黃芩苷通過(guò)阻斷2型固有淋巴細(xì)胞激活減輕膿毒癥肺損傷機(jī)制研究*

溫 霞 陳恩就 孫 俊 姜小珍 王珊瑚

1 平陽(yáng)縣人民醫(yī)院 浙江 平陽(yáng) 325400

2 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 溫州 325000

膿毒癥的特征是宿主細(xì)胞促炎和抗炎因子的相互作用，導(dǎo)致炎癥網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)重失調(diào)[1]。大量炎癥細(xì)胞因子通過(guò)血液循環(huán)會(huì)造成相關(guān)的急性肺、腎臟和其他器官的損傷，因此抗感染治療成為膿毒癥最有效的治療方法[2]。先天性淋巴細(xì)胞（Innate lymphoid cells，ILCs）是近年來(lái)備受關(guān)注的一類細(xì)胞，因?yàn)槠淇梢钥缭较忍烀庖呦到y(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間的橋梁，誘導(dǎo)分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子影響感染/損傷部位產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類型[3]。ILCs 根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子可分為3 個(gè)亞組，其中第2組ILCs（ILC2s）不僅是啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)所必需的，而且還通過(guò)IL-13 支持Th2 細(xì)胞的生成[4]。ILC2s 通常與黏膜屏障表面有關(guān)，在調(diào)節(jié)對(duì)入侵病原體的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面起著重要作用。黃芩苷（Baicalin，BA）是從黃芩干根中提取的一種黃酮類化合物，具有多種生物活性[5]，可以抑制Th1和Th17反應(yīng)，促進(jìn)Treg 反應(yīng)，從而減輕膿毒癥胰腺損傷[6]。關(guān)于BA對(duì)膿毒癥中ILC2s的影響尚不清楚，本研究旨在觀察BA對(duì)膿毒癥肺損傷的改善作用，及其在膿毒癥炎癥治療中的潛在分子機(jī)制是否涉及ILC2s的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型：于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006]購(gòu)買50 只雄性C57BL/6 小鼠，體重22～26g（8～10 周齡）。采用盲腸結(jié)扎穿孔法（Cecal ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥模型[6]。將50 只小鼠隨機(jī)分為5 組（n=10）：假手術(shù)組、模型組、BA 低劑量組（BA-L，100mg/kg）、BA 中劑量組（BA-M，200mg/kg）和BA 高劑量組（BA-H，300mg/kg）。在無(wú)菌條件下中線切一個(gè)小口暴露盲腸。隨后，在距遠(yuǎn)端1.5cm 處用絲線結(jié)扎盲腸。然后，用一根18 號(hào)的針進(jìn)行兩次穿刺，排出少量糞便。之后，盲腸在腹部縫合前被移到腹腔。術(shù)后腹腔注射生理鹽水（24mL/kg）復(fù)蘇。假手術(shù)組除CLP 外均行手術(shù)。BA-L 組、BA-M 組和BA-H 組小鼠灌胃BA（上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度≥98%）每日1次，連續(xù)3 天。假手術(shù)組和模型組每天同時(shí)灌胃等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有小鼠意外死亡。3 天后，麻醉并處死所有小鼠進(jìn)行外周血和肺組織取樣。

1.2 組織病理學(xué)和損傷評(píng)分：收集肺組織，用4%多聚甲醛固定。組織脫水，包埋在石蠟中，切成5μm厚切片，蘇木精和伊紅（HE）染色。肺損傷以肺泡充血出血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)血管壁或肺泡壁增厚為特征。每個(gè)特征的缺失（0）或存在被分為輕度（1）、中度（2）和重度（3），確定總累積組織學(xué)評(píng)分[7]。隨機(jī)選取8 個(gè)高倍鏡區(qū)，平均值為每個(gè)標(biāo)本的病理學(xué)評(píng)分。

1.3 肺和外周血中ILC2s 的流式細(xì)胞術(shù)分析：用GentleMacs 小鼠腫瘤組織解離試劑盒（德國(guó)Miltenyi Biotec 公司）對(duì)肺組織進(jìn)行混合消化，從肺組織中制備單細(xì)胞懸浮液，然后在37℃下用1mg/mL 膠原酶IA 和20μg/mL DNaseI 染色30min。抗凝外周血樣本和肺細(xì)胞懸浮液通過(guò)70μm 尼龍網(wǎng)過(guò)濾，紅細(xì)胞裂解液處理，PBS（含2%胎牛血清）洗滌。首先用抗CD16/32 單克隆抗體（2.4G2，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）孵育10min，阻斷Fc 受體。然后用APC-effluro 780 結(jié)合抗-CD45（美國(guó)eBioscience公司）、PerCP-cy5.5-結(jié)合抗譜系標(biāo)記物（CD3e、CD11b、CD45R/B220、Ly-76、Ly-6G 和Ly-6C）（美國(guó)BD-Pharmingen公司）、FITC結(jié)合抗Thy1.2（美國(guó)eBioscience 公司）和APC 結(jié)合抗ST2（美國(guó)Biolegend 公司）的混合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。ILC2s 被鑒定為CD45+Lin-Thy1.2+ST2+。使用流式細(xì)胞儀分析樣本。

