黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對金銀花多酚類物質(zhì)釋放及增效作用

王懿文，謝純良，朱作華，周映君，龔文兵，饒力群，彭國平，李雙祁，顏少慰，彭源德*，汪啟明*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命與科學(xué)技術(shù)學(xué)院道地藥用植物規(guī)范化栽培與綜合利用湖南省工程實驗室，湖南 長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410128；3.湖南菲勒生物科技有限公司，湖南 長沙 410128；4.水羊集團股份有限公司，湖南 長沙 410128）

金銀花（Lonicera japonica），學(xué)名忍冬，為忍冬科忍冬屬多年生半常綠纏繞灌木，其初開花蕾或花苞為藥用部位，是我國的傳統(tǒng)藥食同源中藥材。在食品開發(fā)上，有較廣闊的應(yīng)用前景，同時市場需求量大，具有較高經(jīng)濟價值。此外，早在公元589 年南北朝《名醫(yī)別錄》中就記載，金銀花具有抗氧化、抗病毒、抑菌、消炎鎮(zhèn)痛、降血糖等功效[1-4]。而這些作用主要是由于金銀花中富含多種活性物質(zhì)，如多酚類、黃酮類、皂苷類、有機酸類、萜類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油等[5-6]。但是金銀花中的這些物質(zhì)多以結(jié)合態(tài)形式結(jié)合在細胞壁、木質(zhì)素等結(jié)構(gòu)上，導(dǎo)致現(xiàn)行主流的活性物質(zhì)提取方法，如浸提法、醇提法、酶輔助提取法等，無法有效地提取出這些活性物質(zhì)，降低了金銀花的生物利用度和可及性。

微生物對其發(fā)酵基質(zhì)有較強的生物轉(zhuǎn)化能力，利用微生物發(fā)酵處理中藥材相較于傳統(tǒng)的中藥熬制手法具有條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、后處理簡單等優(yōu)點[7-9]，此外，還能降低毒性[10]，或是通過產(chǎn)生新的代謝物達到增加療效的效果[11-12]。目前，關(guān)于金銀花發(fā)酵多集中于液體發(fā)酵，對于固體發(fā)酵研究較少。兩者相比較，固態(tài)發(fā)酵在生產(chǎn)工藝上更為簡單，省去了部分預(yù)處理、回收純化等步驟，整個生產(chǎn)過程中沒有廢水、廢氣產(chǎn)生，屬于低投資、耗能低且高產(chǎn)的一種發(fā)酵方式[13]。此外，在固體發(fā)酵中，菌絲和物料纏結(jié)，在發(fā)酵體系中易于產(chǎn)生發(fā)酵溫度和產(chǎn)物濃度梯度，從而使得霉菌在逆環(huán)境下產(chǎn)出更多胞外酶和更多次級代謝產(chǎn)物[14]。

黑曲霉（Aspergillus niger）屬絲孢目叢梗孢科曲霉屬，是叢梗孢科中的一個常見種。作為美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）準(zhǔn)許使用的工業(yè)酶類生產(chǎn)菌之一，具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)酶量大、不產(chǎn)毒素等優(yōu)點[15]。因所產(chǎn)酶系豐富，使其成為工業(yè)微生物中常見的菌種之一，這一特性也使得黑曲霉能夠有效地分解金銀花中的纖維素、果膠、木質(zhì)素等物質(zhì)，相較于液體發(fā)酵能夠促進物質(zhì)的釋放，提高發(fā)酵效率，從而降低能耗提高產(chǎn)量[16]。已有研究表明黑曲霉產(chǎn)酶機制為誘導(dǎo)表達機制，即黑曲霉通過識別不同的基質(zhì)，進行誘導(dǎo)表達形成不同的酶系[17]。利用不同的基質(zhì)對黑曲霉進行培養(yǎng)，產(chǎn)出更優(yōu)、更高比例的酶系成為目前黑曲霉的研究熱點。因此，本文通過黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花，以期為金銀花深加工產(chǎn)品提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花干花：湖南龍回一都富硒茶業(yè)股份有限公司；黑曲霉曲精：濟寧玉園生物科技有限公司；蘆丁、焦性沒食子酸、水楊酸、2，2＇-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；Na2CO2、NaNO2、Al（NO2）3、NaOH、H2O2（均為分析純）：湖南匯虹試劑有限公司；福林酚（分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司；甲醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硫酸亞鐵、過二硫酸鉀、鐵氰化鉀（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗設(shè)備與儀器

