超高效液相色譜-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜聯(lián)用快速篩查測定魚蝦貝中79 種藥物殘留

姜萌藝，湯志旭，羅忻，趙元暉，王雷，付曉婷，許加超，高昕*

（1.中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東 青島 266109）

近年來，隨著大食物觀提出，魚蝦類水產(chǎn)品愈發(fā)受到消費(fèi)者的青睞。2021 年我國養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)到5 394.41 萬t，約占水產(chǎn)品總產(chǎn)量的81%[1]。獸藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮著防治疾病、促進(jìn)生長、提高品質(zhì)等重要作用[2]。由于獸藥本身對生物和自然環(huán)境的危害以及其沿食物鏈在生物體內(nèi)積聚的特性[3-4]，許多國家和地區(qū)都對水產(chǎn)品中獸藥使用及最大殘留限量進(jìn)行了規(guī)定[5-6]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250 號公告中明確規(guī)定了21 類禁用獸藥，GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》[7]中規(guī)定了食品中104 種獸藥的最大殘留限量，其中有22 種藥物規(guī)定了在魚類中的限量值。歐盟、美國、日本也分別在相關(guān)法規(guī)中規(guī)定了121、87、651 種獸藥在水產(chǎn)品中的最大殘留限量[8-9]。

2023 年1 月1 日新實(shí)行的《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》第十三條規(guī)定：國家建立農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測制度，國務(wù)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村主管部門應(yīng)當(dāng)制定國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測計(jì)劃。目前我國水產(chǎn)品中獸藥殘留檢測方法相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10-11]，主要針對河豚魚、鰻魚和烤鰻等水生產(chǎn)品及其相應(yīng)的加工品種中的單個(gè)藥殘品類，缺少包含多種類水產(chǎn)品及其水產(chǎn)加工品的檢測方法，且這些方法大部分是基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，其檢測的獸藥化合物種類少且單一[12-14]，亟需建立能夠針對多種類水產(chǎn)品中多種獸藥殘留同時(shí)檢測的簡單、高效、靈敏度高的方法[15-17]?；诖?，本研究利用超高效液相色譜-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜技術(shù)[high performance liquid chromatography-high resolution orbitrap mass spectrometry，UPLC-HRMS（Orbitrap）]，在對比正負(fù)離子模式下各獸藥化合物響應(yīng)強(qiáng)度的基礎(chǔ)上構(gòu)建高分辨質(zhì)譜信息庫，并采用多種有機(jī)溶劑提取和固相萃取凈化的前處理方法，建立能夠?qū)︳~蝦貝類水產(chǎn)品中的11 類79 種獸藥殘留的同時(shí)快速篩查檢測方法，以期為水產(chǎn)品中多種獸藥殘留檢測提供有力的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜級）：德國Merck 公司；甲酸、乙酸（質(zhì)譜級）：美國Sigma-Aldrich 公司；甲酸銨、乙酸銨（色譜級）：美國Mallinckrodt Baker 公司；乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na，分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Oasis HLB 固相萃取柱（3cc/60 mg）、Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）：美國Waters 公司；MEGA BE-C18固相萃取柱（1 GM/6 mL）：美國Agilent 公司；0.22 μm 針式濾膜過濾頭：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

79 種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%）、長尾鱈（Macrouroidei）、南美白對蝦（Litopenaeus Vannamei）、櫛孔扇貝（Azumapecten farreri）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex UltiMate 3000 UHPLC+超高壓液相色譜儀、Q Exactive Focus 質(zhì)譜儀：美國Thermo Scientific 公司；Milli-Q 超純水儀：美國Millipore 公司；CR21G 高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI 公司；MS3 Basic 旋渦振蕩器：德國IKA 公司；MMV-1000W 垂直振蕩器：日本EYELA 公司；PL303 電子天平：瑞士Mettler Toledo 公司；TurboVap LV 氮吹儀：美國Caliper 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

