福建平和蜜柚皮多糖酶解提取工藝的優(yōu)化

王睿寧，胡宇鑫，陳強(qiáng)，黃哲，楊帆

（福州大學(xué)至誠(chéng)學(xué)院，福建 福州 350002）

福建平和蜜柚[Citrus maxima（Burm）Merr]是琯溪蜜柚的品種之一[1]，產(chǎn)量逐年上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)年均產(chǎn)量已突破150 萬(wàn)t[2]，產(chǎn)值突破100億元[3]。相較于逐年上升的產(chǎn)值，亟需解決的問(wèn)題也越來(lái)越多。蜜柚食用或加工后的副產(chǎn)物果皮廢棄物丟棄問(wèn)題嚴(yán)重，造成固體廢棄物的污染[4]，蜜柚果皮未得到充分利用。實(shí)際上蜜柚不僅果肉味美、鮮爽可口[5]，其果皮富含活性多糖、果膠、膳食纖維等成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用價(jià)值[6]?；阼肿悠撛诘幕钚猿煞峙c功能，柚子皮越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。大量研究表明，柚子皮的主要成分之一活性多糖具有降血脂、降膽固醇和抑制菌體病毒生長(zhǎng)等作用[7-10]。柚子皮粉能改善帶魚(yú)肌原纖維蛋白的凝膠特性，可作為改善魚(yú)肉及其制品品質(zhì)的添加劑[11]。此外，柚子皮還有止咳化痰的功效[12]，其大量的未知成分還有待開(kāi)發(fā)利用[13]。但是對(duì)于柚子皮的綜合利用開(kāi)發(fā)還處在試驗(yàn)階段，未形成產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；纳a(chǎn)。因此，開(kāi)發(fā)利用柚皮資源，如提取多糖、香精油、果膠、黃酮等活性物質(zhì)，獲取蜜柚高附加值，將成為研究者的重要任務(wù)，這也是柚子產(chǎn)區(qū)柚子果品加工廠(chǎng)亟需解決的問(wèn)題[6]。目前，關(guān)于對(duì)柚子皮中黃酮提取工藝的研究最多[14-15]，其次是柚子皮多糖的研究[16-17]，但選取的原料都是常山胡柚皮[16-17]，對(duì)于福建平和蜜柚的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以福建平和蜜柚皮為原料，利用酶解提取柚子皮多糖，并通過(guò)響應(yīng)面法確定福建蜜柚多糖提取的最佳工藝條件[18-21]。本研究將有利于解決福建蜜柚果皮造成的固體廢棄物的問(wèn)題，提高蜜柚的原料利用率，有利于福建地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，以期為蜜柚皮廢棄化利用的開(kāi)發(fā)與研究提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

福建平和蜜柚：市售；果膠酶（30 000 U/g）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；木瓜蛋白酶（＞50 萬(wàn)U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、95%乙醇（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；超純水：湖南科爾頓水務(wù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S26 型恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DHG-9245A 鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE-5205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海昕?jī)x儀器儀表有限公司；CTFD-10S 冷凍干燥機(jī)：青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柚子皮多糖酶解提取工藝流程

稱(chēng)取自然風(fēng)干的柚子皮10 g 置于錐形瓶中，加入液料比15∶1（mL/g）的95%乙醇在恒溫水浴鍋中處理2 h，經(jīng)過(guò)濾、干燥備用。柚子皮與水按液料比混合，加入0.4%的果膠酶和0.1%的木瓜蛋白酶，置于55 ℃恒溫水浴鍋，提取液經(jīng)80 ℃水浴滅活、活性炭沉淀（取物料質(zhì)量的1%，80 ℃維持1 h）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（真空度0.95 MPa，65 ℃）至20 mL 后，加入95%乙醇至占溶液體積分?jǐn)?shù)為90%以上，析出粗多糖，4 ℃靜置12 h，過(guò)濾，60 ℃干燥1 h，獲得柚子皮多糖固體粉末。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 酶用量對(duì)柚子皮多糖得率的影響

在液料比15∶1（mL/g）、浸提時(shí)間2 h、浸提2 次的條件下，酶用量分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g，考察酶用量對(duì)柚子皮多糖得率的影響。每個(gè)試驗(yàn)2 組平行，每組重復(fù)3 次。

1.3.2.2 液料比對(duì)柚子皮多糖得率的影響

在酶用量0.9 g、浸提時(shí)間2 h、浸提2 次的條件下，液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），考察液料比對(duì)柚子皮多糖得率的影響。每個(gè)試驗(yàn)2 組平行，每組重復(fù)3 次。