超聲波清洗機（JP-060S）：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀（I510）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；高速離心機（3K15）：美國Sigma 公司；電子天平（LQ-C3002）：上海瑤新電子科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑曲霉孢子菌懸液制備

將黑曲霉孢子菌粉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA） 培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)7～9 d，刮取長勢良好的菌孢子加入到100 mL 無菌水中，120 r/min 振蕩30 min，備用。

1.3.2 金銀花固體發(fā)酵及樣品制備

金銀花粉碎成0.1～0.3 cm 小段，121 ℃滅菌30 min。稱取3 g 滅菌的金銀花粉末，加入5 mL 無菌水（含水量約50%），再接入2 mL 黑曲霉孢子菌懸液，混勻后置于培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)，分別于3、6、9 d 取樣，空白組加入等量無菌水，同樣條件存放、取樣。將取得的樣品噴灑70%酒精殺菌，冷凍干燥，研磨粉碎。提取方法參照曹曉琴等[18]的方法并略加修改，稱取1 g 冷凍干燥粉末，加入10 mL 70%乙醇，于50 ℃、300 W 條件下超聲30 min，重復(fù)2 次，合并濾液，于4 ℃保藏。

1.3.3 總多酚含量測定

多酚含量測定參考福林酚比色法[19]并加以修改。以蘆丁為標(biāo)品，標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=1.295 4X-0.002 7（R2=0.999）。向10 mL EP 管中加入50 μL 待測樣品，純水定容至1 mL，依次加入1.5 mL 福林酚，混勻后反應(yīng)3～8 min，加入1 mL 20% Na2CO3，用純水定容至10 mL，混勻后反應(yīng)1 h，于波長760 nm 處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品中的多酚含量。

1.3.4 總黃酮含量測定

黃酮含量測定參考AlCl3比色法進行[20]，并加以修改。以沒食子酸為標(biāo)品，標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.004 6X+0.102 4（R2=0.995）。向50 mL EP 管中加入1 mL 待測樣品，純水定容至5mL，依次加入1mL5%NaNO2，混勻，6min 后加入1mL10%Al（NO3）3，混勻，6min 后加入10mL4%NaOH，純水定容至25 mL，混勻，反應(yīng)15 min，于波長510 nm 處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品中的黃酮含量。

1.3.5 總皂苷含量測定

試驗方法參考徐芳菲等[21]的方法，并加以修改。以齊墩果酸為標(biāo)品，標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.006X+0.096 4（R2=0.998）。吸取100 μL 樣品，40 ℃烘箱內(nèi)揮干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸和0.6 mL 高氯酸密封后，65 ℃恒溫水浴20 min，立即冰水浴降至室溫，加入5 mL 冰醋酸，搖勻，于550 nm 波長處測定吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總皂苷含量。

1.3.6 抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH 自由基清除率的測定

參考文獻[22]的方法，在2 mL EP 管中加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH 和1 mL 待測樣液，用等量無水乙醇替換DPPH 作對照組；用等量無水乙醇替換待測樣液作空白組，混勻，避光反應(yīng)30 min。吸取200 μL 反應(yīng)液于波長517 nm 處測定吸光度。根據(jù)式（1）計算DPPH自由基清除率（R1，%）。

式中：A、B、C 分別為試驗組、對照組、空白組的吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除率的測定

參考文獻[23]的方法，加入6 mmol/L FeSO4、待測樣液、6 mmol/L H2O2各2 mL 于10 mL EP 管中，用等量的純水替換待測樣液作對照組，混勻靜置10 min；加入2 mL 6 mmol/L 水楊酸溶液，混勻反應(yīng)30 min。吸取200 μL 反應(yīng)液于波長510 nm 處測定吸光度。根據(jù)式（2）計算羥自由基清除率（R2，%）。