分別準(zhǔn)確稱取11 類79 種獸藥化合物25.0 mg于25 mL 容量瓶內(nèi)制成濃度為1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再按11 種類別用甲醇配制成濃度為10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液，于-20 ℃避光條件下保存。β-內(nèi)酰胺類化合物的穩(wěn)定性較差，需要單獨(dú)配制避光保存；配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液時(shí)β-內(nèi)酰胺類使用純凈水定容，磺胺及甲氧芐啶類、三苯甲烷染料類使用乙腈定容，其余化合物使用甲醇定容。試驗(yàn)時(shí)，將上述混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液使用甲醇配制成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；流動相A 為2 mmol/L 甲酸銨（含0.01%甲酸水溶液），B 為甲醇。洗脫程序：0～0.5 min，5% B；0.5～12.0 min，5%～95%B；12.0～16.0 min，95%B；16.1～20.0 min，5%～95%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為加熱電噴霧離子源（heat electron spray ionization，HESI），毛細(xì)管溫度為320 ℃，噴霧電壓分別為3.5 kV（正離子模式）和2.9 kV（負(fù)離子模式）；透鏡電壓為50 V；鞘氣流速為2.758×105Pa；輔助氣溫度為300 ℃。對正負(fù)離子同時(shí)進(jìn)行采集，數(shù)據(jù)采集模式采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級掃描模式（full mass-data dependent scans，F(xiàn)ull MS-dd MS2）方式，根據(jù)目標(biāo)化合物的質(zhì)量范圍（m/z），將掃描范圍設(shè)置為140.0～1 000.0；一級質(zhì)譜分辨率[以50%峰寬計(jì)算，即測定一個(gè)峰半峰高處的全峰寬（full width half maximum，F(xiàn)WHN）]為70 000 FWHN，自動增益控制目標(biāo)離子數(shù)（automatic gain control target，AGC target） 為1×106，C-trap 最大注入時(shí)間為100 ms；二級質(zhì)譜分辨率為17 500 FWHM，dd-MS2AGC target 為2×105，C-trap 最大注入時(shí)間為50 ms；歸一化碰撞能（normalized collision energy，NCE）為20%、40%、60%；動態(tài)排除時(shí)間為60 s。

1.5 樣品制備及前處理

取待檢測的長尾鱈、南美白對蝦、櫛孔扇貝樣品，其中長尾鱈樣品去骨，南美白對蝦樣品去頭，櫛孔扇貝樣品開殼，分別取可食用部分切塊絞碎混合均勻后，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取5.0 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL 聚丙烯離心管中，靜置，向其中加入10 mmol/L EDTA-2Na 溶液0.5 mL 后，再加入混合提取溶液[乙腈∶甲醇∶水（3∶1∶1，體積比，含1%乙酸）]25 mL，均質(zhì)提取5 min，在4 °C下12 000 r/min 離心15 min，取5 mL 上清液，于40 ℃條件下氮?dú)獯蹈桑状级ㄈ葜?.0 mL。將提取液負(fù)載至Oasis HLB 固相萃取柱（使用前用1 mL 水、1 mL 甲醇預(yù)處理）上，保持1 滴/s 的流速，依次用1 mL 水洗滌，1 mL 甲醇洗脫，收集全部流出液，40 °C 氮?dú)獯蹈桑眉状级ㄈ葜?.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm 微孔濾膜后上機(jī)測試。

優(yōu)化試驗(yàn)以長尾鱈為基質(zhì)，采用空白添加的試驗(yàn)方法，以回收率作為評判指標(biāo)，向提取溶液中添加定量金屬絡(luò)合劑（10 mmol/L EDTA-2Na 溶液）后，對乙腈、乙腈∶水（4∶1，體積比）、乙腈（含1%乙酸）、乙腈∶水（4∶1，體積比，含1%乙酸）、乙腈∶甲醇∶水（3∶1∶1，體積比）、乙腈∶甲醇∶水（3∶1∶1，體積比，含1%乙酸）6 種混合提取溶液的提取效果進(jìn)行比較，同時(shí)對C18固相萃取柱和Oasis HLB 固相萃取柱的凈化效果進(jìn)行對比。

