超聲處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠組分的影響

楊亦雯，李大婧，包怡紅，聶梅梅，劉春菊，劉春泉，肖亞冬，牛麗影，吳海虹

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

葡萄（Vitis viniferaL.）富含糖類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸及多種礦物質(zhì)等，成熟的鮮葡萄中糖含量高達(dá)10%～30%，多酚類(lèi)物質(zhì)含量約為316.3～1141.3 mg GAE/100 g DW[1]。研究表明，葡萄中的酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)肥胖、癌癥和心血管等慢性疾病具有一定的預(yù)防作用[2]。近年來(lái)，葡萄脆粒作為一種新型休閑食品受到消費(fèi)者歡迎。然而，葡萄因糖含量高，干燥后更易形成果干類(lèi)產(chǎn)品，這也是傳統(tǒng)葡萄干制品多為葡萄干的重要原因。干燥前對(duì)果蔬進(jìn)行超聲波預(yù)處理不僅可提高其干燥速率，而且能夠改善最終產(chǎn)品品質(zhì)[3-4]。

超聲波作為一種常用的預(yù)處理方式，在果蔬加工中具有廣泛應(yīng)用。當(dāng)果蔬物料處于超聲波壓力場(chǎng)內(nèi)時(shí)，因空化氣泡的形成、增長(zhǎng)和劇烈破裂及由此引發(fā)的一系列理化效應(yīng)，其中的細(xì)胞壁多糖物質(zhì)會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。細(xì)胞壁作為支撐果蔬細(xì)胞骨架和質(zhì)地的主要成分，其中的大分子物質(zhì)通過(guò)離子鍵或非離子鍵相互作用形成具有一定剛性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[5]。細(xì)胞壁多糖中的果膠因其復(fù)雜結(jié)構(gòu)在加工中非常敏感，其分子降解會(huì)破壞細(xì)胞三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，降低相鄰細(xì)胞間交聯(lián)強(qiáng)度，改變產(chǎn)品質(zhì)地[6-7]。一般果膠有三種鍵態(tài)，即水溶性果膠（WSP）、反式環(huán)己烷1、2-二胺四乙酸（CDTA）可溶性果膠（CSP）和碳酸鈉可溶性果膠（NSP），WSP 為通過(guò)非共價(jià)鍵或非離子鍵與其他細(xì)胞壁多糖松散結(jié)合的果膠，CSP 通過(guò)離子鍵與細(xì)胞壁交聯(lián)，而NSP 一般指通過(guò)共價(jià)鍵與細(xì)胞壁多糖交聯(lián)的果膠組分。典型的果膠分子鏈中均具有多聚半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I 型（RGI）和鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ型（R-II）三個(gè)主要部分[8]。果膠分子結(jié)構(gòu)特征包括分子量、中性糖組分及含量、分子線性（或支鏈數(shù)量）、甲基和乙?；考磅セ植记闆r等。果蔬在預(yù)處理和干燥等加工過(guò)程均會(huì)對(duì)上述果膠分子特征產(chǎn)生作用進(jìn)而改變其分子自身特性，從而影響果蔬制品品質(zhì)。Divyani 等[9]應(yīng)用超聲波輔助提取柑橘中的果膠，發(fā)現(xiàn)超聲波作用改善了果膠的理化特性。Zhang 等[10]研究表明，超聲處理顯著降低了蘋(píng)果果膠的重均分子量，但未改變?cè)摴z的一級(jí)結(jié)構(gòu)。Huang 等[11]發(fā)現(xiàn)超聲處理后的蘋(píng)果脆片中水溶性果膠增加而原果膠含量減少，最終影響產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。Yu 等[12]研究表明不同品種蘋(píng)果干中果膠含量和結(jié)構(gòu)的變化不僅影響干制品質(zhì)構(gòu)，對(duì)其色澤也會(huì)產(chǎn)生影響。張鐘元等[13]發(fā)現(xiàn)真空微波干燥過(guò)程中細(xì)胞壁果膠酯化度和水溶性果膠含量的變化會(huì)影響南瓜脆片脆度和多孔結(jié)構(gòu)的形成。