式中：A、B 分別為試驗組、對照組的吸光度。

1.3.6.3 ABTS 陽離子自由基清除率的測定

參考文獻[24] 的方法，取7.4 mmol/L ABTS 和2.6 mmol/L K2S2O8各25 mL 混合，室溫下避光靜置12 h。用95%乙醇將混合液稀釋至其在735 nm 處的吸光度為0.68～0.72。吸取0.2 mL 樣液于2 mL EP 管中，用95%乙醇替換待測樣液作空白組，用稀釋后試劑定容至1 mL，靜置反應(yīng)6 min。吸取200 μL 反應(yīng)液于波長734 nm 處測定吸光度。根據(jù)式（3）計算ABTS 陽離子自由基清除率（R3，%）。

式中：A、B 分別為試驗組、對照組的吸光度。

1.3.6.4 總還原力的測定

參考文獻[25]的方法，取1 mL 待測樣液于10 mL EP 管中，等比例加入0.2 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）和2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液共5 mL，水浴鍋50 ℃恒溫反應(yīng)20 min，加入2.5 mL 10% C2HCl3O2溶液。分別吸取上清液和純水等比例混勻至5 mL，加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，反應(yīng)10 min后于波長700 nm 處測定吸光度，樣品總還原力與OD值呈正相關(guān)性。

1.3.7 透明質(zhì)酸酶抑制活性測定

試驗方法參考Bralley 等[26]的方法，并加以修改。在10 mL EP 管中等比例滴加待測樣品和透明質(zhì)酸酶液共1 mL，水浴鍋37 ℃孵育20 min；加入0.1 mL CaCl2溶液，繼續(xù)孵育20 min；加入0.5 mL 透明質(zhì)酸鈉液，37 ℃反應(yīng)40 min；立即轉(zhuǎn)置常溫冷卻5 min，等比例加入NaOH 溶液和乙酰丙酮溶液共1 mL，沸水浴反應(yīng)15 min 后，立刻冰浴5 min，轉(zhuǎn)置常溫10 min；加入0.5 mL純水和1 mL 埃爾利希試劑，混勻反應(yīng)30 min，于波長530 nm 處測定其吸光度，根據(jù)式（4）計算透明質(zhì)酸酶抑制率（R4，%）。

式中：A 為對照空白組（水代替樣品溶液，醋酸代替酶液、透明質(zhì)酸鈉溶液）吸光度；B 為對照組（水代替樣品）吸光度；C 為試驗空白組吸光度（醋酸溶液代替酶液、透明質(zhì)酸酶）；D 為試驗組吸光度。

1.3.8 發(fā)酵過程中酶活測定

1.3.8.1 粗酶液提取

取固體發(fā)酵的金銀花，按料液比1∶20（g/mL）加入0.1 mol/L（pH4.5）檸檬酸緩沖溶液，于搖床30 ℃、160 r/min 振蕩6 h，8 000 r/min 離心5 min，收集上清液，即得酶提取液。酶活測定方法參考田杰[27]、Xue 等[28]的方法，并加以修改。

1.3.8.2 纖維素酶酶活測定

吸取250 μL 樣品，50 ℃水浴預(yù)熱5 min，隨后試驗組加入50 ℃預(yù)熱的1%羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC）溶液250 μL，空白組不加入酶液，50 ℃反應(yīng)15 min，隨后加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，空白組補足250 μL 底物，沸水浴5 min，于540 nm 處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品中的纖維素酶酶活。

1.3.8.3 木聚糖酶酶活測定

吸取250 μL 樣品，50 ℃水浴預(yù)熱5 min，隨后試驗組加入50 ℃預(yù)熱的1%木聚糖250 μL，空白組不加入酶液，50 ℃反應(yīng)15 min，隨后加入1.5 mL DNS 溶液，空白組補足250 μL 底物，沸水浴5 min，于540 nm 處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品中的木聚糖酶酶活。