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

利用空白樣品加標(biāo)試驗(yàn)，對方法選擇性、線性、基質(zhì)效應(yīng)（matrix effects，ME）、回收率、精密度、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）等參數(shù)進(jìn)行測定評價(jià)。其中，允許使用獸藥的最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）和禁用獸藥分析方法的最低要求執(zhí)行限量（minimum required performance limit，MRPL）數(shù)據(jù)來源于GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》[8]、歐盟委員會法規(guī)、國際藥典、美國聯(lián)邦法案、日本《食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留肯定列表制度》（簡稱《肯定列表》）[9-12]中的相關(guān)規(guī)定。對于目標(biāo)獸藥化合物中沒有在法規(guī)中對水產(chǎn)品中殘留量進(jìn)行限定的物質(zhì)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，將其MRL 值默認(rèn)為10 μg/kg。

1.6.1 化合物定性

依據(jù)保留時(shí)間（retention time，RT）以及母離子和子離子精確質(zhì)荷比對目標(biāo)獸藥化合物進(jìn)行定性分析。

1.6.2 線性和基質(zhì)效應(yīng)

配制濃度為1 000 μg/kg 的目標(biāo)獸藥化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋。選擇0、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/kg 10 個(gè)不同的添加濃度，在最適儀器條件下，進(jìn)行UPLC-HRMS 上機(jī)試驗(yàn)。繪制目標(biāo)化合物溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。同時(shí)通過比較目標(biāo)化合物的溶劑和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，對其基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價(jià)，計(jì)算公式如下。

X=（Sa-Sb）/Sb×100

式中：X 為基質(zhì)效應(yīng)，%；Sa為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；Sb為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.6.3 檢出限和定量限

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線匹配法和逐級稀釋法向空白樣品中添加已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0、10.0 μg/kg 8 個(gè)添加濃度水平。在最適儀器條件下，進(jìn)行UPLC-HRMS（Orbitrap）上機(jī)試驗(yàn)，以3 倍和10 倍信噪比（signal/noise，S/N）分別計(jì)算方法的LOD 和LOQ。

1.6.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

向長尾鱈、南美白對蝦、櫛孔扇貝水產(chǎn)樣品中分別添加由79 種獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)國內(nèi)外法規(guī)相關(guān)規(guī)定及計(jì)算所得LOQ，確定79種目標(biāo)獸藥化合物添加濃度（氯霉素類為0.3 μg/kg，三苯甲烷染料類、非甾體雌激素類為2 μg/kg，喹諾酮類、磺胺及甲氧芐啶類為5 μg/kg，其余化合物為10 μg/kg）。在1 倍、2 倍和10 倍3 種添加濃度條件下各重復(fù)測定6 次，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本試驗(yàn)的獸藥化合物種類多，為便于統(tǒng)計(jì)依據(jù)物質(zhì)結(jié)構(gòu)將79 種獸藥分為11 大類，即苯并咪唑類（6 種）、β-內(nèi)酰胺類（11 種）、糖皮質(zhì)激素類（8 種）、林可酰胺類（2 種）、大環(huán)內(nèi)酯類（3 種），喹諾酮類（18 種）、磺胺及甲氧芐啶類（21 種）、四環(huán)素類（4 種）、三苯甲烷染料類（2種）、酰胺醇類（3 種）和非甾體雌激素類（1 種）。

首先確定79 種目標(biāo)獸藥化合物相應(yīng)的中英文名稱、分子式等基本信息，根據(jù)得到的分子式對其理論分子質(zhì)量做初步推斷。利用自動進(jìn)樣器將各個(gè)目標(biāo)獸藥化合物分別直接注入高分辨質(zhì)譜，采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2）模式，對目標(biāo)獸藥化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜檢測，得到一級全掃描質(zhì)譜圖。依據(jù)一級質(zhì)譜圖確定各個(gè)目標(biāo)化合物的母離子精確質(zhì)量數(shù)，將實(shí)際測得的母離子精確質(zhì)量數(shù)與理論值進(jìn)行對比后，確定目標(biāo)化合物的最優(yōu)母離子加合形式。目標(biāo)化合物在不同歸一化碰撞能量條件下采集得到二級質(zhì)譜圖，從各個(gè)目標(biāo)化合物的二級質(zhì)譜圖中選擇響應(yīng)值較高的3～5 個(gè)碎片離子，并記錄下其相應(yīng)的實(shí)測子離子質(zhì)荷比。利用Xcalibur 4.0 軟件對得到的碎片離子的元素組成進(jìn)行擬合（在誤差為5×10-6的條件下，確定每個(gè)碎片離子最小偏差時(shí)的元素組成），根據(jù)不同元素組成中的同位素質(zhì)荷比和元素組成相對豐度，計(jì)算出子離子理論精確質(zhì)量。建立滿足試驗(yàn)要求的79 種目標(biāo)化合物的高分辨質(zhì)譜庫，部分代表目標(biāo)獸藥化合物的試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。