如上所述，超聲處理和干燥過(guò)程能夠改變果蔬細(xì)胞壁果膠多糖特性，進(jìn)而影響果蔬干制品品質(zhì)。然而，關(guān)于葡萄中果膠組分在超聲作用下的變化趨勢(shì)還不明確。因此，本研究采用不同超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)葡萄進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)咔唑硫酸法、PMP 柱前衍生化法、高效液相凝膠色譜分析、掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜分析和圓二色譜分析等手段分析其中細(xì)胞壁果膠組分含量、單糖組成及含量、分子量及結(jié)構(gòu)變化，研究不同超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠特性的影響，為進(jìn)一步探討葡萄干制品品質(zhì)變化提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮葡萄 品種：夏黑，購(gòu)于南京市孝陵衛(wèi)集貿(mào)市場(chǎng)（夏季7～9 月份），果實(shí)完整、成熟度及大小一致；無(wú)水乙醇、丙酮、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、氯仿、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉 分析級(jí)，西隴化工股份有限公司；甲醇、乙腈 色譜級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、單糖（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、半乳糖）標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；1，2-環(huán)己二胺四乙酸（CDTA）麥克林公司。

BSA-423S 型電子天平 上海精密儀器儀表有限公司；HZQ-F100 型全溫度振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；FD-1A-50 型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ-S1000VDE 型三頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-6300 型紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；1200 型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；EVO-LS10 型掃描電子顯微鏡 德國(guó)卡爾蔡司股份公司；Nicolet iS50 型傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 有限公司；Jasco-810 型圓二色譜儀 日本Jasco 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同超聲預(yù)處理方式 預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，低于80 ℃的溫度變化對(duì)葡萄中細(xì)胞壁果膠組分影響較小，因此本實(shí)驗(yàn)中固定溫度55 ℃，以不同超聲功率和超聲時(shí)間開(kāi)展葡萄細(xì)胞壁果膠組分變化的研究，具體超聲參數(shù)如下：

不同超聲處理時(shí)間：超聲頻率45 kHz、功率900 W，對(duì)稱(chēng)取相應(yīng)質(zhì)量的葡萄分別進(jìn)行20、30、40 和50 min的超聲處理；

不同超聲處理功率：超聲頻率45 kHz、時(shí)間30 min，對(duì)稱(chēng)取相應(yīng)質(zhì)量的葡萄分別在700、800、900 和1000 W 功率下進(jìn)行超聲處理。

以上超聲處理樣品均同時(shí)以未處理的葡萄樣品作為對(duì)照。

1.2.2 葡萄細(xì)胞壁醇不溶物性物質(zhì)（AIR）提取 細(xì)胞壁醇不溶性物質(zhì)的提取參考文獻(xiàn)[14]并稍作修改。稱(chēng)取超聲處理后葡萄樣品100 g，剪碎研磨后加入300 mL 95%乙醇，均質(zhì)10 min 后過(guò)濾，隨后向?yàn)V渣中加入200 mL 95%乙醇，均質(zhì)10 min 后過(guò)濾，再向?yàn)V渣中加入200 mL 丙酮，置于培養(yǎng)箱中振蕩（37 ℃，150 r/min）處理5 min 后過(guò)濾，收集濾渣于40 ℃干燥箱中干燥16 h，獲得干燥的乙醇不溶物（AIR），置于干燥器中待進(jìn)一步分析使用。

1.2.3 不同果膠組分的提取 3 種果膠組分的提取參考文獻(xiàn)[15-16]中的方法。具體為：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g AIR 溶解于200 mL 沸水中，混合10 min 后冷卻過(guò)濾，將濾液透析72 h，冷凍干燥獲得WSP 組分。濾渣待進(jìn)一步使用。

將WSP 濾渣溶解于200 mL 0.05 mol/L CDTA（含0.1 mol/L 醋酸鈉，pH6.5）溶液中，于28 ℃下振蕩后過(guò)濾，將濾液經(jīng)過(guò)3500 kDa 透析袋透析72 h，冷凍干燥獲得CSP 組分，濾渣待進(jìn)一步使用。

