基于非靶向代謝組學(xué)鑒定不同蜜源蜂巢生物活性成分

聶新，楊展，宗曉婕，劉凱龍，姚國(guó)強(qiáng)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，乳酸菌與發(fā)酵乳制品省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

蜂巢營(yíng)養(yǎng)成分豐富且對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害[1-2]，研究發(fā)現(xiàn)蜂巢制品不僅可以改善人體免疫功能[3]，還對(duì)人體內(nèi)的一些病原菌有顯著抑制作用[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，蜂巢對(duì)肝炎表面抗原具有滅活作用[6]，對(duì)某些癌癥也有一定的療效[7]。此外，相關(guān)研究表明蜂巢的提取物有抗炎、抗菌和抗氧化作用[8]，蜂巢的抗氧化作用的主要機(jī)理是由于其含有的抗氧化活性物質(zhì)可以與金屬離子螯合，是天然抗氧化劑[9]，在食品、醫(yī)藥、化妝品等各行業(yè)被廣泛應(yīng)用。

關(guān)于蜂巢樣本中主要成分及含量的測(cè)定，徐歡等[10]采用香草醛-冰醋酸顯色法測(cè)定蜂巢中甾萜類物質(zhì)的含量，結(jié)果表明無(wú)刺蜂蜂巢甾萜類乙醇提取物在體外具有較好的抗氧化活性。李超[11]采用高效液相色譜法對(duì)蜂巢黃酮化合物進(jìn)行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)蜂巢中含有黃酮類、糖類、氨基酸類、有機(jī)酸等化合物。范家佑等[12]提取了露蜂巢的揮發(fā)性物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)最終得到68 種揮發(fā)性物質(zhì)，其主要成分中高級(jí)脂肪酸和酯類含量較少，而烴類化合物含量多，研究中對(duì)其物質(zhì)活性成分功能分析較少。

近幾年對(duì)于蜂巢生物活性物質(zhì)功能的研究十分鮮見(jiàn)，蜂巢生物活性成分沒(méi)有得到充分的研究利用，造成資源的浪費(fèi)。本研究以不同蜜源的蜂巢為研究對(duì)象，采用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，LC-Q-TOF/MS）技術(shù)[13]，探究不同蜜源蜂巢的活性物質(zhì)差異以及特有活性物質(zhì)的功能，以期為蜂巢的綜合利用和進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)提供一定依據(jù)，為后續(xù)研究提供理論與方法的支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 蜂巢來(lái)源

樣品均來(lái)自云南，樣本分組信息如表1 所示。

表1 樣本分組信息Table 1 Sample grouping information

1.1.2 試劑與儀器

乙腈、乙醇、甲醇（均為色譜級(jí)）：德國(guó)默克集團(tuán)；醋酸銨、甲酸銨（均為色譜級(jí)）：上海創(chuàng)賽科技有限公司；甘油、4-（2-羥乙基）-哌嗪-1-乙磺酸（均為色譜級(jí)）：美國(guó)西格瑪奧德里奇公司。

QTOF/MS-65454 質(zhì)譜儀、1290 Infinity LC 超高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；MIX-200 渦旋混合器：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；5427R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司；Milli-Q 水凈化系統(tǒng)制備：法國(guó)莫爾謝姆集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理方法

分別稱取適當(dāng)?shù)臉悠芳尤腚x心管，控制樣品的質(zhì)量在（50.0±0.1）mg，加入預(yù)冷過(guò)的甲醇水（500 μL 70%，含1 mg/L 的2-氯苯丙氨酸）。對(duì)其進(jìn)行勻漿操作（30 s，30 Hz），振蕩充分混勻，靜置冷卻15 min 后進(jìn)行離心（12 000 r/min，10 min，4 ℃），取上清液400 μL 置于樣品管中，沉淀部分加入500 μL 乙酸乙酯/甲醇（體積比1∶3），充分混合均勻后再次離心（12 000 r/min，10 min，4 ℃），取二次離心后的上清液400 μL 與一次離心上清液混合，沉淀部分加入100 μL 70%甲醇水，超聲破碎3 min 后離心（12 000 r/min，3 min，4 ℃），取60 μL 上清液注入玻璃內(nèi)襯管中待用。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱采用Waters BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），色譜分離溫度為35 ℃，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。

