桑黃營(yíng)養(yǎng)成分、活性成分及多糖性質(zhì)分析

劉錦程，弓志青，楊 鵬，王延圣，李永生，楊正友，王文亮,

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與營(yíng)養(yǎng)研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，山東濟(jì)南 250100）

桑黃又稱桑耳、桑臣或胡孫眼，在我國(guó)已有兩千多年的藥用歷史，是一類藥用真菌的統(tǒng)稱，其藥用價(jià)值在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《藥性論》、《本草綱目》等中醫(yī)學(xué)專著中都有記載[1-2]，具有“利五臟、排毒氣”等功效，可治療痢疾、血崩、崩漏帶下、閉經(jīng)、臍腹?jié)吹燃膊3]。近數(shù)十年來(lái)學(xué)者們對(duì)于桑黃這類真菌的分類屬性達(dá)成共識(shí)，認(rèn)為它們是擔(dān)子菌門（asidiomycota）蘑菇綱（Agaricomycetes）銹革菌目（Hymenochaetales）銹革菌科（Hymenochaetaceae）的大型多孔菌[4]。桑黃營(yíng)養(yǎng)豐富、具有保健功效，其營(yíng)養(yǎng)和藥效成分主要有粗纖維、粗蛋白、粗脂肪、多糖、酚類、黃酮類和萜類等[5]。多糖作為其主要活性成分，具有抗氧化[6-7]、抗腫瘤[8]、降血糖[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]和抗炎[11-12]等功能。

隨著人們的健康意識(shí)不斷增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)豐富且具有良好保健功效的藥用真菌不斷受到消費(fèi)者的歡迎，桑黃以較高的藥用價(jià)值受到了廣泛關(guān)注，成為產(chǎn)品開(kāi)發(fā)關(guān)注的焦點(diǎn)[13]。目前，桑黃在國(guó)外已被用于制造抗癌藥品、養(yǎng)顏保健品及抑制艾滋病的新藥[14]。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者研制出桑黃酒[15]、桑黃曲奇餅干[16]、桑黃茶[17]等一系列以桑黃或桑黃多糖為主要成分的產(chǎn)品，但市場(chǎng)上桑黃精深加工產(chǎn)品仍較少。不同桑黃子實(shí)體之間營(yíng)養(yǎng)成分、活性成分含量差異較大，其多糖活性也有所不同[18-19]，桑黃質(zhì)量難以控制，制約桑黃產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

為探尋不同桑黃子實(shí)體中營(yíng)養(yǎng)和活性成分含量差異，發(fā)掘具有更好生物活性的多糖，本研究選取5 種桑黃子實(shí)體，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)、活性成分進(jìn)行比較分析，并對(duì)優(yōu)良桑黃子實(shí)體的多糖進(jìn)行抗氧化能力及單糖組成分析，為桑黃優(yōu)良品種的篩選及多糖開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)，為開(kāi)發(fā)天然有效的抗氧化產(chǎn)品提供依據(jù)，為桑黃更好地應(yīng)用于食品、藥品、保健品和化妝品等領(lǐng)域提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑黃子實(shí)體（編號(hào)S-1、S-2、S-3、S-4、S-5）山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；香草醛、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物有限公司；重蒸酚、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）北京索萊寶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）北京酷來(lái)搏科技有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)。

JFM38 馬弗爐 JISHICO 公司；K9840 凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；SZF-06A 粗脂肪測(cè)定儀 上海新嘉電子有限公司；UV-6100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) METASH 公司；L550 離心機(jī)cence 公司；SynergyH1M 酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek 公司；Nicolet IS5 傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo 公司；1200 液相色譜儀 美國(guó)Agilent 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將5 種供試桑黃子實(shí)體于60 ℃烘箱中烘干，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80 目篩，收集粉末密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定 分別采用GB/T 5009.10-2003、GB 5009.5-2016（凱氏定氮法）、GB 5009.6-2016（索氏抽提法）和GB 5009.4-2016（食品中總灰分的測(cè)定）測(cè)定樣品粗纖維、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量。

1.2.3 多糖提取及含量測(cè)定 稱取各樣品適量，采用熱水浸提法，料液比1:20，提取溫度95 ℃，提取時(shí)間120 min，抽濾，重復(fù)上述操作1 次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后加入三倍體積95%乙醇，4 ℃醇沉20 h后凍干沉淀，得到粗多糖。沉淀用蒸餾水溶解，定容至250 mL，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y1=11.72X1-0.0256（R2=0.9979），得率按下式計(jì)算：

式中：W1表示桑黃子實(shí)體的質(zhì)量（g）；W2表示多糖的質(zhì)量（g）。

1.2.4 總黃酮、總酚、總?cè)坪繙y(cè)定 按照胡文繼[20]的方法進(jìn)行提取，采用AlCl3比色法[21]測(cè)定總黃酮含量，以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y2=3.1474X2-0.0.0061（R2=0.9996）；采用Folin-Ciocalteu 比色法[22]測(cè)定總酚含量，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y3=30.775X3+0.0245（R2=0.9985）；采用NY/T 3676-2020 測(cè)定總?cè)坪?，以齊墩果酸質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y4=2.2493X4-0.0054（R2=0.9986）。