將CSP 殘?jiān)芙庥?00 mL 0.05 mol/L 碳酸鈉（0.02 mol/L 硼氫化鈉）溶液中，在4 ℃條件下靜置提取16 h 后于28 ℃水浴振蕩器中振蕩6 h 后過(guò)濾。將濾液透析72 h，最后冷凍干燥獲得NSP 組分。

1.2.4 果膠中半乳糖醛酸與單糖含量測(cè)定 果膠半乳糖醛酸含量測(cè)定采用咔唑硫酸法[17]，本實(shí)驗(yàn)中獲得的半乳糖醛酸含量標(biāo)曲為y=0.0059x+0.0494（R2=0.994）。

采用PMP 柱前衍生化法測(cè)定不同果膠中的單糖含量，具體參考武忠偉等[18]的方法。以水溶性果膠為例，步驟為：準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg WSP 干燥樣品，用蒸餾水配成10 mg/mL 溶液，取100 μL 與100 μL 4 mol/L三氟乙酸（TFA）混勻并充氮封管，在110 ℃條件下水解4 h；冷卻后加入適量甲醇并減壓蒸干獲得水解物。然后將水解物溶于100 μL 蒸餾水中，加入100 μL 5 mol/L PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮）甲醇溶液和100 μL 0.6 mol/L 氫氧化鈉溶液，混合均勻，于70 ℃水浴鍋中反應(yīng)100 min，冷卻至室溫加入鹽酸（0.45 mL 0.3 mol/L）于50 ℃減壓蒸干，加入1 mL 蒸餾水溶解，并加入2 mL 氯仿混合，充分搖晃，待其分層后收集水層；以上過(guò)程重復(fù)三次。最后采用0.45 μm 水系膜過(guò)濾待測(cè)。

色譜條件為：Agilent 1100 高效液相色譜儀；RPC18柱（4.6×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相比例83:17（v/v）的0.1 mol/L PBS（pH6.7）和乙腈；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

獲得的單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：鼠李糖：y=7014.7x-123.98（R2=0.9978），阿拉伯糖：y=7712.9x-59.594（R2=0.9999），半乳糖：y=8420.5x-512.93（R2=0.9993），葡萄糖：y=8384.2x-1052（R2=0.9987），葡萄糖醛酸：y=7453.4x-104.39（R2=0.9994），甘露糖：y=8289.2x+7.0（R2=0.9995）。

1.2.5 果膠分子量測(cè)定 采用高效液相凝膠滲透色譜法[19]分析3 種果膠組分的分子量。稱(chēng)取干燥后的果膠樣品3.0 mg，用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液將其配制為3 mg/mL 的果膠溶液。液相色譜條件：色譜柱tsl-gel G3000SWXL，RID 示差檢測(cè)器，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為含0.1 mol/L Na2SO4的0.01 mol/L 磷酸鹽（pH=6.8）溶液，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（lg Mw=-0.2419x+9.6895，x 為出峰時(shí)間，R2為0.99）計(jì)算3 種果膠的分子量。

1.2.6 掃描電子顯微鏡觀察 采用掃描電子顯微鏡觀測(cè)不同果膠組分顆粒的微觀形貌結(jié)構(gòu)。將少量果膠粉末粘在樣品座的膠帶上，在儀器內(nèi)進(jìn)行真空鍍膜以及噴鍍電導(dǎo)層，在10 kV 電壓下放大50 倍對(duì)果膠的微觀形貌進(jìn)行觀察。

1.2.7 傅里葉紅外光譜分析 采用Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)干燥的不同果膠組分粉末進(jìn)行紅外光譜掃描分析其結(jié)構(gòu)特征，掃描范圍為500～4000 cm-1。每次掃描均用空氣光譜進(jìn)行背景矯正，每次測(cè)定結(jié)束時(shí)需使用75%甲醇擦拭晶體。

1.2.8 圓二色譜分析 圓二色譜分析方法參考文獻(xiàn)[20]。具體參數(shù)為：波長(zhǎng)190～260 nm，掃描速度50 nm/min，反應(yīng)時(shí)間4 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。分別采用Origin 9.0 軟件作圖，采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析和方差分析，Ducan 檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析（顯著水平P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠含量的影響