表1 11 類獸藥代表目標(biāo)化合物基本信息及各項(xiàng)UHPLC-HRMS 參數(shù)信息Table 1 Basic information and UHPLC-HRMS parameters on representative target compounds of 11 categories of veterinary drugs

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動相的優(yōu)化

流動相可能會影響目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和峰形，并對定量分析結(jié)果造成影響[18]。不同流動相對代表化合物響應(yīng)強(qiáng)度的影響如圖1 所示。

圖1 代表化合物在不同流動相條件下的響應(yīng)強(qiáng)度Fig.1 Response intensity of representative compounds under different mobile phase conditions

由圖1 可知，在正離子模式下，0.1%甲酸水溶液作為流動相，可有效促進(jìn)化合物的離子化。但在負(fù)離子模式下，甲酸的加入不利于去質(zhì)子化作用和化合物的電離，對己烷雌酚的抑制作用十分明顯。為了在一次上機(jī)試驗(yàn)內(nèi)對正負(fù)離子模式同時(shí)進(jìn)行檢測以得到優(yōu)良的試驗(yàn)結(jié)果，向流動相內(nèi)添加一定量的甲酸銨，減少甲酸的添加量。當(dāng)水相為2 mmol/L 甲酸銨（含0.01%甲酸）水溶液時(shí)，可保證所有化合物均具有較好的峰形和響應(yīng)強(qiáng)度。對于絕大多數(shù)目標(biāo)化合物而言，有機(jī)相為甲醇時(shí)的響應(yīng)強(qiáng)度略高于有機(jī)相為乙腈時(shí)的響應(yīng)強(qiáng)度。從試驗(yàn)結(jié)果和節(jié)約成本等角度綜合考慮，最終確定流動相為2 mmol/L 甲酸銨（含0.01%甲酸水溶液）-甲醇。

2.2.2 色譜柱的選擇、進(jìn)樣量及洗脫梯度的確定

對于獸藥化合物，反相色譜柱具有較好的分離效果，經(jīng)查閱資料后和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[17-18]，Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）是一類對絕大多數(shù)獸藥化合物都具有良好的分離效果且能夠得到清晰尖銳色譜峰形，適用于大多數(shù)獸藥檢測的反向色譜柱。因此本研究確定Acquity UPLC BEH C18色譜柱為試驗(yàn)色譜柱。

反相色譜柱極性化合物優(yōu)先流出，增加有機(jī)相在流動相中所占的比例，能夠促進(jìn)弱極性化合物的流出。當(dāng)有機(jī)相的占比逐步提高到一定濃度后，保持該占比同時(shí)穩(wěn)定一段時(shí)間，可將檢測過程中樣品內(nèi)存在的非極性雜質(zhì)送出，對色譜柱起到清潔和保護(hù)作用[19]。目標(biāo)獸藥化合物的分離試驗(yàn)結(jié)果如圖2 和圖3 所示。

圖2 獸藥化合物目標(biāo)物的分離結(jié)果（正離子模式）Fig.2 Results of the separation of target compounds of veterinary drugs（positive ion mode）

圖3 獸藥化合物目標(biāo)物的分離結(jié)果（負(fù)離子模式）Fig.3 Results of the separation of target compounds of veterinary drugs（negative ion mode）

根據(jù)圖2 和圖3 的試驗(yàn)結(jié)果，對目標(biāo)獸藥化合物的洗脫分離情況進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，所有目標(biāo)物分布在3.29 min（磺胺嘧啶）到10.68 min（芬苯達(dá)唑）之間，在整個(gè)洗脫20 min 內(nèi)整體分離情況較為理想。