1.3.8.4 β-葡萄糖苷酶酶活測定

吸取30 ℃預(yù)熱的樣品1 mL，加入30 ℃預(yù)熱的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl β-Dglucopyranoside，PNPG）1.5 mL，空白組不添加，于30 ℃反應(yīng)30 min，加入2.5 mL 0.5 mol/mL Na2CO3，空白組再補齊1.5 mL PNPG，于420 nm 處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品中的β-葡萄糖苷酶酶活。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計學(xué)比較采用雙向方差分析（ANOVA）和Tukey 檢驗，利用Pearson 系數(shù)進行進行相關(guān)分析，P＜0.05 和P＜0.01 表示有統(tǒng)計學(xué)意義。所有圖表繪制及數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 9.4 版軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花活性物質(zhì)含量變化

《中國藥典》（2020 版）以綠原酸（酚酸類）和木犀草素（黃酮類）含量判斷金銀花品質(zhì)，此外金銀花中的藥效物質(zhì)以多酚、皂苷、揮發(fā)油等為主[5]。黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花活性物質(zhì)含量結(jié)果見圖1。

由圖1 可知，金銀花經(jīng)過黑曲霉固體發(fā)酵后，總多酚、總黃酮和總皂苷含量都有明顯提高。持續(xù)發(fā)酵6 d，其中總多酚和總黃酮分別由76.60 mg/g 和20.76 mg/g升高至97.56 mg/g 和24.12 mg/g，繼續(xù)發(fā)酵至9 d 略微下降至95.09 mg/g 和23.65 mg/g；總皂苷含量由3.50 mg/g 持續(xù)升高至4.39 mg/g。楊丹等[29]利用黑曲霉發(fā)酵陳皮，發(fā)現(xiàn)其黃酮物質(zhì)含量和抗氧化能力均有顯著提高。閻欲曉等[30]利用黑曲霉對甘蔗葉進行發(fā)酵，黃酮和多酚含量分別提高135%和92%，且提升率與纖維素酶和β-葡萄糖苷酶酶活成正比，同時DPPH·、·OH清除率得到顯著提高。當(dāng)發(fā)酵至6 d 時，多酚含量變化趨于穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)下降，原因可能為基質(zhì)中有效碳源被耗盡，黑曲霉代謝速率減緩，甚至開始利用多酚類活性物質(zhì)作為碳源，致使多酚類物質(zhì)含量開始下降，結(jié)合大面積生產(chǎn)時的能耗問題，可選定6 d 為最佳發(fā)酵時間。

2.2 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花抗氧化能力變化

DPPH 為一種穩(wěn)定的氮中心自由基，由于其能夠接受一個電子或氫離子從而從紫色褪色為黃色或者無色，因此常被用于對供氫能力的檢測[22]；ABTS+·清除率可以評估樣品的抗氧能力和自由基產(chǎn)生能[31]。·OH可能是干旱脅迫下大部分氧化損傷的主要原因[23]。黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花抗氧化能力變化見圖2。

圖2 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of L.japonica during solid-state fermentation by A.niger

由圖2 可知，金銀花經(jīng)過發(fā)酵后，抗氧化能力得到明顯提高。發(fā)酵0～6 d，ABTS+·清除率、·OH 清除率分別由32.09%和23.43%提升至55.06%、30.10%，且發(fā)酵至6 d 后，保持穩(wěn)定不變。發(fā)酵0～9 d，DPPH·清除率由61.25%穩(wěn)定提升至84.57%，總還原力由0.730 9 提升至0.818 9。馮軍偉等[32]利用黑曲霉對脫脂麥胚進行發(fā)酵，其DPPH·、·OH 清除率在發(fā)酵至82 h 提升至最高值，分別為75.68%、80.40%。袁明貴等[33]利用黑曲霉對涼茶渣進行發(fā)酵，發(fā)酵后DPPH·、·OH 清除率分別提高至87.36%、95.63%。結(jié)果表明抗氧化功效的變化與多酚等活性物質(zhì)變化呈正相關(guān)，這與多酚功效的相關(guān)報道相符合[34]。

2.3 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花抗過敏能力變化

透明質(zhì)酸酶是I 型過敏反應(yīng)的重要介導(dǎo)酶，研究表明透明質(zhì)酸酶活性會受到各種肥大細胞釋放組胺的藥物修飾，一些抗敏藥物對透明質(zhì)酸酶有較強的抑制活性，因此透明質(zhì)酸酶活性抑制率可作為研究抗過敏作用的指標(biāo)。黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花抗過敏能力結(jié)果見圖3。