半乳糖醛酸（GalA）為果膠多糖的線性主鏈，是其最主要的成分，一般以半乳糖醛酸含量（mg/g AIR）表示果膠含量。不同超聲時(shí)間和超聲功率下葡萄細(xì)胞壁果膠含量的變化如圖1 所示，新鮮葡萄果膠組分中NSP 含量占比最高，為27.41 mg/g AIR。不同超聲時(shí)間處理后葡萄中果膠組分發(fā)生顯著變化（P<0.05）。隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，總果膠含量呈下降趨勢(shì)；WSP 含量先上升后下降；CSP 含量逐漸降低，30、40 和50 min 處理之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；NSP 含量與CSP 具有相同變化趨勢(shì)；不同超聲功率處理后葡萄中果膠組分同樣發(fā)生顯著變化（P<0.05）。隨著超聲處理功率的增強(qiáng)，總果膠含量呈下降趨勢(shì)；WSP 含量先上升后下降；CSP 含量逐漸降低；NSP含量先下降后上升。超聲處理900 W 時(shí)，WSP 含量下降，NSP 含量增加。原因可能是此條件下果膠組分中形成了特殊的（碳酸鈉可溶）酯鍵[21]，使水溶性果膠向不溶性果膠轉(zhuǎn)化。綜上可知，超聲處理時(shí)間和超聲功率能夠使CSP 和NSP 含量降低，WSP 含量增加。這是因?yàn)楣z組分中通過(guò)離子鍵和共價(jià)鍵與細(xì)胞壁多糖連接的部分在超聲處理過(guò)程中向松散連接的組分轉(zhuǎn)化[21]。預(yù)處理后WSP 含量的增多是造成原料質(zhì)地變軟的主要原因。因此，考慮到超聲作用下總果膠與不同組分含量變化和葡萄原料質(zhì)地特性，選擇超聲時(shí)間30 min、超聲功率900 W 更能維持葡萄原料及干燥加工后產(chǎn)品品質(zhì)。

圖1 不同超聲時(shí)間和超聲功率下葡萄細(xì)胞壁果膠含量變化Fig.1 Changes of pectin in grape cell wall at different ultrasonic times and ultrasonic powers

2.2 不同超聲處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠單糖含量的影響

2.2.1 不同超聲處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠單糖含量的影響 果膠及其降解產(chǎn)物的單糖組成及含量可用來(lái)預(yù)測(cè)果膠溶液鏈構(gòu)象的變化[22]。表1 為不同超聲時(shí)間處理后葡萄中細(xì)胞壁不同果膠組分單糖組成及含量。由表可知，未經(jīng)超聲處理葡萄三種果膠中均含有鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖，且不同果膠主要單糖組成和含量不同；其中WSP 中半乳糖和阿拉伯糖含量較高，CSP 中葡萄糖醛酸含量最多，而NSP 中鼠李糖含量最高。除上述4 種中性糖外，WSP中還包括甘露糖和葡萄糖，其中葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖含量占總含量的85%以上；NSP 中也含有葡萄糖，且鼠李糖、葡萄糖和半乳糖3 種糖含量占總含量的86%左右。

經(jīng)過(guò)不同超聲時(shí)間處理后，果膠組分中的單糖種類(lèi)無(wú)變化，但含量發(fā)生不同程度變化。隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，WSP 中鼠李糖含量增加，其余糖含量均呈下降趨勢(shì)，鼠李糖含量增加了63%，半乳糖含量由2.10 mg/g AIR 下降至1.42 mg/g AIR，阿拉伯糖含量由1.82 mg/g AIR 下降至1.02 mg/g AIR；CSP中鼠李糖和半乳糖含量先增加后減少，葡萄糖醛酸和阿拉伯糖呈下降趨勢(shì)，其中葡萄糖醛酸含量下降了12%左右；NSP 中半乳糖和阿拉伯糖先降低后增加，鼠李糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖呈下降趨勢(shì)，其中鼠李糖含量下降了21%左右。進(jìn)一步說(shuō)明水不溶性果膠在一定超聲時(shí)間作用下會(huì)向水溶性果膠轉(zhuǎn)化，從而增加了其中單糖含量。