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 樣品提取條件優(yōu)化

水產(chǎn)品是一類基質(zhì)復(fù)雜的動物源食品，前處理是建立多獸藥同時(shí)檢測分析方法中十分關(guān)鍵的一步。對目標(biāo)樣品進(jìn)行前處理時(shí)，提取溶劑的選擇對試驗(yàn)結(jié)果有著重要影響[20-22]。甲醇和乙腈是常用的提取溶劑。由于乙腈具有分散基質(zhì)、沉淀蛋白、脂質(zhì)在其中的溶解性較差等性能，可以降低蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等對檢測造成的影響，適用于水產(chǎn)品基質(zhì)，考慮以乙腈作為初始提取溶劑，并對其進(jìn)行優(yōu)化[23-24]。水有助于提升樣品中極性化合物的提取效率，乙酸有助于調(diào)節(jié)提取溶劑的pH值和對樣品進(jìn)行酸解。同時(shí)，由于目標(biāo)獸藥化合物中的四環(huán)素類藥物易與溶液中的金屬離子發(fā)生絡(luò)合，需向提取液中加入一定量的金屬絡(luò)合劑。查閱資料后發(fā)現(xiàn)[17-18]，可通過向提取溶液中加入一定比例的甲醇，來提高林可酰胺類和四環(huán)素類的提取效率。本研究根據(jù)不同有機(jī)溶液的添加比例確定了6 種不同的提取溶劑，并以回收率為指標(biāo)，對這6 種提取溶液進(jìn)行評價(jià)。在使用不同提取溶液的條件下，代表獸藥化合物回收率的試驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。

圖4 代表化合物在不同提取溶劑檢出回收率Fig.4 Recoveries of representative compounds detected by different extraction solvents

對圖4 中目標(biāo)化合物的回收率分析比較后發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用乙腈作為提取溶劑，對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、磺胺類、三苯甲烷染料類、四環(huán)素類等絕大多數(shù)目標(biāo)獸藥化合物的提取效果較差，目標(biāo)獸藥化合物回收率較低，有超過73%獸藥化合物的回收率小于50%。而當(dāng)向乙腈中添加一定量的水后，用乙腈∶水（4∶1，體積比）作為提取溶劑時(shí)，β-內(nèi)酰胺類、糖皮質(zhì)激素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類等化合物的回收率有明顯的提升，有超過87%化合物的回收率介于50%～120%，該提取溶劑對大多數(shù)目標(biāo)獸藥化合物具有較好的提取效果。一定量乙酸的加入提高了喹諾酮類化合物回收率的同時(shí)對磺胺類化合物的回收率有一定的負(fù)面影響，不過磺胺類化合物的回收率也能保證在70%左右；EDTA-2Na 溶液的加入有助于提高四環(huán)素類化合物的提取效率；而甲醇的加入則有助于提高林可酰胺類化合物和磺胺類化合物的提取效率。當(dāng)使用乙腈∶水（4∶1，體積比）作為提取溶劑時(shí)，存在于70%～120%這個(gè)區(qū)間內(nèi)的化合物數(shù)目更多；當(dāng)使用乙腈∶甲醇∶水（3∶1∶1，體積比）作為提取溶劑時(shí)，磺胺類等化合物具有更高的回收率；而當(dāng)使用乙腈∶甲醇∶水（3∶1∶1，體積比，含1%乙酸）作為提取溶劑時(shí)，可以保證包括喹諾酮類、四環(huán)素類等化合物具有更高的回收率。因此綜合考慮之后，本研究最終確定乙腈∶甲醇∶水（3∶1∶1，體積比，內(nèi)含1%乙酸）和10 mmol/L EDTA-2Na 溶液作為最終的提取溶劑。