1.3.2.3 浸提時(shí)間對(duì)柚子皮多糖得率的影響

在液料比20∶1（mL/g）、酶用量0.9 g、浸提2 次的條件下，浸提時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察不同浸提時(shí)間對(duì)柚子皮多糖得率的影響。每個(gè)試驗(yàn)2 組平行，每組重復(fù)3 次。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取酶用量A、液料比B、浸提時(shí)間C 3 個(gè)對(duì)柚子皮多糖提取影響顯著的因子，以柚子皮多糖得率為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)試驗(yàn)水平因素表，見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Levels of test factors

1.3.4 柚子皮多糖得率計(jì)算

柚子皮多糖得率的計(jì)算公式如下。

W=M1/M0×100

式中：W 為柚子皮多糖得率，%；M1為干燥后多糖固體粉末的質(zhì)量，g；M0為柚子皮質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，采用Design Expert 10.0 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析，圖表繪制采用Origin 8.0 進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量對(duì)柚子皮多糖得率的影響

酶用量對(duì)柚子皮多糖得率的影響如圖1 所示。

圖1 酶用量對(duì)柚子皮多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the yield of polysaccharide from Citrus maxima peel

由圖1 可知，柚子皮多糖得率隨酶用量的增加而先升高后降低。酶用量為0.9 g 時(shí)，多糖得率最高為2.13%。此后隨著酶用量增加，柚子皮多糖得率反而下降。在溶液反應(yīng)過(guò)程中，果膠酶與底物進(jìn)行特異性結(jié)合，分解果膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)，破壞植物細(xì)胞壁釋放多糖[22]。同時(shí)酶用量在0.1～0.9 g 時(shí)，有利于蛋白質(zhì)的降解，可提高多糖得率。但酶用量過(guò)多，會(huì)大大阻礙酶與底物的定向反應(yīng)，導(dǎo)致酶的催化效率降低，致使多糖得率下降[23]。因此，酶用量的最佳選用范圍為0.7～1.1 g。

2.1.2 液料比對(duì)柚子皮多糖得率的影響

液料比對(duì)柚子皮多糖得率的影響如圖2 所示。

圖2 液料比對(duì)柚子皮多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharide from Citrus maxima peel

由圖2 可知，柚子皮多糖得率隨著液料比的增加而提高。液料比20∶1（mL/g）時(shí)，多糖得率最高2.77%。柚子皮液料比小于20∶1（mL/g）時(shí)，柚子皮與酶溶劑的接觸面積和接觸機(jī)會(huì)也相對(duì)變大，能夠使多糖更多的與水分子接觸，更好地溶解在水中[24]。液料比在20∶1～30∶1（mL/g）時(shí)，柚子皮多糖得率保持穩(wěn)定，多糖溶解度一定時(shí)，液料比超過(guò)一定范圍后，對(duì)可溶性多糖的溶解影響減弱。溶劑體積的變化也會(huì)造成后續(xù)濃縮能耗的增加，因此，液料比的最佳選用范圍為15∶1～25∶1（mL/g）。

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)柚子皮多糖得率的影響

浸提時(shí)間對(duì)柚子皮多糖得率的影響如圖3 所示。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)柚子皮多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide from Citrus maxima peel

由圖3 可知，在浸提時(shí)間0.5～2.0 h 時(shí)柚子皮多糖得率隨浸提時(shí)間延長(zhǎng)而提高。浸提時(shí)間2.0 h 時(shí)，多糖得率最高為2.73%。在一定時(shí)間范圍內(nèi)，浸提時(shí)間越長(zhǎng)，多糖的溶解越多，呈現(xiàn)平衡狀態(tài)[25]。浸提時(shí)間為2.0～3.0 h 時(shí)，對(duì)多糖得率影響變小，可能是底物與酶完全反應(yīng)，多糖得率逐漸趨于穩(wěn)定[26]。因此，浸提時(shí)間的最佳選用范圍為1.5～2.5 h。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)綜合優(yōu)化試驗(yàn)。以柚子皮多糖得率為響應(yīng)值，以A 酶用量（g）、B 液料比（mL/g）、C 浸提時(shí)間（h）3 個(gè)因素為因子，設(shè)計(jì)三因素三水平的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Response surface design of experiments and results