不同超聲功率處理后葡萄中細(xì)胞壁不同果膠單糖組成及含量變化如表2 所示。由表2 可知，不同超聲功率處理后3 種果膠組分的單糖種類(lèi)無(wú)變化，含量整體呈下降趨勢(shì)。與超聲處理時(shí)間變化不同，隨著超聲功率的增加，WSP 中鼠李糖含量呈下降趨勢(shì)，降低了33%左右；CSP 中鼠李糖含量在超聲1000 W時(shí)顯著增加（P<0.05），由0.06 mg/g AIR 升高至0.13 mg/g AIR；NSP 中半乳糖和阿拉伯糖含量降低，鼠李糖含量在超聲處理1000 W 時(shí)顯著降低（P<0.05），降低了72%。以上結(jié)果表明高功率超聲作用更能使果膠分子鏈側(cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

2.2.2 不同超聲處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠組分糖比率的影響 通過(guò)3 種糖比率的計(jì)算可獲得果膠多糖的相關(guān)結(jié)構(gòu)信息，糖比率1 表示果膠組分的線性關(guān)系，與果膠的同型半乳糖醛酸（HG）結(jié)構(gòu)域有關(guān)；糖比率2 表示鼠李糖半乳糖聚糖Ⅰ型和Ⅱ型（RG）部分占果膠多糖的比例；糖比率3 表示鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I 型（RG-I）部分的支鏈程度[23]。由表1 和表2 可知，在WSP 中糖比率3 最高，說(shuō)明葡萄中水溶性果膠多以RG 鏈結(jié)構(gòu)存在，且支鏈程度較高；在NSP 中糖比率1 最高，是三個(gè)組分中線性程度最高的，其結(jié)構(gòu)域應(yīng)以HG 為主；而在CSP 中，其糖比率1 高于WSP，糖比率3 較WSP 低，故CSP 線性程度較WSP高，支鏈程度較NSP 高。

如表1 所示，隨著超聲時(shí)間的增加，三種果膠組分糖比率2 變化不明顯，表明果膠主鏈結(jié)構(gòu)未改變；WSP 的糖比率1 逐漸增大、NSP 的糖比率1 逐漸減小，說(shuō)明二者的半乳糖醛酸含量為前者增多、后者逐漸減少，與2.1 中果膠含量變化一致；糖比率3 呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，說(shuō)明果膠側(cè)鏈中性糖與主鏈分離，發(fā)生斷裂。由表2 可知，與表1 中糖比率變化趨勢(shì)相似，隨著超聲功率的增加，WSP 的糖比率1 呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)；CSP 的糖比率1 逐漸增大，糖比率3 逐漸減少；NSP 中糖比率1 先減少后增大，糖比率3 逐漸減少。由此可知，不同超聲處理均會(huì)對(duì)3 種果膠產(chǎn)生影響，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)域發(fā)生一定變化。

2.3 不同超聲處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠組分分子量的影響

分子量是果膠結(jié)構(gòu)特性之一，與其性質(zhì)相關(guān)聯(lián)。不同超聲處理后葡萄細(xì)胞壁多糖三種果膠組分的分子量分布如圖2 所示。由圖可知，三種果膠組分具有相似的尺寸排阻色譜圖，每種果膠包含2～3個(gè)大分子聚合物，其中最高峰對(duì)應(yīng)高分子量果膠聚合物。因樣品處理批次不同，不同超聲功率處理后果膠組分的色譜圖與不同超聲時(shí)間處理后的有些偏差，但對(duì)結(jié)果分析無(wú)影響。不同超聲時(shí)間和超聲功率處理后，三種果膠組分的出峰時(shí)間基本無(wú)變化，說(shuō)明從色譜圖出峰時(shí)間無(wú)法區(qū)分果膠分子量的明顯變化。

