兩歧雙歧桿菌FL-228.1 增強小鼠先天免疫功能研究

周 瑜，田曉英，崔慶宇，張 喆，公丕民，林 凱，易華西，劉同杰，張?zhí)m威

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266000）

免疫系統(tǒng)包括先天免疫和適應(yīng)性免疫，在預(yù)防、控制感染和維持機體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[1]。先天免疫系統(tǒng)的缺陷可導(dǎo)致無法識別病原體和迅速激活免疫反應(yīng)，從而容易發(fā)生嚴重或復(fù)發(fā)性感染[2]。作為人體先天免疫防御戰(zhàn)線的重要成員，巨噬細胞幾乎存在于所有組織中，其主要功能是吞噬細胞碎片和外來病原體，并且活化的巨噬細胞可以分泌細胞因子和趨化因子，從而招募和激活其他免疫細胞[3-4]。自然殺傷（Natural killer，NK）細胞是細胞毒性淋巴細胞的一員，但與T 細胞不同，NK 細胞可以直接識別和解決病毒感染，并在沒有預(yù)先刺激的情況下自發(fā)地裂解腫瘤細胞[5]。此外，潘氏細胞可以產(chǎn)生、儲存和分泌多種抗菌肽（Antimicrobial peptide，AMP），包括α-防御素（在小鼠中稱為Cryptdins）、Cathelicidins（在小鼠中稱為Cathelin-related antimicrobial peptide，CRAMP）和再生胰島衍生蛋白3γ（Regenerating islet-derived protein 3 gamma，RegIII-γ）等[6]?？傮w而言，這些免疫細胞和免疫分子作為先天免疫的重要組成部分，參與了宿主抵抗外部病原體入侵的第一道防線。

益生菌是活的微生物，當給予適當劑量時，會對宿主的健康有益[7]。它們可以提高免疫力，是良好的免疫激活劑[8]。研究表明，益生菌能通過提高NK 細胞活性、調(diào)節(jié)淋巴細胞亞群和細胞因子的表達等途徑改善老年人的免疫力[9]。然而，目前益生菌對普通人群免疫功能的作用還存在爭議，且效果上具有菌株和個體差異性。Shida 等[10]研究發(fā)現(xiàn)每日攝入干酪乳酪桿菌LcS 能降低健康中年上班族的上呼吸道感染率和持續(xù)時間。但在健康女性醫(yī)護人員中，補充保加利亞乳桿菌OLL1073R-1 發(fā)酵的酸奶沒有顯示出對流感的顯著預(yù)防作用或NK 細胞活性的增強[11]。同時，益生菌調(diào)節(jié)免疫功能作用機制尚不清晰，且目前多集中于體外研究。如Rocha-Ramírez 等[12]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌在體外以TLR2 依賴的方式刺激人源巨噬細胞中促炎細胞因子的表達并促進其對病原體的吞噬作用和殺菌活性。

因此，本文結(jié)合體外篩選和體內(nèi)驗證，探究了潛在功能菌株在正常個體中的免疫調(diào)節(jié)作用，并對效果較好的兩歧雙歧桿菌FL-228.1 的作用機制進行初步探討。首先借助RAW264.7 細胞和人外周血單核細胞（PBMCs），從8 株菌中篩選出最具先天免疫調(diào)節(jié)潛力的菌株并進一步在正常小鼠體內(nèi)從免疫細胞活性、細胞因子和免疫分子抗菌肽的表達等方面綜合評價其對先天免疫系統(tǒng)的影響并對可能的作用機制進行探討，以期為益生菌作為免疫增強食品的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