正離子模式的流動(dòng)相：含0.1%甲酸的乙腈為A相、含0.1%甲酸的超純水為B 相，按照體積比進(jìn)行梯度洗脫：0～2 min，90%A；2～6 min，70%A；6～7 min，50%A；7～8 min，35%A；8～9 min，30%A；9～10 min，20%A；10～15 min，10%A；15～16 min，90%A。

負(fù)離子模式的流動(dòng)相：0.1%甲酸銨溶液為A 相、乙腈溶液為B 相；按照體積比進(jìn)行梯度洗脫：0～2 min，90%A；2～6 min，70%A；6～10 min，35%A；10～15 min，10%A；15～16 min，90%A。

1.2.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件使用正負(fù)離子兩種模式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，霧化氣體為氮?dú)?。一?jí)質(zhì)荷比掃描范圍為50～1 200，選擇20～40 eV 的能量對(duì)其中的母離子進(jìn)行破碎，對(duì)其碎片的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行采集。正離子模式下鎖定質(zhì)量數(shù)為556.277 1，負(fù)離子模式下鎖定質(zhì)量數(shù)為554.261 5，掃描時(shí)間0.2 s，采集間隔20 s，使用質(zhì)量濃度為2 mg/mL亮氨酸腦啡肽作為校正液進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正。質(zhì)譜條件中流量為10 μL/min；毛細(xì)管電壓為3 kV；錐孔電壓為40 kV；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流速為800 L/h；錐孔氣流量為50 L/h；掃描時(shí)間為0.2 s。1.3 數(shù)據(jù)處理

LC-Q-TOF/MS 技術(shù)獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)MassLynx 4.1 工作站、Progenesis QI 軟件完成預(yù)處理，對(duì)其中的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊以及保留時(shí)間的校正。對(duì)缺失率大于50%的峰進(jìn)行過(guò)濾，然后數(shù)據(jù)對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)。使用EZinf 軟件對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，主要包括主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘（orthogonal projections to latent structures，OPLS）法等，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)合T 檢驗(yàn)和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonalpartialleast squares-discriminantanalysis，OPLS-DA）以及分析的變量對(duì)模型的重要性值（variable importance in the projection，VIP），進(jìn)行差異代謝物的篩選工作，將VIP＞1，且P＜0.05 的代謝物定義為顯著差異代謝物。隨后對(duì)于檢索出來(lái)的差異代謝物進(jìn)行匹配及分析，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析、聚類分析等手段，對(duì)比人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（human metabolome database，HMDB）信息，對(duì)差異代謝物的功能活性進(jìn)行匹配，并最終確定差異代謝物成分和功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂巢活性物質(zhì)探究

2.1.1 質(zhì)控分析

質(zhì)控分析（quality controlled，QC）是處理試驗(yàn)過(guò)程中數(shù)據(jù)重復(fù)性是否良好的檢測(cè)手段[14]，在樣本數(shù)據(jù)上機(jī)之前，需要使用QC 樣本對(duì)儀器進(jìn)行檢測(cè)，并在樣本上機(jī)過(guò)程中，不時(shí)使用QC 樣本進(jìn)行標(biāo)定，避免數(shù)據(jù)的漂移，保證樣本數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。通過(guò)總離子流圖（total ion chromatogram，TIC），對(duì)其進(jìn)行分析，可以得知儀器的準(zhǔn)確性和可靠性是否良好。正、負(fù)離子兩種模式下的TIC 重疊圖如圖1 所示。

圖1 正、負(fù)離子兩種模式下的TIC 重疊圖Fig.1 TIC overlay picture in cation and anion conditions

