東海海參多糖酶解提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

徐仰麗，劉溫婷，胡平霞，蘇來金*

（1.溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院 溫州市特色食品資源工程技術(shù)研究中心，浙江 溫州 325006；2.溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 溫州 325035）

東海海參，又名東海烏參，學名白肛海地瓜（Acaudina leucoprocta），屬于海參綱，尻參科，海地瓜屬。東海海參除了富含蛋白質(zhì)、微量元素等營養(yǎng)成分，還富含海參多糖、海參皂苷等功能活性成分。東海海參在我國沿海的儲量為100 萬t，是目前我國儲量最大的低值海參資源[1-3]，其價格低廉，與刺參相比，口感較差，加工困難[4]；另外，由于東海海參生活在淺海淤泥中，其體表形成了一層致密堅硬的表皮，重金屬含量易超標，去除較困難[5]，導致東海海參沒有得到很好的開發(fā)利用。近年來，海洋大陸架水質(zhì)富營養(yǎng)化逐漸加劇[6]，東海海參大量繁殖，已經(jīng)對海洋核電等設施造成了潛在威脅，若不能對東海海參資源進行有效清除或開發(fā)利用，未來可能存在生態(tài)安全隱患或造成海洋資源的浪費。

研究表明，東海海參體壁中含有豐富的海參多糖[7]，包含海參酸性黏多糖和海參巖藻多糖兩大類[8-9]，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等活性[10-13]。因此，提取東海海參中的海參多糖是提高東海海參開發(fā)利用程度、保障安全的重要途徑之一，然而目前東海海參多糖的提取率不高，部分功能還不明確，給產(chǎn)業(yè)化應用帶來了困難。本研究以東海海參干品為原料，采用酶解技術(shù)對東海海參多糖的提取工藝進行優(yōu)化，對其結(jié)構(gòu)和抗氧化活性進行研究，為低值海參資源的利用提供參考，并為東海海參多糖在食品和藥品等領(lǐng)域的應用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東海海參干品：溫州冠佳食品有限公司。2021 年12 月捕撈于浙江沿海，清洗去內(nèi)臟，海參體壁經(jīng)冷風干燥制成干海參。

丙酮、無水乙醇、苯酚、七水合硫酸亞鐵、30% 過氧化氫、葡萄糖、水楊酸、溴化鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；硫酸（優(yōu)級純）：浙江中星試劑有限公司；木瓜蛋白酶（80 萬U/g）、風味蛋白酶（1.5 萬U/g）、中性蛋白酶（20 萬U/g）（均為食品級）：北京索萊寶科技有限公司；D-葡萄糖標準品（純度99.9%）：美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9140A 恒溫鼓風干燥箱：上海百典儀器設備有限公司；MKZA10-15JIV 超微粉碎機：日本増幸產(chǎn)業(yè)株式會社；FR124CN 電子分析天平（分度值0.000 1 g）：上海書培實驗設備有限公司；CT15RT 臺式高速冷凍離心機：日本日立公司；HH-6 恒溫水浴鍋：蘇州江東精密儀器有限公司；T6 紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SpectraMax 190 全波長酶標儀：美國MD 公司；Vertex 70 傅立葉紅外光譜儀：德國布魯克公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

干東海海參試驗前置于冰水中泡發(fā)24 h，體壁剪成小塊，置于60 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎，過80 目篩，制成東海海參體壁干粉，密封貯存于干燥器中備用。多糖提取前將海參干粉按照料液比1∶10（g/mL）置于95%丙酮溶液中，浸泡脫脂24 h ，自然晾干。

1.3.2 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[14]測定不同條件下所得的東海海參多糖含量。

1.3.3 酶解法提取東海海參多糖工藝的優(yōu)化

1.3.3.1 最適蛋白酶的篩選

以風味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶作為備選酶制劑，根據(jù)酶制劑說明書推薦條件略有改動，以5.00 g 東海海參干粉為原料，按照料液比1∶30（g/mL）加入去離子水，加底物質(zhì)量0.8%的酶，于水浴鍋中酶解6 h，酶解完成后，在100 ℃沸水中滅酶15 min，冷卻后將酶解液離心（4 000 r/min，15 min），收集上清液于50 mL 容量瓶中定容，每個處理重復3 次，測定酶解液中多糖的含量，從而進一步確定后續(xù)試驗所用的蛋白酶種類。