RAW264.7 細胞、K562 細胞、YAC-1 細胞 中國科學(xué)院細胞庫；BALB/c 雌性6 周齡小鼠 北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2021-0006；實驗所用菌株：兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum）FL-228.1 和動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalissubsp.animalis）F1-7 來源于健康嬰兒糞便；副干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）K14、X11，鼠李糖乳酪桿菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）MN45、FN518 和植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）FWDG 來源于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品；陰道乳桿菌（Lactobacillus vaginalis）MN11 來源于產(chǎn)道拭子 保藏于中國海洋大學(xué)功能性乳品與益生菌工程實驗室；干酪乳酪桿菌LC（Lacticaseibacillus casei）從市面上有增強免疫力功能的產(chǎn)品中分離；MRS 液體培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、SDS 溶液、刀豆蛋白A（ConA）、臺盼藍染色液、PBS 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；中性紅染色液、青霉素-鏈霉素混合溶液、TritonX-100上海碧云天生物技術(shù)有限公司；特級胎牛血清BI 生物科技公司；Ficoll-Hypaque 分離液 天津灝洋生物科技有限公司；Trizol 裂解液 南京諾唯贊生物科技有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 東洋紡生物科技有限公司；TNF-α、IL-10、IL-12、IFN-γ和IgG 試劑盒 蘇州卡爾文生物科技有限公司。

LRH-250 生化培養(yǎng)箱 上海一恒儀器有限公司；MW80 二氧化碳培養(yǎng)箱 上海皓莊儀器有限公司；VARIOSKAN FLASH 全波長多功能酶標儀、NanoDrop2000 超微量分光光度計 賽默飛世爾科技公司；BIO-RAD CFX96 實時熒光定量PCR 儀美國BIO-RAD 公司；TP600PCR 擴增儀 寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；TG20KR-D 高速冷凍離心機 長沙東旺實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 實驗所用菌株儲存在-80 ℃冰箱，室溫解凍后按1%（v/v）接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。取活化第三代的菌株在4 ℃，8000 r/min 下離心10 min，收集菌體，用PBS 緩沖液洗滌三次，最后用PBS（動物實驗）或細胞培養(yǎng)基（細胞實驗）重懸至實驗所需濃度，其中以LC 作為參考菌株。

1.2.2 PBMCs 分離培養(yǎng) 從10 名18～30 歲的健康志愿者中抽取空腹血樣，得到了所有受試者的知情同意。使用Ficoll 密度梯度離心法分離PBMCs[13]，將得到的細胞進行臺盼藍染色，當PBMCs 活力大于95%時，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 RAW264.7 細胞吞噬活性測定 如前所述，采用中性紅法檢測巨噬細胞吞噬活性，并稍做修改[14]。用DMEM 高糖培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，以菌:細胞=10:1 的濃度培養(yǎng)細胞24 h 后，向每孔加入200 μL 1%中性紅染色液。繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h 后用PBS 洗滌三次，每孔加入200 μL 裂解液（冰醋酸:無水乙醇體積比為1:1），4 ℃靜置過夜，用酶標儀測540 nm 下吸光度值。

1.2.4 NK 細胞活性測定 如前所述，采用乳酸脫氫酶釋放法檢測NK 細胞活性，并稍做修改[15]。用2×107CFU/mL 的菌懸液干預(yù)PBMCs 24 h。用RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)整K562 細胞濃度為2×105個/mL，按效靶比為50:1，將PBMCs（效應(yīng)細胞）和K562 細胞（靶細胞）各100 μL 加入U 型96 孔培養(yǎng)板，同時設(shè)自然釋放孔加靶細胞和含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基各100 μL，最大釋放孔加靶細胞和2.5%TritonX-100 各100 μL。37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)4 h，1500 r/min 離心5 min，每孔吸取100 μL 上清液，同時加入100 μL LDH 基質(zhì)液，反應(yīng)5 min，隨后每孔加入30 μL 1 mol/L 的HCL 溶液終止反應(yīng)，在490 nm處測OD 值，NK 細胞活性計算公式如下：

1.2.5 動物模型與分組 30 只BALB/c 小鼠在清潔級、12 h 光照/黑暗交替、（22±2）℃溫度、（55%±5%）相對濕度的動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨后被隨機分成3 組（n=10），分別為空白對照組（Control 組）、FL-228.1 干預(yù)組和LC 干預(yù)組，所有組別小鼠均喂食普通飼料。實驗按照中國科學(xué)技術(shù)部動物管理條例，并經(jīng)中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實驗動物倫理委員會批準（批準號：SPXY2021112402）。實驗設(shè)計為：空白對照組每天灌胃0.2 mL PBS，菌株干預(yù)組每天灌胃0.2 mL 菌懸浮液（5×108CFU/mL），實驗持續(xù)28 d。