2.3.2 凈化條件優(yōu)化

固相萃取法（solid phase extraction，SPE）[25-26]是將傳統(tǒng)的液固萃取法和現(xiàn)代新興液相色譜技術(shù)相融合而發(fā)展出來的前處理方式，也是經(jīng)常被應(yīng)用于獸藥前處理的方法之一。C18固相萃取柱和Oasis HLB 固相萃取柱是常見的固相萃取柱，其中C18固相萃取柱的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，可有效除去脂類、糖類等親脂性雜質(zhì)；Oasis HLB 固相萃取柱的填料為親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，同時(shí)具有親水性和疏水性基團(tuán)，擴(kuò)展了適用的pH 值范圍和化合物的極性范圍，對弱極性和許多中、強(qiáng)極性的化合物都具有很好的萃取效果[27-29]。兩種固相萃取柱針對部分代表化合物的凈化效果如圖5 所示。

圖5 不同凈化方法條件下代表化合物回收率Fig.5 Recoveries of representative compounds by different purification methods

從圖5 中可以看出，經(jīng)Oasis HLB 固相萃取柱凈化后，目標(biāo)獸藥化合物回收率較高且較多化合物的回收率集中在70%～120%，顯示出更好的凈化效果和回收率。因此，選擇Oasis HLB 固相萃取柱作為本試驗(yàn)前處理的凈化材料。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

當(dāng)保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)和響應(yīng)值最強(qiáng)的定性子離子精確質(zhì)量數(shù)在誤差范圍內(nèi)符合相應(yīng)條件時(shí)，就可以確認(rèn)該樣品為陽性檢出樣品。各目標(biāo)物的定性參數(shù)見表1。對于目標(biāo)物中存在的同分異構(gòu)體，可以通過對不同的碎片離子質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、色譜峰等逐一進(jìn)行比較，對各個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行區(qū)分。此外，在試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)各個(gè)目標(biāo)物的色譜峰附近未有任何相關(guān)的基質(zhì)干擾峰的出現(xiàn)，該儀器方法對于目標(biāo)獸藥化合物的分析檢測具有較高的準(zhǔn)確性。

2.4.1 線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng)

依據(jù)UPLC-HRMS 試驗(yàn)結(jié)果和對所有目標(biāo)獸藥化合物在0.5～200.0 μg/kg 范圍內(nèi)繪制的目標(biāo)化合物溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線以及相應(yīng)的線性回歸方程分析可以發(fā)現(xiàn)，所有目標(biāo)化合物在0.5～200.0 μg/kg 內(nèi)的溶劑標(biāo)準(zhǔn)中具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。

水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，在使用HESI 作為離子源的時(shí)候，當(dāng)基質(zhì)物質(zhì)與目標(biāo)物共存在于溶劑中且同時(shí)流出時(shí)，溶劑中所含有的復(fù)雜物質(zhì)會共同在離子源區(qū)域發(fā)生離子化，當(dāng)基質(zhì)因子在-20%～20%之間時(shí)認(rèn)為無明顯基質(zhì)效應(yīng)的干擾，小于-20%表明基質(zhì)抑制，大于20%表明基質(zhì)增強(qiáng)。研究采用向長尾鱈、南美白對蝦、櫛孔扇貝水產(chǎn)樣品提取液中加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過比較溶劑線性曲線和基質(zhì)線性曲線，可以發(fā)現(xiàn)金霉素、強(qiáng)力霉素、土霉素3 種四環(huán)素類化合物在3 種基質(zhì)內(nèi)表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其他各類化合物在3 種基質(zhì)中均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)或不表現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)。

2.4.2 檢出限和定量限

根據(jù)儀器在最適條件下，對含有目標(biāo)獸藥化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液試驗(yàn)測定所得的3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算，可確定該方法中各個(gè)目標(biāo)獸藥化合物的檢出限和定量限。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水產(chǎn)樣品中79 種目標(biāo)獸藥化合的方法檢出限范圍為0.2～5.0 μg/kg，方法定量限范圍為0.5～10.0 μg/kg。

2.4.3 方法準(zhǔn)確度和精密度

對比長尾鱈、南美白對蝦、櫛孔扇貝3 種樣品在1倍、2 倍和10 倍3 種添加濃度條件下的回收率，代表獸藥化合物回收率的試驗(yàn)結(jié)果如圖6～圖8 所示。

圖6 在1 倍添加濃度條件下長尾鱈、南美白對蝦、櫛孔扇貝中代表化合物的回收率Fig.6 Recoveries of the representative compounds in Macrouroidei，Litopenaeus Vannamei，and Azumapecten farreri under the condition of once MRL