由圖1 可知，正負(fù)離子模式下QC 樣本都能較好地聚集在一起，重疊程度越高，表明本研究的質(zhì)譜分析儀器運(yùn)行情況越優(yōu)良，穩(wěn)定性越好。

2.1.2 蜂巢活性物質(zhì)分析

兩種蜂巢共檢索出26 235 個(gè)物質(zhì)，以物質(zhì)峰強(qiáng)度，P＜0.01、兩組數(shù)據(jù)之間的差異倍數(shù)≤0.5 或≥2 和VIP＞1 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[15]，HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中所篩選出克巢活性物質(zhì)情況如表2 所示。

表2 克巢中的活性物質(zhì)Table 2 Active substances in gram nests

由表2 可知，克巢中篩選出22 個(gè)與人體密切相關(guān)的化合物，代謝物分別歸類到氨基酸及其衍生物（6個(gè)）、糖類（3 個(gè)）、生物堿（1 個(gè)）、黃酮類化合物（5 個(gè)）、吲哚及其衍生物（2 個(gè)）、有機(jī)酸及其衍生物（2 個(gè)）、酚酸類物質(zhì)（3 個(gè)）共7 個(gè)分類。

以物質(zhì)峰強(qiáng)度，P＜0.01、0.5≤兩組數(shù)據(jù)之間的差異倍數(shù)≥2 和VIP＞1 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中所篩選出崖黑巢活性物質(zhì)情況如表3 所示。

表3 崖黑巢中的活性物質(zhì)Table 3 Active substances in the cliff black nest

由表3 可知，崖黑巢中篩選出23 個(gè)與人體密切相關(guān)的化合物，代謝物分別歸類到氨基酸及其衍生物（7個(gè)）、糖類（1 個(gè)）、生物堿（2 個(gè)）、黃酮類化合物（2 個(gè)）、吲哚及其衍生物（2 個(gè)）、輔酶和維生素類（4 個(gè)）、有機(jī)酸及其衍生物（4 個(gè)）、酚酸類物質(zhì)（1 個(gè)）共8 個(gè)分類。

克巢中黃酮類主要有4＇，6，7-三羥基異黃酮具有抗氧化性和抗癌活性[16]；甘草素具有抗癌、抗炎和治療神經(jīng)疾病活性[17]；山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷具有抗肥胖活性；槲皮萬(wàn)壽菊素-3，6-二甲醚具有抗炎活性[18]；黃豆黃素可以影響細(xì)胞凋亡和抗氧化活性。酚酸類物質(zhì)主要有D（-）-水楊苷，具有抗癌抗炎活性[19]；4-羥基肉桂酸，具有抗腫瘤和抗誘變活性[20]；4-甲基兒茶酚具有抗氧化活性。

崖黒巢中黃酮類化合物主要有3，7-二-O-甲基槲皮素可增加血管舒張的活性功能；水仙苷具有抗氧化活性。酚酸類物質(zhì)中含有的水楊酸具有抗炎活性和治療免疫疾病活性[21]。有機(jī)酸及其衍生物主要有葉酸、衣康酸、丁二酸、3-甲基己二酸，是人體在利用糖分和氨基酸時(shí)的必要物質(zhì)，是機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)。生物堿主要有5-羥基色醇、哈爾酚。輔酶和維生素類：煙酰胺可調(diào)節(jié)食欲、睡眠、情緒[22]；泛酸可抑制惡性瘧原蟲泛酸激酶活性并抑制瘧原蟲的增殖；D-生物素、維生素B1可促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)和增加食欲[23]。

2.2 差異代謝物分析

2.2.1 主成分分析

PCA 是一種常用的無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別方法，反映了樣本代謝物的相似程度，即在樣品分組情況未明的前提下對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，直接反映不同化學(xué)級(jí)別之間的差異，并找出異常值的分析方法[24]，樣本之間重合距離越小，表示差異越小，反之差異越大[25]，通過(guò)對(duì)得到的PCA 模型圖進(jìn)行分析，從而得到不同蜜源的蜂巢中各類代謝物的簡(jiǎn)單分組分布情況。本研究PCA 得分情況如圖2 所示。