1.2.6 小鼠血清及組織處理 小鼠禁食不禁水12 h，稱重，麻醉，眼球取血，室溫放置30 min 后3000 r/min離心15 min，小心吸取上層淡黃色血清分裝保存。取脾臟和胸腺，用生理鹽水清洗，濾紙吸干表面水分后稱重，分別計算脾臟和胸腺與小鼠體重的比值。

1.2.7 腹腔巨噬細胞吞噬活性測定 將5 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基注入腹腔，輕輕按壓2 min，提取腹腔液體到離心管中，1500 r/min 離心5 min。棄去上清液，調(diào)整濃度至1×106個/mL，培養(yǎng)24 h 后棄去液體，其余同1.2.3。

1.2.8 NK 細胞活性測定 取出小鼠脾臟，制成濃度為2×106個/mL 的脾細胞懸液作為效應(yīng)細胞。按效靶比為50：1，將脾細胞（效應(yīng)細胞）和YAC-1 細胞（靶細胞）各100 μL 加入U 型96 孔培養(yǎng)板，其余同1.2.4。

1.2.9 ConA 誘導(dǎo)的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 實驗方法如前所述[16]，將脾細胞懸液（5×106個/mL）接種到有/無75 μL ConA 作為T 細胞刺激劑的24 孔板中，培養(yǎng)68 h 后，每孔吸走0.7 mL 培養(yǎng)基，加入50 μL 5 mg/mL MTT 和0.7 mL 不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h 后，每孔加入1 mL 3% SDS 溶液溶解紫色晶體，用酶標儀測定570 nm 處OD 值。用有/無Con A 的OD 值之差代表轉(zhuǎn)化能力。

1.2.10 小鼠血清細胞因子和IgG 測定 用酶聯(lián)免疫吸附法按照試劑盒說明書檢測血清中TNF-α、IL-10、IL-12、IFN-γ和IgG 的含量。

1.2.11 RT-PCR 檢測抗菌肽相關(guān)基因的mRNA 表達 利用RT-PCR 方法，加入Trizol 裂解液從回腸組織中提取總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA單鏈后進行qPCR 操作。所用引物委托上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成，序列如表1 所示，2-ΔΔCt用于計算基因表達的倍數(shù)。

表1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的引物序列Table 1 Primer sequences of reverse transcription polymerase chain reaction

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均至少重復(fù)3 次，結(jié)果均用平均值±標準差形式表示，數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，組間差異檢驗采用Duncan 檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)圖采用Prism 8.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株干預(yù)對先天免疫細胞活性的影響

2.1.1 不同菌株干預(yù)對RAW264.7 細胞吞噬活性的影響 RAW264.7 細胞來源于具有巨噬細胞特性的BALB/c 小鼠細胞，其被認為是體外研究巨噬細胞功能的合適模型[17]。因此，在本研究中，通過中性紅法檢測不同菌株干預(yù)對RAW 264.7 細胞吞噬作用的影響。結(jié)果如圖1A 所示，與空白組相比，用不同菌株處理的RAW264.7 細胞吞噬活性均顯著提高，增長超過51.11%，其中FL-228.1、FWDG、FN518、X11 和MN45 表現(xiàn)效果優(yōu)于LC 對照組（P<0.05）。與此相一致的是，Rocha-Ramírez 等[12]的研究也顯示所有菌株干預(yù)均能增強巨噬細胞的吞噬作用，但瑞士乳桿菌IMAU70129 和干酪乳酪桿菌IMAU60214 效果最優(yōu)，這表明不同菌株對巨噬細胞的吞噬作用具有差異性。

圖1 益生菌對RAW264.7 細胞吞噬活性和NK細胞活性的影響Fig.1 Effects of probiotics on phagocytic activity of RAW264.7 cells and NK cell activity