圖7 在2 倍添加濃度條件下長尾鱈、南美白對蝦、櫛孔扇貝中代表化合物的回收率Fig.7 Recoveries of the representative compounds in Macrouroidei，Litopenaeus Vannamei，and Azumapecten farreri under the condition of twice MRL

圖8 在10 倍添加濃度條件下長尾鱈、南美白對蝦、櫛孔扇貝中代表化合物的回收率Fig.8 Recoveries of the representative compounds in Macrouroidei，Litopenaeus Vannamei，and Azumapecten farreri under the condition of 10 times MRL

從圖6～圖8 中可以看出，該方法在長尾鱈樣品中的回收率為40.32%～122.12%；在南美白對蝦樣品中的回收率為40.70%～123.98%；在櫛孔扇貝樣品中回收率為40.41%～118.07%。在1 倍添加濃度條件下，鱈魚、蝦、扇貝樣品中分別有96.2%、94.9%、93.7%獸藥化合物的回收率在集中50%～120%，其中鱈魚樣品中有2種獸藥（頭孢唑啉和頭孢噻呋）回收率小于50%，蝦樣品中有3 種獸藥（頭孢唑啉、頭孢氨芐和哌拉西林）回收率小于50%，扇貝樣品中有5 種獸藥（頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢氨芐、哌拉西林和孔雀石綠）回收率小于50%，鱈魚樣品中的獸藥化合物回收率略優(yōu)于其余2 種；在2 倍添加濃度條件下，鱈魚、蝦、扇貝樣品中分別有93.7%、92.4%、92.4%獸藥化合物的回收率在集中50%～120%，然而蝦樣品中有84.8%獸藥化合物的回收率集中于70%～120%，而扇貝樣品中僅有46.8%獸藥化合物的回收率集中于70%～120%；在10 倍添加濃度條件下，鱈魚、蝦、扇貝樣品中分別有94.9%、93.7%、89.9%獸藥化合物的回收率在集中50%～120%。因此該方法更加適用于鱈魚、蝦類等低脂肪、低蛋白質(zhì)的水產(chǎn)樣品檢測，而對于扇貝這類同樣低脂低蛋白但含有豐富色素類的水產(chǎn)品，該方法的回收率偏低，可能需要采用凈化方法針對色素做進(jìn)一步的優(yōu)化，同時(shí)目標(biāo)化合物在3 種樣品中回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。查閱相關(guān)規(guī)定后可以發(fā)現(xiàn)，對于包括GB 31650—2019、歐盟委員會法規(guī)、“肯定列表制度”等相關(guān)國內(nèi)國際法規(guī)中規(guī)定了在魚類、蝦類等水產(chǎn)品中最高添加限量相關(guān)要求的獸藥化合物，本方法中這些目標(biāo)獸藥化合物的定量限低于其相關(guān)要求。該方法簡單快捷，具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度，能夠適應(yīng)不同水產(chǎn)品中獸藥多殘留的同時(shí)快速檢測。

3 結(jié)論

基于超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀同時(shí)檢測水產(chǎn)品中多獸藥殘留，適宜用2 mmol/L 甲酸銨（含0.01%甲酸水溶液）-甲醇作為檢測流動相；用乙腈∶甲醇∶水（3∶1∶1，體積比），并添加1%乙酸和10 mmol/L EDTA-2Na 作為提取溶劑；使用Oasis HLB 固相萃取柱進(jìn)行凈化。方法的最低檢出限和定量限分別為0.2～5.0 μg/kg和0.5～10.0 μg/kg，水產(chǎn)品中除頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢氨芐、哌拉西林、孔雀石綠5 種化合物回收率較低外，其余回收率均在50%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.69%～19.91%。與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法相比，該方法的準(zhǔn)確性和靈敏度較高，重現(xiàn)性好，定量限能夠滿足國標(biāo)中針對魚類規(guī)定的最大殘留量快速篩查的相關(guān)要求，可以滿足水產(chǎn)樣品中79 種獸物化合物同時(shí)快速測定的需要。