASMC中的肉瘤融合蛋白（fusedinsarcoma， FUS）結合（FUS是一種多功能RBP，在基因轉錄、細胞增殖和凋亡等過程中發(fā)揮作用［10-11］），所形成的復合物降低Grm1的穩(wěn)定性并抑制其表達。Grm1表達降低后，其下游的抑制/激活蛋白-1通路受到抑制，細胞外信號調節(jié)激酶信號通路被激活，通過調控PASMC的增殖和遷移參與PH的發(fā)病機制［12］。人源性（homo sapiens， hsa）-circ-0002062的表達水平在低氧誘導的肺動脈高壓組（HPH）小鼠和低氧誘導的人肺動脈平滑肌細胞（human pulmonary arterial smooth muscle cell，hPASMC）中顯著增高，通過吸附hsa-miR-942-5p調控細胞周期蛋白依賴的蛋白激酶6（cyclin-dependent kinase 6， CDK6）基因表達，而CDK6基因與PASMC的細胞周期和增殖相關。敲低hsa-circ-0002062抑制了PASMC的增殖，過表達hsa-circ-0002062則出現(xiàn)相反結果，證實hsa-circ-0002062促進PASMC的增殖，參與PH的形成［13］。環(huán)狀RNA-沉默信息調節(jié)因子1（circular RNA-Sirtuin1， circ-SIRT1）在HPH大鼠及大鼠低氧PASMC中呈低表達，過表達circ-SIRT1則可上調SIRT1，這一效應抑制了肺血管重塑相關的轉化生長因子-β（TGF-β1）/母親信號蛋白同源物3/母親信號蛋白同源物7通路，從而抑制低氧誘導下大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移，減輕低氧誘導大鼠模型的肺動脈高壓［14］。研究發(fā)現(xiàn)，與不合并PH的慢性阻塞性肺疾病（COPD）病人相比，合并PH的COPD病人肺組織中hsa_circ_0016070水平顯著增高，hsa_circ_0016070通過競爭性結合miR-942上調細胞周期蛋白1（cyclin D1， CCND1）的表達水平，從而促進PASMC的增殖和肺血管重塑［9］。最新研究證明，hsa_circ_0016070在PH病人的血清中也呈高表達，并發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0016070調控miR-942/CCND1軸以外的作用機制。hsa_circ_0016070能夠吸附miR-340-5p上調轉錄因子4（Transcription Factor 4， TCF4）的表達，上調的TCF4與β連環(huán)蛋白形成轉錄復合物，促進Twist相關蛋白1（twist related protein1，TWIST1）基因的轉錄，TWIST1通過促進PASMC的增殖遷移參與肺血管重塑的形成［15］。此外，環(huán)狀RNA-鈣調蛋白4［16］、小鼠源性（mus musculus， mmu）_circ_0000790［17］、circATP2B4［18］和hsa_circWDR37_016［19］等環(huán)狀RNA均被證實能夠促進PASMC的增殖，加速肺血管重構和PH的發(fā)生，而mmu_circ_0001033［20］具有相反的作用，抑制低氧誘導的PASMC增殖?？梢姯h(huán)狀RNA是PASMC增殖、遷移的重要調節(jié)因子，參與肺血管重塑和PH的發(fā)病機制。環(huán)狀RNA在PH患肺組織或血清中表達的特異性以及其對PASMC增殖的調控作用，提示其有望成為PH的診斷標志物及潛在治療靶點。

2.2 環(huán)狀RNA與PASMC焦亡 焦亡是不同于凋亡的一種程序性細胞死亡形式，細胞發(fā)生焦亡時，質膜上迅速形成病理性孔隙，胞內胞外的離子梯度被破壞，細胞最終發(fā)生滲透性腫脹而破裂，釋放促炎的細胞內容物，激活一系列炎癥反應。PASMC焦亡參與了肺血管的重構［21］。circ-Calm4表達水平在HPH小鼠和小鼠低氧PASMC中均上調，上調的circ-Calm4通過海綿吸附作用與miR-124-3p相結合，游離的miR-124-3p減少而引起其下游的程序性細胞死亡蛋白-6水平升高，促進PASMC的焦亡及肺血管重構［22］。這一發(fā)現(xiàn)為PH的發(fā)病機制帶來了新思路，有助于尋找新的診斷標志物和制定新的治療策略來保護PASMC免受焦亡從而抑制PH的發(fā)生發(fā)展。