2.1.2 不同菌株干預(yù)對NK 細胞活性的影響 益生菌的免疫作用不僅限于腸道，已有研究發(fā)現(xiàn)益生菌干預(yù)能提高人外周血中NK 細胞活性[18]。本研究在PBMCs 中檢測不同菌株干預(yù)后人原代NK 細胞活性的變化，結(jié)果如圖1B 所示，與空白組相比，僅兩歧雙歧桿菌FL-228.1 和鼠李糖乳酪桿菌FN518 能顯著提高NK 細胞活性（P<0.05），增長超過51.2%，增強效果與LC 對照組相當，其具體作用機制尚需進一步研究，可能是通過促進細胞因子分泌進而刺激NK 細胞活化[19-20]。

2.2 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 干預(yù)小鼠調(diào)節(jié)先天免疫的效果

2.2.1 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠體重和免疫器官指數(shù)的影響 基于細胞實驗的結(jié)果，進一步進行動物實驗評價FL-228.1 在體內(nèi)調(diào)節(jié)先天免疫的效果。由表2 可知，實驗期間小鼠體重增長正常，各組間小鼠最終體重?zé)o顯著性差異（P>0.05），表明口服菌株FL-228.1 對動物生長安全性良好[21]。與空白組相比，各組小鼠的脾臟指數(shù)無明顯變化（P>0.05），F(xiàn)L-228.1干預(yù)可以顯著增加小鼠的胸腺指數(shù)（P<0.05）。而脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)是反映免疫器官發(fā)育的重要指標，其狀態(tài)直接影響機體免疫功能和抗病能力[22]，故口服FL-228.1 菌懸液可以促進胸腺發(fā)育。

表2 各組小鼠體重及臟器/體重比值的比較Table 2 Comparison of body weight and organ/body weight ratio of mice in each group

2.2.2 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性的影響 巨噬細胞的吞噬功能在某種程度上是免疫反應(yīng)中不可或缺的步驟[23]。由圖2A 可知，與空白組和LC 對照組相比，補充FL-228.1 能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性（P<0.05），增長超過一倍。Lee 等[24]研究表明這種增強作用是通過激活巨噬細胞表面TLR2 進而導(dǎo)致細胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）的活化所介導(dǎo)，據(jù)此推測FL-228.1 可能也是通過這種信號級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮免疫促進作用。

圖2 益生菌對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性、NK 細胞活性和脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effects of probiotics on phagocytic activity of peritoneal macrophages,NK cell activity and splenic lymphocyte transformation

2.2.3 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠NK 細胞活性的影響 NK 細胞來源于骨髓，主要存在于血液和淋巴組織，特別是脾臟中[25]。實驗結(jié)果如圖2B 所示，攝入FL-228.1 能顯著提高小鼠脾臟處NK 細胞對癌細胞的殺傷活性（P<0.05）。具體而言，當NK 細胞識別癌細胞后，會調(diào)動細胞毒性顆粒向免疫突觸移動并將其釋放到細胞間隙，破壞靶細胞完整性，進而誘導(dǎo)細胞凋亡[26]。Cheon 等[27]研究發(fā)現(xiàn)脫顆粒抑制劑刀豆素A 預(yù)處理能有效阻斷嗜酸乳桿菌La205 誘導(dǎo)的NK 細胞活性，故菌株FL-228.1 對NK 細胞活性的增強最終可能是通過促進NK 細胞的顆粒胞吐作用實現(xiàn)的。

2.2.4 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響 T 淋巴細胞受到Con A 刺激后會轉(zhuǎn)化為母細胞持續(xù)增殖[28]。當T 細胞表現(xiàn)出低活性或免疫缺陷時，其轉(zhuǎn)化率下降，免疫功能降低[29]。由圖2C可知，補充FL-228.1 可以顯著提高小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率（P<0.05），增強細胞介導(dǎo)的免疫。Ren 等[29]的實驗結(jié)果也顯示小鼠連續(xù)攝入1×108CFU 的植物乳植桿菌Lp 能顯著促進脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化，并且其所用劑量與本研究一致，表明補充特定菌株能對機體適應(yīng)性免疫產(chǎn)生積極作用。