1.4 支氣管肺泡灌洗液（BALF）分析：在最后一次給藥24h后收集BALF。將氣管通過(guò)一根22英寸的靜脈導(dǎo)管插管，用1mL PBS 對(duì)肺進(jìn)行灌洗，連續(xù)3 次獲得BALF。將BALF在300rpm、4℃下離心10min。然后收集上清液的樣本并在?80℃下儲(chǔ)存以進(jìn)行進(jìn)一步分析。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞總數(shù)。BALF 細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯示為每毫升BALF 的細(xì)胞數(shù)。使用小鼠ELISA 試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）測(cè)定BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13水平。

1.5 Western Blotting 分析：將小鼠肺組織進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。用Pierce BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。隨后，將蛋白質(zhì)樣品（50μg）用5×樣品緩沖液煮沸，并在SDS-PAGE 上電泳轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。將膜暴露于封閉緩沖液中2h，在4℃下與一級(jí)抗體IL-33（1∶1000）、抗ST2（1∶1000）或GAPDH 抗體（1∶1000；均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）孵育過(guò)夜，然后在室溫下與HRP 結(jié)合的二級(jí)山羊抗兔IgG（1∶2000）一起孵育1h。最后用化學(xué)發(fā)光法在Tanon 5200 Multi 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光（上海天能科技有限公司）觀察結(jié)果。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與治療：正常人支氣管上皮（NHBE）細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC，并在含10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素和100 單位/mL 青霉素的DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen 公司）中培養(yǎng)。將1×106細(xì)胞接種于6 孔板中，加入或不加入100 ng/mL LPS 和BA（1.25、2.5、5.0μmol/L）培養(yǎng)6h。

1.7 RNA 分離與定量PCR 分析：用TRIzol 試劑（美國(guó)Ambion 公司）從肺組織勻漿中或細(xì)胞中提取RNA。用PrimeScript RT-Master Mix 試劑盒（日本TaKaRa 公司）生成cDNA。使用SYBR Green Master Mix試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems 公司）在Applied Biosystems ABI 7500（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。靶基因的相對(duì)表達(dá)用相對(duì)定量的比較法計(jì)算，并將數(shù)據(jù)歸一化到對(duì)照組?；虮磉_(dá)水平用2-△Ct法進(jìn)行，并標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH 的表達(dá)。用于qPCR 擴(kuò)增的基因特異性引物序列設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 基因特異性引物序列

1.8 數(shù)據(jù)處理：使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)分析采用兩組間的t檢驗(yàn)或多組間Tukey多重比較檢驗(yàn)的單因素方差分析。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BA 對(duì)膿毒癥小鼠肺組織病理學(xué)影響：假手術(shù)組小鼠肺標(biāo)本未見(jiàn)明顯組織學(xué)改變。CLP 可導(dǎo)致模型組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷，表現(xiàn)為炎性小體彌漫性浸潤(rùn)，中性粒細(xì)胞明顯向肺泡腔募集，氣管固有層變薄、水腫。值得注意的是，BA 可逆轉(zhuǎn)CLP 對(duì)肺組織的影響，尤其是高劑量治療組。這些結(jié)果證明BA 對(duì)治療膿毒癥肺部炎癥損傷是有益的。

圖1 肺組織炎癥損傷的HE染色（A）及肺損傷評(píng)分（B）

2.2 BA 減輕膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)：與對(duì)照組比較，模型組BALF 細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多（P＜0.001）。用BA 處理可顯著降低BALF 中的總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）（圖2A-B）。此外，CLP 可誘導(dǎo)小鼠肺IL-4、IL-5和IL-13基因水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。BA 處理不同程度下調(diào)肺組織中IL-4、IL-5 和IL-13 mRNA 表達(dá)（P＜0.05），其中以高劑量BA 作用最強(qiáng)（P＜0.01）（圖2C）。同樣，模型組BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13的水平較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），而中、高劑量BA處理后IL-4、IL-5 和IL-13 水平降低（P＜0.05）（圖2D）。

2.3 BA 通過(guò)IL-33/ST2 軸抑制CLP 誘導(dǎo)的小鼠ILC2s成熟：小鼠肺ILC2s 成熟和激活的表型鑒定為ST2、Thy1.2陽(yáng)性。與Sham組比較，模型組大鼠肺和外周血內(nèi)ST2+Thy1.2+ILC2s 含量明顯增加（P＜0.001）。低劑量至高劑量BA 顯著降低ST2+Thy1.2+ILC2s 數(shù)量（P＜0.001）（圖3A-B）。IL-33/ST2 軸在肺ILC2s 的激活和引起氣道炎癥中起關(guān)鍵作用。在模型組中，肺勻漿中IL-33 和ST2 的蛋白和mRNA 表達(dá)均上調(diào)（P＜0.001）。BA 從低劑量到高劑量均顯著下調(diào)肺勻漿中IL-33和ST2的蛋白和mRNA 表達(dá)（P＜0.05）（圖3C-D）。因此，BA 可以減輕CLP 誘導(dǎo)的氣道炎癥，其作用機(jī)制至少部分通過(guò)破壞IL-33/ST2軸抑制ILC2s的成熟。