2.3 環(huán)狀RNA與PASMC鈣化 血管鈣化是磷酸鈣晶體在血管壁發(fā)生異位沉積的病理現(xiàn)象，常見于動脈粥樣硬化、動脈瘤和腦卒中等心腦血管疾?。?3-25］，其本質是血管平滑肌細胞由收縮表型向成骨細胞樣表型的轉化［26］。近年來有研究人員在PH病人的肺組織中發(fā)現(xiàn)肺血管鈣化的證據，且PH患肺分離出的hPASMC存在向成骨細胞樣表型的轉化［27］，證實PASMC的鈣化參與了PH的發(fā)生，但引起PASMC鈣化的分子機制不完全清楚。環(huán)狀RNA-小腦變性相關蛋白1反義轉錄物（circular RNA-antisense to the cerebellar degeneration related protein 1 transcript， circ-CDR1as）在缺氧處理的hPASMC中高表達，下調circ-CDR1as則抑制缺氧誘導的hPASMC鈣化。Circ-CDR1as能夠作為miR-7-5p的分子海綿，下調miR-7-5p的表達水平，而鈣/鈣調素依賴激酶Ⅱδ（calcium/calmodulin-dependent kinaseⅡ-delta， CAMK2D）和調寧蛋白3（calponin 3，CNN3）是miR-7-5p的下游靶基因。CAMK2D和CNN3驅動hPASMC向成骨細胞樣表型轉化而使之發(fā)生鈣化，敲低CNN3和CAMK2D基因減少缺氧誘導的鈣沉積，過表達CNN3和CAMK2D則具有相反效果［28］。circCDR1as/miR-7-5p/CAMK2D、CNNS這一途徑能夠誘導缺氧條件下hPASMC的鈣化，引起肺血管病變，推動PH的發(fā)生發(fā)展。

2.4 環(huán)狀RNA與PASMC鉀通道活性降低 越來越多證據表明，離子通道是血管舒縮、細胞增殖或凋亡的關鍵調控因子。PASMC上鉀離子通道水平的下調會引起肺血管收縮和血管重塑［29］。環(huán)狀RNA對PASMC的鉀離子通道具有調控作用。COPD合并PH病人全血中的hsa_circNFXL1_009水平顯著下調，同樣，在體外實驗中，缺氧顯著降低了hPASMC中hsa_circNFXL1_009的水平。hsa_circ-NFXL1_009表達減少會導致PASMC鉀通道活性降低，該作用通過hsa_miR-29b-2-5p/鉀電壓門控通道亞家族B成員1（KCNB1）途徑得以實現(xiàn)。hsa_circ-NFXL1_009對hsa-miR-29b-2-5p吸附作用的減弱引起下游KCNB1表達的減少，KCNB1表達水平的下調導致PASMC鉀離子通道的活性下降，引起細胞膜持續(xù)去極化和L型電壓門控鈣通道的激活，驅使鈣內流、細胞收縮，并最終導致肺血管持續(xù)收縮和血管重構［30］。

以上研究提示，環(huán)狀RNA在PH中存在差異性表達，通過吸附微RNA或RBP調節(jié)不同的靶基因，導致PASMC的功能異常，最終引起PH，有望在PH的早期診斷和治療中發(fā)揮作用。

3 環(huán)狀RNA調控PAEC功能

PAEC是肺血管功能的主要調節(jié)因子，不同因素的刺激作用會引起PAEC過度增殖并釋放血管內皮生長因子、內皮素-1等血管增殖因子，促進PASMC和成纖維細胞異常增殖，造成細胞外基質過度沉積，誘導肺動脈中膜及外膜增厚，最終導致肺血管重構。因此PAEC功能異常被認為是PH發(fā)生肺血管重構的始動環(huán)節(jié)［1］。環(huán)狀RNA對內皮細胞的調控作用與動脈粥樣硬化、肝細胞癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關［31-32］。在PH中同樣發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA對PAEC的調控作用。與先天性心臟病肺動脈壓正常病人相比，先心病和風濕性心臟病伴肺動脈高壓病人血清中hsa_circ_0029642表達量減少，而hsa_circ_0029642與PAEC增殖調節(jié)相關的基因CRYL1相關，提示hsa_circ_0029642可能通過調控PAEC的增殖參與PH的形成［33］。HPH大鼠中環(huán)狀RNA的N6-甲基腺苷甲基化（N6-methyladenosine，m6A）水平顯著降低，且缺氧條件下培養(yǎng)的PAEC中m6A修飾的circXpo6和circTmtc3顯著低于未經缺氧處理的PASMC，推測m6A修飾的環(huán)狀RNA在缺氧條件下對PAEC的功能有調控作用［34］，具體機制有待進一步探索。此外，血小板源性生長因子誘導的人肺動脈內皮細胞（human pulmonary arterial endothelial cell，hPAEC）中circHIPK3的表達顯著增多，circHIPK3通過海綿吸附作用降低miR-328-3p的表達水平，引起靶基因轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表達升高，進而促進hPAEC的增殖、遷移和血管生成，參與了PH的病理過程［35-37］。環(huán)狀RNA-γ-分泌酶激活蛋白基因（circ-GSAP）在特發(fā)性肺動脈高壓病人肺組織、PH大鼠和缺氧誘導的肺微小動脈內皮細胞（PMEC）中均下調，過表達circ-GSAP能夠抑制PMEC的增殖和遷移［38］。上述研究表明，環(huán)狀RNA能夠促進或抑制PAEC增殖、遷移或促進血管生成，有成為PH新型診斷指標及治療靶標的潛力。