經(jīng)計(jì)算，不同超聲時(shí)間和超聲功率處理后3 種果膠組分分子量如表3 所示。由表可知，超聲處理前3 種果膠分子量大小順序?yàn)镹SP>CSP>WSP。不同超聲時(shí)間處理后葡萄中不同果膠分子量發(fā)生了顯著變化（P<0.05），隨著超聲處理時(shí)間的增加，不同果膠的分子量整體均呈下降趨勢(shì)，其中WSP 與CSP分子量變化趨勢(shì)相同，均先減小，在超聲處理40 min時(shí)略微增加；NSP 分子量逐漸減少，在超聲處理30 min 后無(wú)顯著性差異（P>0.05）。不同超聲功率處理后不同果膠分子量同樣發(fā)生顯著變化（P<0.05）；隨著超聲功率的增加WSP 與NSP 分子量變化趨勢(shì)相同，均逐漸較少；CSP 分子量先降低后增加，功率900 W后又逐漸下降。綜上，超聲處理下葡萄細(xì)胞壁多糖中的3 種果膠分子量有降低，說(shuō)明超聲作用可使果膠分子發(fā)生解聚。

2.4 不同超聲處理下葡萄細(xì)胞壁果膠微觀結(jié)構(gòu)

掃面電鏡（SEM）觀察不同超聲時(shí)間和超聲功率處理后三種果膠的表觀形貌，以進(jìn)一步從微觀角度了解超聲對(duì)葡萄果膠組分的作用。本部分僅選擇了2 個(gè)超聲時(shí)間和超聲功率以驗(yàn)證不同果膠組分微觀結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。

不同超聲時(shí)間處理后果膠的微觀結(jié)構(gòu)如圖3 和圖4 所示，可知不同超聲時(shí)間和超聲功率處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠微觀形態(tài)具有較大影響，并且不同果膠組分在不同處理下呈現(xiàn)明顯不同的微觀結(jié)構(gòu)。超聲處理前WSP 呈現(xiàn)致密性、整體性，局部出現(xiàn)枝狀結(jié)構(gòu)；CSP 呈樹(shù)杈狀分枝和小片狀結(jié)構(gòu)，且相互疊加纏繞；NSP 表現(xiàn)出線狀和大片狀結(jié)構(gòu)，線狀結(jié)構(gòu)相互纏繞，片狀結(jié)構(gòu)有卷曲樣。如圖3 所示，隨著超聲時(shí)間的增加，3 種果膠微觀形態(tài)發(fā)生了明顯變化，WSP 出現(xiàn)顆粒狀和片狀卷曲樣結(jié)構(gòu)，CSP 觀察不到明顯的分枝結(jié)構(gòu)、出現(xiàn)相互連接的片狀結(jié)構(gòu)，NSP 中線狀結(jié)構(gòu)消失、呈大片狀結(jié)構(gòu)，質(zhì)地致密伴有孔洞裂紋。

圖3 不同超聲時(shí)間處理后三種果膠組分微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 SEM of three kinds of grape pectin under different ultrasonic time

圖4 不同超聲功率處理后三種果膠組分微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 SEM of three kinds of grape pectin under different ultrasonic power

因不同超聲時(shí)間處理時(shí)采用的超聲功率為800 W，故800 W 時(shí)果膠組分的微觀結(jié)構(gòu)與超聲處理30 min時(shí)為同一組圖。由圖4 可知，隨著超聲功率的增加，不同果膠組分呈現(xiàn)出與超聲時(shí)間變化不同的結(jié)構(gòu)；超聲功率1000 W 時(shí)，WSP 出現(xiàn)明顯的線狀和片狀結(jié)構(gòu)，并相互交叉在一起；CSP 中大片狀結(jié)構(gòu)增多，樹(shù)杈狀分枝結(jié)構(gòu)變少；NSP 由大片狀結(jié)構(gòu)變?yōu)楹苄〉钠瑺?、甚至顆粒狀結(jié)構(gòu)。原因可能是超聲波產(chǎn)生多種效應(yīng)導(dǎo)致果膠結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的斷裂。