1.3.3.2 酶解法提取東海海參多糖的單因素試驗

精確稱取東海海參干粉5.00 g 為底物，考慮到東海海參多糖提取反應初始溶液為中性條件，木瓜蛋白酶最適pH 值為6～7，因此，本研究固定了pH7.0 進行單因素試驗，以木瓜蛋白酶酶解過程中酶解溫度、酶解時間、酶添加量和料液比為考察因素，每個因素選取5 個水平，每個處理重復3 次，測定酶解液中海參多糖含量，計算多糖提取率。

酶解溫度：底物按照料液比1∶30（g/mL）加入去離子水，加底物質(zhì)量0.8%的試驗用酶，分別以酶解溫度30、40、50、60、70 ℃，置于水浴鍋中酶解6 h，考察酶解溫度對多糖提取率的影響。

酶解時間：底物按照料液比1∶30（g/mL）加入去離子水，加底物質(zhì)量0.8%的試驗用酶，以50 ℃作為酶解溫度，置于水浴鍋中分別酶解2、4、6、8、10 h，考察酶解時間對多糖提取率的影響。

酶添加量：底物按照料液比1∶30（g/mL）加入去離子水、分別加入底物質(zhì)量0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的試驗用酶，置于50 ℃水浴鍋中酶解6 h，考察酶添加量對多糖提取率的影響。

料液比：底物分別以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的料液比加入去離子水，加底物質(zhì)量1.0%的試驗用酶，置于50 ℃水浴鍋中酶解6 h，考察料液比對多糖提取率的影響。

1.3.3.3 酶解法提取東海海參多糖的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以東海海參多糖提取率為試驗指標，選取酶解溫度、酶解時間、酶添加量為影響因素，設計三因素三水平的正交試驗，利用L9（33）正交試驗表進行正交試驗，正交試驗因素與水平見表1，每個處理重復3 次。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4 東海海參多糖的紅外光譜分析

取干燥的試驗提取多糖，參考文獻[15]的方法，加入溴化鉀后壓片，在4 000～400 cm-1內(nèi)掃描紅外光譜。

1.5 東海海參多糖的抗氧化性測定

1.5.1 東海海參多糖對DPPH·的清除作用

DPPH·的清除能力參考馬士超等[16]的測定方法。DPPH·清除率（X，%）計算公式如下。

式中：A1為多糖溶液的吸光度；A0為對照溶液的吸光度。

1.5.2 東海海參多糖對·OH 的清除作用測定

·OH 的清除能力參考Chen 等[17]的測定方法?！H清除率（Y，%）計算公式如下。

式中：A1為空白對照的吸光度；Am為多糖溶液的吸光度；An為樣品對照的吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)果均作3 次平行處理，利用SPSS Statistics 21.0 和Excel 2016 對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，并利用Origin 2021 進行圖表繪制，方差分析采用（one-way AVONA）進行顯著性檢驗，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的制作

多糖含量在0～100 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度（λ=490 nm）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.010 1X+0.003 4，r2=0.999 0，符合標準曲線的準確度要求。

2.2 蛋白酶種類對東海海參多糖提取率的影響

取相同量的東海海參干粉，對不同蛋白酶的酶解效果進行評定，以酶解液多糖提取率為指標，進行最適蛋白酶的篩選，結(jié)果見表2。

表2 最佳蛋白酶篩選結(jié)果Table 2 Results of optimal protease screening

海參多糖主要是蛋白多糖，其中的蛋白包括和多糖連接的核心蛋白以及游離蛋白，在多糖提取過程中，切斷多糖與核心蛋白之間的糖肽鍵進而水解蛋白質(zhì)，釋放出多糖鏈[18-19]。由表2 可知，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的酶解液多糖提取率顯著高于風味蛋白酶（p＜0.05），而木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解液的多糖提取率差異并不顯著（p＞0.05），故這兩種酶的提取效果接近，但考慮到酶制劑的成本和應用，選取木瓜蛋白酶進行后續(xù)步驟的酶解工藝優(yōu)化。

2.3 東海海參多糖提取的單因素試驗結(jié)果

2.3.1 酶解溫度對東海海參多糖提取率的影響

酶解溫度對東海海參多糖提取率的影響見圖1。

圖1 酶解溫度對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis temperature on the yield of polysaccharides

從圖1 可以看出，東海海參多糖的提取率隨著酶解溫度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在酶解溫度為50 ℃時達到峰值。這可能是隨著酶解溫度升高，酶逐漸達到最適宜的溫度，酶解效率升高，多糖分子加速運動，能夠加快多糖的溶出；然而溫度過高會導致酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，致使蛋白酶活性變?nèi)跎踔料?，進而影響酶與底物的結(jié)合[20]，導致多糖提取率下降，因此選取50 ℃為單因素最佳酶解溫度，進行后續(xù)試驗。