4 環(huán)狀RNA調控免疫細胞功能

免疫炎癥在PH發(fā)生過程中起著重要作用。在損傷、異物等因素的作用下，淋巴細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞等免疫細胞被激活，產生多種炎性介質、細胞因子作用于PASMC和PAEC等細胞，誘導血管重塑并形成PH。環(huán)狀RNA參與PH發(fā)病的機制與免疫細胞也具有相關性。circ_0022342和circ_0002062在慢性血栓栓塞性肺動脈高壓病人中顯著升高，其中circ_0022342可能通過miR-503-5p/溶質載體家族2成員3調控嗜酸性粒細胞的功能，而circ_0002062可能通過miR-92b-3p/人甘露糖苷酶-α2A類成員1信號軸對調節(jié)性T淋巴細胞發(fā)揮調控作用，共同參與PH的形成，有望為PH的免疫調節(jié)治療提供新思路［39］。

5 環(huán)狀RNA調控心肌細胞功能

PH的發(fā)展進程中伴隨不同程度的右心室肥厚（RVH），主要表現(xiàn)為心肌細胞體積增大、重量增加，是右心室對肺動脈壓力增高的一種適應性反應，隨著肺動脈壓的增高，超出心肌代償范圍，右心室肌肥厚將發(fā)展為右心衰竭甚至導致猝死，增加了PH病人的病死率。環(huán)狀RNA可作為診斷PH病人右心室肥厚的潛在生物標志物。與PH（+）RVH（-）組病人相比，PH（+）RVH（-）組病人中環(huán)狀RNA-0068481表達水平顯著增高，miR-646和miR-570表達水平顯著降低。心肌細胞中環(huán)狀RNA-0068481通過吸附miR-646、miR-570或miR-885調控人眼缺失基因（eyes absent 3，EYA3）的表達［40］。EYA是一種和眼球生長有關的基因，既往研究表明EYA能夠促進內皮細胞增殖和血管生成，抑制EYA3的酪氨酸磷酸酶活性可以逆轉肺血管重塑［41］。上述研究提示，環(huán)狀RNA-0068481參與了PH中右心室肥厚的發(fā)生發(fā)展，對PH病人右心室肥厚的診斷有一定預測作用。環(huán)狀RNA對PH的調控作用列于表1。

表1 環(huán)狀RNA對肺動脈高壓的調控作用

6 總結和展望

PH是一種不易被早期發(fā)現(xiàn)的慢性進行性疾病，其發(fā)病率和病死率高，尚缺乏有效的防治措施，在診斷和治療方面任重而道遠。近年來隨著高通量測序技術的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA與PH的發(fā)生發(fā)展具有密切關系。環(huán)狀RNA對PASMC、PAEC等細胞的增殖、凋亡和代謝等功能具有調控作用，參與肺血管重塑和PH的病理過程，為PH的診斷與治療提供了新的線索。截至目前，雖然研究發(fā)現(xiàn)的PH中差異表達的環(huán)狀RNA不在少數，但只有部分環(huán)狀RNA的功能和機制得到深入研究，很多環(huán)狀RNA參與PH發(fā)生發(fā)展的具體機制尚不清楚。此外，大部分研究聚焦于環(huán)狀RNA作為分子海綿吸附微RNA這一功能，關于環(huán)狀RNA作為分子支架募集生物分子、編碼短肽或蛋白質等其他功能的研究較少，且在PH的研究中環(huán)狀RNA調控PASMC功能的研究較多，而對其他相關細胞的調控機制研究偏少。鑒于以上，環(huán)狀RNA在PH中的作用機制需要進一步探索，以期為PH的診治提供新的靶點和分子標志物。