2.5 不同超聲處理對(duì)三種果膠組分官能團(tuán)的影響

采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）可對(duì)果膠多糖的主要官能團(tuán)進(jìn)行分析。不同超聲條件處理下葡萄細(xì)胞壁果膠組分的紅外光譜如圖5 所示。在3 種果膠組分的紅外光譜中，均觀察到3200 與3400 cm-1之間強(qiáng)而寬的峰，代表了果膠分子內(nèi)-OH的伸縮振動(dòng)[24]；2920～2940 cm-1處的峰是由于C-H 基團(tuán)（CH、CH2和CH3等）的拉伸和彎曲振動(dòng)引起，1010～1020 cm-1處的峰可能與果膠中的單糖有關(guān)。WSP和CSP 的光譜中，在1740 和1600 cm-1處觀察到果膠中酯化羧基及游離羧基的峰[25-26]，這可能是由于果膠羧羰基和酯羰基中C=O 的伸縮振動(dòng)。WSP 和CSP 光譜中這兩個(gè)峰的強(qiáng)度存在差別，歸因于兩者酯化度的不同。在NSP的紅外光譜出現(xiàn)了游離羧基相關(guān)的峰，而未觀察到酯化羧基的峰。不同超聲時(shí)間和超聲功率處理后，三種果膠的紅外光譜圖基本無(wú)差異，說(shuō)明超聲處理對(duì)WSP、CSP 和NSP 的主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。

2.6 不同超聲處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠組分分子鏈構(gòu)象的影響

圓二色譜可對(duì)含有糖醛酸、羧酸基團(tuán)和酰胺發(fā)色團(tuán)的多糖構(gòu)象轉(zhuǎn)變進(jìn)行直觀分析。研究表明，果膠分子鏈上的羧基（COO-）基團(tuán)n-π*會(huì)發(fā)生遷移，其在圓二色譜波長(zhǎng)210 nm 附近會(huì)有積極響應(yīng)。這是因?yàn)轸然l(fā)色團(tuán)的光學(xué)活性可能受到分子內(nèi)和分子間相互作用的影響[27-28]。不同超聲時(shí)間處理后葡萄細(xì)胞壁3 種果膠組分的圓二色譜如圖6 所示。WSP在210～211 nm 處有明顯的倒峰，在230～245 nm 范圍內(nèi)有正響應(yīng)值，表明水溶性果膠有典型的圓二光譜特征；不同超聲時(shí)間處理后WSP 分子鏈構(gòu)象基本無(wú)變化，不同超聲功率處理后其正吸收峰有左移。CSP 的譜圖中僅表現(xiàn)出在210～220 nm 范圍內(nèi)的正響應(yīng)，與WSP 相同，不同超聲功率處理后CSP 最高響應(yīng)值發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)10～15 nm 的右移，可能是超聲功率使其分子鏈構(gòu)象發(fā)生變化。NSP 圓二色譜圖與WSP 相反，在210 nm 處吸收不明顯，但在230～240 nm 范圍內(nèi)有積極響應(yīng)，且隨著超聲時(shí)間和超聲功率的增加，NSP 的最高響應(yīng)逐漸向左移動(dòng)，說(shuō)明超聲處理對(duì)其分子鏈構(gòu)象產(chǎn)生影響。

圖6 不同超聲時(shí)間和超聲功率處理后三種果膠組分圓二色譜圖Fig.6 CD of three kinds pectin under different ultrasonic time and ultrasonic power

3 討論與結(jié)論

新鮮葡萄細(xì)胞壁果膠中NSP 含量占比最高，CSP 含量最低，這與Wang 等[29]報(bào)道的無(wú)籽葡萄中細(xì)胞壁組分含量結(jié)果一致。超聲處理后，葡萄細(xì)胞壁中總果膠含量呈下降趨勢(shì)，三種果膠組分均發(fā)生顯著變化（P<0.05）；與超聲處理前樣品相比，超聲處理使WSP 含量增加，CSP 和NSP 含量降低。郭怡廷等[21]發(fā)現(xiàn)超聲協(xié)同熱處理下胡蘿卜細(xì)胞壁果膠組分有相同變化趨勢(shì)。原因可能是超聲作用下果膠組分中的離子鍵和共價(jià)鍵與其他胞壁多糖連接的部分向松散連接的組分轉(zhuǎn)化，即CSP 和NSP 轉(zhuǎn)化為WSP。WSP含量的增加會(huì)使葡萄質(zhì)地軟化，但當(dāng)超聲功率900 W時(shí)，WSP 含量降低，該功率條件下果膠組分中能夠形成特殊的（碳酸鈉可溶）酯鍵[21]，使水溶性果膠向不溶性果膠轉(zhuǎn)化，阻止了原料的進(jìn)一步軟化。