圖2 正、負(fù)離子模式下的主成分分析Fig.2 Principal component analysis in cation and anion conditions

由圖2 可知，圖中所有點(diǎn)均分布于95%置信區(qū)間內(nèi)，根據(jù)PCA 圖可知，組內(nèi)差異不明顯，組間差異明顯。表明樣品組內(nèi)代謝物差異小，組間代謝物差異明顯[26]。此外PC1 為39.27%，PC2 為14.85%。結(jié)果表明該P(yáng)CA 模型穩(wěn)定可靠，可用于后續(xù)分析。

2.2.2 OPLS-DA 分析

OPLS-DA 是一種有監(jiān)督模式識(shí)別方法，可以去除部分無(wú)關(guān)信息，保證模型的預(yù)測(cè)能力在保持不下降的前提之下，有效地減少模型的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，放大各組之間的差異性[27]。通過(guò)使用有監(jiān)督的OPLS-DA 分析，結(jié)合VIP 值，可以對(duì)代謝物進(jìn)行篩選，控制適當(dāng)?shù)囊蛩貤l件，檢索不同蜂巢樣品當(dāng)中的差異代謝物。本研究的OPLS-DA 分析情況如圖3 所示。

圖3 OPLS-DA 得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot of different honey combs

由圖3a 可知，草藥和米團(tuán)花蜜源崖黑巢和百花蜜源崖黑巢樣品OPLS-DA 模型中共有兩個(gè)主成分，第一個(gè)主成分的貢獻(xiàn)值為52.2%，第二個(gè)主成分的貢獻(xiàn)值為11.4%；由圖3b 可知，草藥和米團(tuán)花蜜源克巢和百花蜜源克巢樣品OPLS-DA 模型中共有兩個(gè)主成分，第一個(gè)主成分的貢獻(xiàn)值為37.6%，第二個(gè)主成分的貢獻(xiàn)值為29%，各組樣品之間區(qū)分效果非常明顯，所建立的模型當(dāng)中的Q2＞0.9，表明該模型數(shù)據(jù)穩(wěn)定性和可靠性良好[28]。

2.2.3 不同蜜源蜂巢的差異代謝物

經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制步驟后，草藥和米團(tuán)花蜜源崖黑巢、百花蜜源崖黑巢、草藥和米團(tuán)花蜜源克巢、百花蜜源克巢的差異代謝物情況如圖4 所示。

圖4 正負(fù)離子模式下分組韋恩圖Fig.4 Venn in cation and anion conditions

由圖4 可知，數(shù)據(jù)集中分別保留了1 790、1 779、1 865、1 867 種差異代謝物，4 組樣品共有1 268 種共有差異代謝物。兩組崖黑巢有1 658 種共有差異代謝物，兩組克巢有1 456 種共有差異代謝物，兩組以草藥和米團(tuán)花為蜜源的蜂巢有1 433 種共有差異代謝物，兩組百花蜜源蜂巢有1 673 種共有差異代謝物。

用T 檢驗(yàn)和變異倍數(shù)可以對(duì)代謝物進(jìn)行篩選。以P＜0.05，兩組數(shù)據(jù)之間的差異倍數(shù)≥2 或兩組數(shù)據(jù)之間的差異倍數(shù)≤0.5 為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行差異代謝產(chǎn)物篩選工序，將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，繪制火山圖，結(jié)果如圖5所示。

圖5 正、負(fù)離子合并差異代謝物火山圖Fig.5 Volcano map of differential metabolites in cation and anion conditions