2.2.2 回歸方程建立與分析

以柚子皮多糖得率為響應(yīng)值，利用DesignExpert10.0軟件對(duì)表2 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到提取條件與多糖得率之間的二次多項(xiàng)式回歸模型：Y=2.71+0.006 25A+0.12B+0.14C+0.063AB+0.045AC+0.007 5BC-0.34A2-0.19B2-0.24C2。

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3 可知，回歸模型具有高度顯著性（P＜0.01），證明此模型已達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P 值為0.265 7，差異不顯著（P＞0.05）。決定系數(shù)R2=0.984 4 說(shuō)明響應(yīng)值柚子皮多糖得率與預(yù)測(cè)值之間擬合較好。校正系數(shù)RAdj2=0.964 3，說(shuō)明模型能解釋96.43%的響應(yīng)值變化?；貧w方程各項(xiàng)方差分析表明，B、C、A2、B2、C2對(duì)多糖得率有極其顯著的影響（P＜0.01），A、AB、AC、BC 對(duì)多糖得率影響不顯著（P＞0.05）。各因子對(duì)多糖得率的影響顯著性依次是C（浸提時(shí)間）＞B（液料比）＞A（酶用量）。

2.2.3 兩因子間交互作用分析

響應(yīng)曲面圖及等高線(xiàn)圖可明晰各因素間的交互作用及確定最佳點(diǎn)。因素影響顯著則3D 曲面圖的曲面坡度越陡峭，平坦則影響不顯著[27]。疏離的橢圓形等高線(xiàn)代表兩因素交互作用顯著，反之，密集的圓形等高線(xiàn)代表交互作用不顯著[28]。各因素的交互作用對(duì)柚子皮多糖得率的影響效果如圖4 所示。

圖4 任意兩變量對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface plots of the effects of interactions between any two variables on polysaccharide yield

由圖4 可知，固定浸提時(shí)間2 h，液料比和酶用量?jī)梢蛩氐捻憫?yīng)面傾斜程度較小，等高線(xiàn)呈現(xiàn)近似圓形，說(shuō)明兩因素交互作用不顯著。響應(yīng)曲面圖開(kāi)口向下，說(shuō)明在試驗(yàn)所選范圍內(nèi)存在極大值，液料比19∶1～21∶1（mL/g）、酶用量0.9～1.0 g 為最佳水平范圍。

固定液料比20:1（mL/g），酶用量和浸提時(shí)間兩因素的響應(yīng)面傾斜程度較小，等高線(xiàn)呈現(xiàn)圓形，說(shuō)明兩因素交互作用不顯著。響應(yīng)曲面圖開(kāi)口向下，在試驗(yàn)所選范圍內(nèi)存在極大值，酶用量0.9～1.0 g、浸提時(shí)間1.9～2.1 h 為最佳水平范圍。

固定酶用量0.9 g，液料比和浸提時(shí)間兩因素的響應(yīng)面傾斜程度非常小，等高線(xiàn)為圓形，說(shuō)明兩因素交互作用不顯著。響應(yīng)曲面圖開(kāi)口向下，說(shuō)明在試驗(yàn)所選范圍內(nèi)存在極大值，液料比19∶1～21∶1（mL/g）、浸提時(shí)間1.9～2.1 h 為最佳水平范圍。

2.2.4 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)，酶解提取柚子皮多糖的最佳工藝參數(shù)：酶用量1.039 g、液料比22.195∶1（mL/g）、浸提時(shí)間2.181 h，此時(shí)多糖得率的理論最大得率為2.79%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)需求，將工藝參數(shù)調(diào)整為酶用量1.0 g、液料比20∶1（mL/g）、浸提時(shí)間2 h。在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，柚子皮多糖的平均得率為（2.73±0.21）%，與理論預(yù)測(cè)值誤差值僅為0.06%，證實(shí)了該模型的有效性。

3 結(jié)論

本研究采用酶解輔助提取了福建平和蜜柚皮多糖。以酶用量、液料比和浸提時(shí)間3 個(gè)因素為變量，以多糖得率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，成功建立了多糖得率的二次多項(xiàng)式模型。綜合考慮模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)和試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，最終確定了酶解提取蜜柚皮多糖的最佳工藝條件：酶用量1.0 g、液料比20∶1（mL/g）、浸提時(shí)間2 h，在此條件下蜜柚皮多糖得率可達(dá)到（2.73±0.21）%。本研究獲得了福建平和蜜柚皮多糖，提高了柚皮的利用率，為果蔬的廢棄資源再利用提供參考依據(jù)，也為福建蜜柚皮多糖的開(kāi)發(fā)研究提供理論基礎(chǔ)。