圖3 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花抗過敏能力Fig.3 Antiallergic ability of L.japonica during solid-state fermentation by A.niger

由圖3 可知，金銀花經(jīng)過黑曲霉固體發(fā)酵后，其抗過敏能力有明顯提高。發(fā)酵0～3 d，透明質(zhì)酸酶抑制率由13.51%迅速升高至54.05%；在3～6 d，透明質(zhì)酸酶抑制率提升較為緩慢，提升至64.86%；發(fā)酵至9 d 透明質(zhì)酸酶抑制率迅速增至98.64%。

2.4 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花產(chǎn)酶酶活結(jié)果分析

黑曲霉的產(chǎn)酶機制為底物誘導(dǎo)性機制，即通過識別發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)出不同酶活的酶系。黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花產(chǎn)酶酶活測定結(jié)果見圖4。

圖4 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花產(chǎn)酶酶活Fig.4 Enzyme activity of L.japonica during solid-state fermentation by A.niger

由圖4 可知，黑曲霉以金銀花為基質(zhì)，發(fā)酵過程中持續(xù)產(chǎn)纖維素酶、β-葡萄糖苷酶至酶活達11.70、15.78IU/g；木聚糖酶發(fā)酵至6 d 時酶活達到最高，為32.39 IU/g，隨著發(fā)酵繼續(xù)，酶活降至16.29 IU/g。

2.5 相關(guān)性分析

總多酚、總黃酮、總皂苷含量與抗氧化能力、酶活相關(guān)性分析結(jié)果如表1 所示。

表1 多酚、黃酮、皂苷含量和抗氧化能力、酶活相關(guān)性系數(shù)Table 1 Correlation coefficient of contents of polyphenols，flavonoids，and saponins with antioxidant activities and enzyme activities

由表1 可知，總多酚和總皂苷的含量與纖維素酶酶活呈極顯著正相關(guān)。植物中多酚類物質(zhì)大部分呈現(xiàn)結(jié)合態(tài)，與植物細胞中的細胞壁等結(jié)構(gòu)所結(jié)合，該結(jié)果表明黑曲霉所產(chǎn)纖維素酶可能是促進總多酚、皂苷增加的主要原因，其能夠酶解金銀花細胞中細胞壁的纖維素，從而將結(jié)合態(tài)多酚、皂苷類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，促進多酚和皂苷類物質(zhì)釋放的效果。此外，總多酚和總皂苷含量與抗氧化能力也呈顯著相關(guān)，同時，總黃酮與·OH 清除率呈顯著正相關(guān)。這表明發(fā)酵后金銀花的增效主要歸因于多酚、皂苷物質(zhì)的釋放。

3 結(jié)論

本研究通過黑曲霉固態(tài)發(fā)酵金銀花，發(fā)酵后其DPPH·、ABTS+·、·OH 清除率、總還原力及透明質(zhì)酸酶抑制率得到提高。同時，發(fā)酵后的金銀花總多酚、總黃酮、總皂苷含量相較于未發(fā)酵組也得到提高。相關(guān)性分析結(jié)果表明，總多酚、總皂苷含量與抗氧化能力呈顯著相關(guān)（P＜0.05），推測金銀花中的多酚和皂苷類物質(zhì)是其抗氧化能力的主要來源。此外，在黑曲霉固體發(fā)酵過程中，檢測到纖維素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。同時，相關(guān)性分析結(jié)果表明，總多酚和總皂苷含量與纖維素酶酶活呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），表明多酚和皂苷釋放主要歸功于纖維素酶的產(chǎn)生。綜上所述，推測黑曲霉固態(tài)發(fā)酵通過產(chǎn)出纖維素酶，酶解金銀花細胞壁等結(jié)構(gòu)，促進結(jié)合在其上的結(jié)合態(tài)多酚、皂苷釋放，進而提高其抗氧化、抗過敏能力。本研究為金銀花固態(tài)發(fā)酵及精深加工提供了一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。