圖3 BA通過(guò)IL-33/ST2軸抑制CLP誘導(dǎo)的小鼠ILC2s成熟

2.4 BA 抑制LPS 刺激后氣道上皮細(xì)胞IL-33 的表達(dá)：經(jīng)LPS刺激6小時(shí)后，NHBE細(xì)胞中IL-33 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）（圖4A）。BA 處理可顯著降低LPS 誘導(dǎo)的IL-33 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）（圖4B）。這些結(jié)果表明BA 可能通過(guò)下調(diào)氣道上皮細(xì)胞中IL-33 的產(chǎn)生而減弱IL-33/ST2軸介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

圖4 BA抑制LPS刺激后氣道上皮細(xì)胞IL-33的表達(dá)

3 討論

CLP 模型與其他動(dòng)物模型相比有許多優(yōu)點(diǎn)，它符合人類感染的自然過(guò)程，表現(xiàn)出相似的血流動(dòng)力學(xué)變化，并誘發(fā)不同程度的膿毒癥嚴(yán)重程度[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，CLP 誘導(dǎo)的小鼠肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷。BA 能調(diào)節(jié)Th1、Th17 和Treg 反應(yīng)，減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、過(guò)敏性哮喘和結(jié)腸炎[9]。BA在小兒膿毒癥中通過(guò)抑制BAX 和促進(jìn)BCL2 發(fā)揮抗急性腎損傷的作用[10]。BA 可抑制巨噬細(xì)胞釋放高遷移率族盒1，可能是膿毒癥相關(guān)疾病的潛在治療策略[11]。本研究中，BA 能顯著減輕膿毒癥相關(guān)性肺損傷和炎癥程度，證實(shí)了先前報(bào)道的BA對(duì)膿毒癥相關(guān)反應(yīng)有改善作用。

由于肺內(nèi)ILC2s 被認(rèn)為是2 型細(xì)胞因子傳播2 型炎癥的早期來(lái)源，因此ILC2s可能在介導(dǎo)膿毒癥的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[4]。本研究中，膿毒癥小鼠肺內(nèi)成熟表型的ILC2s數(shù)量顯著增加，并且BALF中IL-5和IL-13的產(chǎn)生可能部分反映了ILC2s 依賴性免疫反應(yīng)的促進(jìn)作用。此外，BA 可抑制肺內(nèi)ILC2s 成熟。這些證實(shí)ILC2s可能作為膿毒癥急性肺損傷期間BA治療的早期靶向炎癥細(xì)胞。

ILC2s 組成性地表達(dá)ST2，并在過(guò)敏原激發(fā)或感染后迅速對(duì)IL-33 作出反應(yīng)，增殖和細(xì)胞因子生成增加[12]。IL-33/ST2 信號(hào)對(duì)于肺IL-5 和IL-13 的產(chǎn)生和氣道嗜酸性粒細(xì)胞增多（獨(dú)立于適應(yīng)性免疫）是必需的[13]。IL-33 依賴性IL-5 和IL-13 的產(chǎn)生能促進(jìn)皮膚傷口愈合，是皮膚上皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間的重要紐帶[14]。IL-33 通過(guò)促進(jìn)ILC2s 增殖及其產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13 來(lái)預(yù)防實(shí)驗(yàn)性腦瘧疾[15]。在小鼠模型中，IL-33 通過(guò)ST2 信號(hào)激活駐留肺部的ILC2s[13]。與此一致，在本研究中，膿毒癥小鼠肺中IL-33 和ST2 的表達(dá)均上調(diào)，而B(niǎo)A 處理后則下調(diào)。這些結(jié)果提示BA 可能通過(guò)IL-33/ST2 軸影響肺內(nèi)ILC2s 的激活。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，IL-33 在暴露于LPS 的氣道上皮細(xì)胞中顯著上調(diào)，而B(niǎo)A則下調(diào)。表明BA除抑制ILC2s增殖外，還可能對(duì)上皮細(xì)胞IL-33產(chǎn)生作用。

綜上所述，BA 可以通過(guò)靶向IL33/ST2 軸抑制膿毒癥小鼠氣道中ILC2s介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。此外，BA抑制氣道上皮細(xì)胞IL-33-ST2 軸，這是一個(gè)強(qiáng)有力的促炎途徑，在LPS 暴露時(shí)觸發(fā)過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，BA 可作為未來(lái)輔助治療膿毒癥的潛在藥物。