不同超聲時(shí)間和超聲功率處理后葡萄細(xì)胞壁果膠組分的單糖組成無(wú)變化，但各單糖含量有顯著差異（P<0.05）。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和超聲功率的增加，與分子鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)糖的變化與上述果膠含量變化具有相關(guān)性。糖比率的變化進(jìn)一步說(shuō)明超聲處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁果膠的主鏈結(jié)構(gòu)無(wú)影響，但顯著改變了分子側(cè)鏈和支鏈程度。

不同超聲處理后葡萄細(xì)胞壁果膠組分分子量整體呈下降趨勢(shì)，這與Zhang 等[30]、Bagherian 等[31]采用超聲處理柑橘果膠和葡萄柚果膠中的結(jié)果一致。超聲波的機(jī)械效應(yīng)能夠破壞果膠結(jié)構(gòu)交聯(lián)和基質(zhì)重組，從而使其表面更光滑。不同超聲時(shí)間和功率處理后使葡萄細(xì)胞壁中3 種果膠在形貌上呈現(xiàn)出更加松散形態(tài)，且表面相對(duì)光滑。Divyani 等[9]發(fā)現(xiàn)柑橘果膠經(jīng)超聲處理后其結(jié)構(gòu)也由原來(lái)的粗糙渾濁變得緊密光滑。

傅里葉變換紅外光譜結(jié)果表明，超聲時(shí)間和功率的變化對(duì)3 種果膠組分的特征官能團(tuán)影響較小。3 種果膠均具有典型的圓二光譜特征，不同超聲時(shí)間使NSP 最高響應(yīng)值向左移動(dòng)，而不同超聲功率作用3 種果膠吸收峰均發(fā)生顯著變化，說(shuō)明超聲處理使果膠的分子鏈構(gòu)象產(chǎn)生變化。仇雯漪等[22]發(fā)現(xiàn)超聲波的空化作用能夠破壞果膠分子間和分子內(nèi)的氫鍵，從而使其分子鏈構(gòu)象從剛性半柔順鏈到柔順鏈轉(zhuǎn)變。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)超聲作用能夠顯著降低總果膠含量及不同果膠組分單糖含量，并且不同結(jié)構(gòu)的果膠組分變化不同，結(jié)構(gòu)緊密的葡萄細(xì)胞壁水不溶性果膠可向水溶性果膠轉(zhuǎn)化。不同超聲處理后3 種果膠組分在微觀層面可觀察到明顯差異，在結(jié)構(gòu)層面僅發(fā)現(xiàn)超聲功率作用更可能使CSP 和NSP 分子鏈構(gòu)象發(fā)生變化。該結(jié)果可為超聲作用下葡萄果膠的變化研究提供參考。另外，果膠結(jié)構(gòu)復(fù)雜，僅采用傅里葉紅外光譜及圓二色譜技術(shù)較難對(duì)其分子鏈結(jié)構(gòu)及具體變化進(jìn)行詳細(xì)分析。因此，在后續(xù)研究中，作者應(yīng)進(jìn)一步從微觀角度和結(jié)構(gòu)層面分析超聲處理對(duì)葡萄細(xì)胞壁3 種果膠組分作用，通過(guò)與化學(xué)及分子模擬等手段結(jié)合，研究超聲對(duì)果膠分子鏈構(gòu)象及側(cè)鏈、支鏈變化的影響，同時(shí)分析超聲處理后葡萄干制品品質(zhì)變化，進(jìn)而探討果膠組分變化與葡萄干制品品質(zhì)形成的關(guān)系，以期為葡萄加工產(chǎn)品的研發(fā)提供理論指導(dǎo)和研究思路。