2.2.5 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠血清細胞因子和IgG 的影響 先天免疫細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞，可以通過釋放大量的細胞因子和趨化因子與其他細胞產(chǎn)生聯(lián)系，從而協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)[30]。在本研究中檢測血清細胞因子變化，結(jié)果如圖3A～圖3D 所示，各組間TNF-α、IL-10、IL-12 和IFN-γ水平無顯著差異（P>0.05）。由于IL-10 與IL-12 的比值是確定免疫反應(yīng)方向的關(guān)鍵，而IL-10 和TNF-α的相對平衡對于控制免疫偏差至關(guān)重要[31]。因此推測這一實驗結(jié)果可能是攝入菌株后促炎細胞因子和抗炎細胞因子在外界刺激下保持平衡的結(jié)果，從而使機體在保持警惕的同時，不會產(chǎn)生過度的免疫反應(yīng)。先前的一項研究也有相似的發(fā)現(xiàn)，分別給每只小鼠灌胃5×108CFU 和1×109CFU 的植物乳植桿菌CGMCC1.557不會引起血清IL-10、IFN-α和IFN-γ含量的顯著變化[32]。IgG 是再次免疫應(yīng)答的主要抗體，也是唯一一種可以穿過胎盤保護胎兒的抗體，其存在于所有體液中[16]。由圖3E 可知，補充FL-228.1 后血清中IgG的含量顯著增加（P<0.05），進而提高小鼠體液免疫功能。

圖3 益生菌對小鼠細胞因子和IgG 的影響Fig.3 Effects of probiotics on cytokines and IgG in mice

2.2.6 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠抗菌肽相關(guān)基因mRNA 表達的影響 潘氏細胞是位于腸隱窩底部的小腸上皮細胞，其分泌的抗菌肽類似于分泌型免疫球蛋白A[33]。這些抗菌肽是真核生物中廣泛存在的重要先天免疫分子，其可以有效攻擊和殺滅潛在的有害微生物[34]。在本研究中，取小鼠末端回腸進行抗菌肽相關(guān)基因的檢測。結(jié)果如圖4 所示，與空白組相比較，補充FL-228.1 能夠顯著上調(diào)Cryptdin-4 和CRAMP 的基因表達（P<0.05），其增強效果與LC 對照組相當，但對RegIII-γ的mRNA 表達無顯著影響（P>0.05）。與此相反的是，Hrdy等[35]發(fā)現(xiàn)羅伊氏粘液乳桿菌而非動物雙歧桿菌可以顯著提高小鼠RegIII-γ的基因表達，但Cryptdin-4 的mRNA 水平無明顯變化。另有研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌LF4 通過TLR 和NLR 信號誘導(dǎo)腸上皮細胞中抗菌肽的基因上調(diào)[36]，這些研究表明菌株促進抗菌肽表達的效果具有差異性，而模式識別受體可能在此過程中發(fā)揮重要作用。

圖4 益生菌對小鼠回腸抗菌肽相關(guān)基因mRNA 表達的影響Fig.4 Effects of probiotics on mRNA expression of antimicrobial peptide-related genes in mouse ileum

3 結(jié)論

本研究通過體外細胞篩選和動物實驗得到一株在提高先天免疫細胞活性方面表現(xiàn)效果最好的兩歧雙歧桿菌FL-228.1，并從提高免疫細胞活性、調(diào)節(jié)細胞因子表達和促進免疫分子抗菌肽相關(guān)基因的上調(diào)等方面對其免疫調(diào)節(jié)能力進行了表征。本研究表明，兩歧雙歧桿菌FL-228.1 能調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)，同時對適應(yīng)性免疫具有積極影響，并使機體處于免疫平衡狀態(tài)而不產(chǎn)生過度反應(yīng)，這為益生菌作為免疫增強食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，未來具有廣泛的應(yīng)用前景。同時，本研究中兩歧雙歧桿菌FL-228.1 增強機體先天免疫力的具體作用機制還有待深入的研究。