由圖5A 可知，不同蜜源崖黒巢共檢索到的蜂巢差異代謝物總數(shù)為1 239 種，其中上調(diào)代謝物為327種，下調(diào)代謝物為125 種。由圖5B 可知，不同蜜源克巢共檢索到的蜂巢差異代謝物總數(shù)為1 456 種，其中上調(diào)代謝物為153 種，下調(diào)代謝物為139 種。由圖5C可知，兩組草藥和米團(tuán)花蜜源樣品共檢索到的蜂巢差異代謝物總數(shù)為1 433 種，其中上調(diào)代謝物為672 種，下調(diào)代謝物為724 種。由圖5D 可知，兩組百花蜜源共檢索到的蜂巢差異代謝物總數(shù)為1 673 種，其中上調(diào)代謝物為672 種，下調(diào)代謝物為724 種。

對(duì)不同蜜源蜂巢的差異代謝物進(jìn)行聚類分析，每行各代表一種差異代謝物，列代表一個(gè)蜂巢樣本。結(jié)果如圖6 所示。

由圖6 可知，不同研究組中平行樣本都聚在同一簇內(nèi)，表明聚類結(jié)果可信度較高，聚類熱圖分析的結(jié)果可靠[29]。共鑒定出75 種具有顯著差異的代謝物，崖黑巢中有39 種成分相對(duì)含量高于克巢，36 種成分相對(duì)含量低于克巢。

崖黑巢中兩種不同蜜源的代謝物如表4 所示。

表4 兩種蜜源崖黑巢差異代謝物鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of differential metabolites in the black nest of two nectar cliffs

由表4 可知，兩種蜜源崖黑巢差異代謝物鑒定結(jié)果為顯著上調(diào)差異代謝物有阿魏酸、煙酰胺、次黃嘌呤、紫杉醇、氨磺丁脲、松柏醇、3-（甲硫基）丙酸、2＇-甲氧基腺苷（8 個(gè)），即以百花為蜜源的崖黒巢中上述化合物的含量顯著高于以草藥和米團(tuán)花為蜜源的崖黒巢。下調(diào)物質(zhì)有2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3，7-二-O-甲基槲皮（2 個(gè)）。即以草藥和米團(tuán)花為蜜源的崖黒巢中上述化合物的含量顯著高于以百花為蜜源的崖黒巢。

克巢不同蜜源的差異代謝物如表5 所示。

表5 兩種蜜源克巢差異代謝物鑒定結(jié)果Table 5 Identification results of differential metabolites between two nectar sources of gram nest

由表5 可知，兩種蜜源克巢差異代謝物鑒定結(jié)果為顯著上調(diào)差異代謝物有槲皮素、4＇，6，7-三羥基異黃酮、穗花杉雙黃酮、奧昔嘌醇、4＇-O-甲基-d3 槲皮素、羥基芫花素、桑色素（7 個(gè)），即以百花為蜜源的克巢中上述化合物的含量顯著高于以草藥和米團(tuán)花為蜜源的克巢。下調(diào)物質(zhì)有假荊芥屬苷、萘啶酮酸（2 個(gè)）。即以草藥和米團(tuán)花為蜜源的克巢中上述化合物的含量顯著高于以百花為蜜源的克巢?？梢钥闯鲈谘潞诔埠涂顺仓?，以草藥和米團(tuán)花為蜜源的樣本比以百花為蜜源的樣本中對(duì)人體有益的活性物質(zhì)更豐富。

3 結(jié)論

近年來(lái)，蜂巢因其具有對(duì)人體有益的生物活性和廣泛的入藥案例而備受關(guān)注。本試驗(yàn)使用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)可以有效地區(qū)分不同蜜源崖黑巢和克巢，不僅表現(xiàn)出了蜂巢的化學(xué)多樣性，還豐富了蜂巢溯源識(shí)別的標(biāo)志化合物群，其中黃酮與酚酸類化合物不僅是蜂巢中的活性組分群，還可作為蜂巢蜜源判別的差異標(biāo)志物。本試驗(yàn)可以初步鑒定蜂巢中存在的對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，還可以為不同蜜源的蜂巢的質(zhì)量評(píng)價(jià)建立有效方法，為蜂巢的品質(zhì)分析與規(guī)范蜂產(chǎn)品市場(chǎng)作參考。