2.3.2 酶解時間對東海海參多糖提取率的影響

酶解時間對東海海參多糖提取率的影響見圖2。

圖2 酶解時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the yield of polysaccharides

從圖2 可以看出，隨著酶解時間的延長，東海海參多糖提取率逐漸提高，在6 h 達到峰值，之后提取率趨于平緩。這可能是由于酶解時間過短時，蛋白酶與底物不能夠充分進行反應；延長酶解時間，隨著反應的進行，酶和底物逐漸結(jié)合，東海海參中的蛋白質(zhì)不斷降解為肽和氨基酸，與糖鏈分離[21]，多糖提取率隨之增加。隨著酶解反應的進行，底物減少，酶活力下降，產(chǎn)物也存在一定的抑制作用，因此酶解過程也會趨于平緩[22]，在6 h 時多糖已基本提取完全，延長酶解時間提取率也不會明顯上升，另外，酶解時間過長，可能會使酶解液腐敗變質(zhì)，形成安全隱患，因此選取6 h 為最優(yōu)酶解時間進行后續(xù)試驗。

2.3.3 酶添加量對東海海參多糖提取率的影響

酶添加量對東海海參多糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶添加量對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition amount on the yield of polysaccharides

從圖3 可以看出，隨著酶添加量的增加，東海海參多糖提取率逐漸提高，這一階段影響多糖提取率的主要因素是木瓜蛋白酶的用量，當酶添加量為1.0%時，多糖提取率達到最大，之后再增大酶的用量，多糖提取率反而有所降低。這可能是由于這一階段影響東海海參多糖提取率的主要因素是底物的量[23-24]，當酶與底物的量互相達到飽和狀態(tài)，即使酶的用量上升，但沒有足夠的底物與之反應，提取率就不會提升，且考慮到酶促反應動力學，酶的濃度過高可能也會抑制自身酶解效果[25]，因此選取1.0%為最優(yōu)酶添加量進行后續(xù)試驗。

2.3.4 料液比對東海海參多糖提取率的影響

料液比對東海海參多糖提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of polysaccharides

從圖4 可以看出，隨著溶劑用量的增大，東海海參多糖提取率呈現(xiàn)先快速增加又逐漸降低的趨勢，且在料液比為1∶20（g/mL）時達到最大值。這可能是由于溶劑量過大導致稀釋效應，使得底物濃度降低，酶與物料接觸的機會降低，使得酶解效果降低，不利于多糖物質(zhì)溶出[26]，并且溶劑用量過大會使后續(xù)多糖濃縮分離的成本增加，不利于實際工業(yè)化生產(chǎn)，因此，固定1∶20（g/mL）作為最佳酶解料液比，后續(xù)不進行正交試驗。

2.4 東海海參多糖提取的正交試驗結(jié)果

酶解法提取東海海參多糖正交試驗結(jié)果見表3。

表3 正交試驗方案設計及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test

由表3 可知，木瓜蛋白酶酶解提取東海海參多糖的最佳工藝為A3B1C2，即在料液比為1∶20（g/mL）的條件下，酶解條件為酶添加量1.0%，在55 ℃下酶解5 h；并且由極差R 值可以看出，在選取的3 個影響因素中，對東海海參多糖提取率的影響程度排序依次為C＞B＞A，即為酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度。

對正交試驗進行多因素方差分析，結(jié)果見表4。

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test results

由表4 可知，酶添加量對多糖提取率的影響最為突出，酶解溫度對多糖提取率的影響最小，根據(jù)F 值的大小，得到的各因素主次關(guān)系為酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度，這與極差分析所得結(jié)果一致。可能是由于設定的3 個溫度水平均在該木瓜蛋白酶適宜作用溫度范圍，使得該次試驗中酶解溫度的影響效應最小，因此優(yōu)化的提取工藝為料液比1∶20（g/mL）、酶解溫度55 ℃、酶解時間5 h、酶添加量1.0%。

2.5 驗證試驗

為了檢驗所得最佳提取工藝的穩(wěn)定性及可靠性，精確稱取東海海參干粉5.00 g，以上述得到的最佳提取工藝進行試驗驗證。重復3 次平行，得到的東海海參多糖平均提取率為（11.85±0.27）%，大于正交試驗方案中的最高值（11.75%±0.16）%，說明該工藝具有良好的穩(wěn)定性和可靠性。

2.6 東海海參多糖的紅外光譜分析

按照前述優(yōu)化的提取工藝，對提取的東海海參多糖進行紅外分析，結(jié)果見圖5。

圖5 東海海參多糖紅外光譜掃描圖Fig.5 IR spectrum of polysaccharides from Acaudina leucoprocta

從圖5 可以看出，在3 360 cm-1處出現(xiàn)了1 個較強伸縮振動峰，這是由于O—H 的伸縮振動形成的，是多糖的特征吸收峰[27]，表明樣品中具有糖環(huán)羥基；而在2 969～2 936 cm-1處有1 個弱帶，表明具有C-H 伸縮振動，這是多糖的次甲基C—H 振動吸收峰。另外在1 656 cm-1處的伸縮振動峰，與由C O 鍵的存在相關(guān)；而在1 242 cm-1的特征峰的產(chǎn)生則是與S O 鍵的存在有關(guān)，說明該多糖含有硫酸基。在850 cm-1處是C—O—S 的振動吸收峰，表明硫酸基在糖上的位置為C4 位。在1 080～1 029 cm-1和1 242～1 080 cm-1的特征峰，這是由醚鍵C—O—C 振動而產(chǎn)生的吸收峰表明多糖樣品含有吡喃糖環(huán)。在890 cm-1處的吸收峰微弱，表明樣品中含有少量β 型糖苷鍵，據(jù)此推斷，該優(yōu)化方法提取的東海海參多糖是一個典型的α-D-吡喃型多糖，這與Dong 等[28]從東海海參、黑乳參中提取的多糖的類型基本一致。

2.7 東海海參多糖的抗氧化性分析

2.7.1 東海海參多糖對DPPH·的清除能力分析

東海海參多糖對DPPH·的清除能力測定結(jié)果如圖6 所示。

圖6 東海海參多糖DPPH·清除率Fig.6 DPPH·scavenging rate of polysaccharides from Acaudina leucoprocta

DPPH·是一個比較穩(wěn)定的基團，能夠較好反映被測溶液的抗氧化活性，清除DPPH·的作用主要取決于抗氧化劑的供氫能力，被廣泛用于抗氧化劑對自由基的清除活性的評價[29]。由圖6 可以看出，在0～1.0 mg/mL濃度內(nèi)，隨著東海海參多糖濃度的增加，其清除DPPH·的效果逐漸增強，且具有明顯的劑量關(guān)系，當多糖質(zhì)量濃度提高到1.0 mg/mL 時，東海海參多糖對DPPH·的清除率達到（78.55±4.89）%，此時，陽性對照VC的DPPH·的清除率為（90.43±2.87）%，說明東海海參多糖具有較好的清除DPPH·能力。

2.7.2 東海海參多糖對·OH 的清除作用分析

東海海參多糖對·OH 的清除能力測定結(jié)果如圖7所示。

圖7 東海海參多糖·OH 清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging rate of polysaccharides from Acaudina leucoprocta

生物體內(nèi)·OH 是最具代表的自由基，可能導致生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、碳水化合物等大分子物質(zhì)的破壞，從而加速生物體的老化[30]。由圖7 可知，在多糖濃度為0.1～1.0 mg/mL 時，隨著東海海參多糖質(zhì)量濃度的增加，清除·OH 的效果逐漸增強，當質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時，清除率達到（82.71±2.81）%，陽性對照VC的·OH 清除率為（94.68±2.67）%，這表明東海海參多糖具有良好的·OH 清除活性。

海參多糖占干海參的6%以上，是海參的主要活性物質(zhì)之一，其生物學活性主要取決于海參的結(jié)構(gòu)，而海參的結(jié)構(gòu)主要受到海參品種、分子量大小、提取方法等影響[31]。Mou 等[32]對墨西哥海參的研究表明，分支硫酸化模式為α-L-Fuc4S 的fCS-Am 抗氧化活性最強，經(jīng)過降解后的低分子質(zhì)量多糖的自由基清除能力比未降解多糖有所降低。本研究中東海海參多糖具有較好的抗氧化活性，這可能與本研究優(yōu)化的酶解工藝有關(guān)系。

3 結(jié)論

采用木瓜蛋白酶酶解法提取東海海參多糖，得到最佳提取工藝為料液比1∶20（g/mL）、酶解溫度55 ℃、酶解時間5 h、酶添加量1.0%，在此條件下東海海參多糖提取率為（11.85±0.27）%，且各因素對多糖提取率的影響程度為酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度。最優(yōu)工藝提取的東海海參多糖具有典型的α-D-吡喃型多糖特征。東海海參多糖對DPPH·和·OH 的清除率均隨多糖濃度升高而升高，具有明顯的劑量關(guān)系且具有良好的抗氧化能力。本研究可為東海海參多糖的提取和功能成分的開發(fā)應用提供參考。