1.2.5 多糖抗氧化能力測(cè)定

1.2.5.1 清除DPPH 自由基能力 取多糖溶液500 μL于2 mL 離心管中，按照Pan 等[23]報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)定，多糖樣品的最終反應(yīng)濃度為125 μg/mL?？瞻捉M用500 μL 蒸餾水代替樣品，對(duì)照組用500 μL 無(wú)水乙醇代替DPPH-乙醇溶液。按照公式（1）計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：A1表示樣品組吸光度平均值；A2表示對(duì)照組吸光度平均值；A0表示空白組吸光度平均值。

1.2.5.2 清除ABTS+自由基能力 取100 μL 多糖溶液于2 mL 離心管中，加入300 μL ABTS 工作液，參照連俊輝[24]的方法進(jìn)行測(cè)定，多糖樣品的最終反應(yīng)濃度為50 μg/mL。按照公式（1）計(jì)算ABTS+自由基清除率。

1.2.5.4 還原力 取200 μL 多糖溶液于2 mL 離心管中，多糖樣品的最終反應(yīng)濃度為500 μg/mL，參考張晨[26]的方法進(jìn)行測(cè)定，吸光度值數(shù)值越大還原力越強(qiáng)，對(duì)照組用蒸餾水代替三氯化鐵溶液，按照公式（2）計(jì)算還原力。

式中：A1表示樣品組吸光度平均值；A2表示對(duì)照組吸光度平均值。

1.2.6 分子生物學(xué)鑒定 對(duì)S-4 子實(shí)體提取基因組DNA，送至青島睿博興科公司進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）測(cè)序，將所得的ITS 序列與GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站中已知的序列進(jìn)行BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析，從中獲得與所得的ITS 序列具有相似同源性的序列，使用MEGA 7.0 軟件，采用NJ（Neighbor Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.7 目標(biāo)桑黃多糖抗氧化能力測(cè)定 根據(jù)反應(yīng)體系，將多糖以及VC分別配制成反應(yīng)濃度為3.125、6.25、12.5、50、100、200、400 μg/mL 的溶液體系，按照1.2.2 的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 多糖除蛋白 多糖樣品采用Sevag 法除蛋白[27-28]，棄掉有機(jī)相和蛋白層，保留水相層，重復(fù)脫蛋白操作至無(wú)蛋白層析出，經(jīng)活性炭脫色和透析后用于紫外光譜分析、FT-IR 分析和單糖組成分析。

1.2.9 紫外光譜分析 配制0.5 mg/mL 的多糖溶液，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～400 nm 范圍內(nèi)掃描[29]。

1.2.10 FT-IR 分析 取適量干燥多糖粉末混到一定量干燥KBr 粉末中磨樣，利用壓片機(jī)壓成片，用傅立葉變換紅外光譜儀在4000～400 cm-1范圍進(jìn)行掃描分析[30]。

1.2.11 單糖組成分析 參照文獻(xiàn)[31]的方法測(cè)定單糖組成。色譜條件：采用Agilent 1200 型高效液相色譜系統(tǒng)分析，C18 Agilent（4.6 mm×150 mm×5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液-乙腈（82:18），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以3 次平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，圖表均采用Origin 2018 軟件進(jìn)行繪制，使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)成分、活性成分含量測(cè)定

2.1.1 營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定 對(duì)5 種桑黃子實(shí)體的粗纖維、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量分析結(jié)果見(jiàn)表1。供試桑黃粗纖維含量差異較大，粗纖維含量最高的是S-4，為33.40%，顯著高于（P<0.05）其他四種桑黃子實(shí)體，粗纖維含量由高到低依次為S-4、S-5、S-2、S-1、S-3。在粗蛋白含量上，S-1 粗蛋白含量最高，為23.10%，其次是S-3 和S-4，兩者粗蛋白含量分別為19.41%和18.77%，差異不顯著（P>0.05）。粗脂肪含量較高的是S-1、S-3，兩者粗脂肪含量均為1.67%，粗脂肪含量較低的是S-2、S-4 和S-5，三者粗脂肪含量分別為1.37%、1.13%和0.83%。供試桑黃子實(shí)體灰分含量有顯著差異（P<0.05），S-1 灰分含量最高，為10.87%，S-5 灰分含量最低，為4.07%，相差2.7 倍。

表1 桑黃子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)成分含量Table 1 Nutrient content of fruiting bodies of Phellinus igniarius

2.1.2 活性成分含量測(cè)定 對(duì)供試桑黃子實(shí)體活性成分含量進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。供試桑黃子實(shí)體多糖、總酚、總黃酮和三萜含量差異較大。多糖含量由高到低為S-1、S-3、S-4、S-5、S-2，其中S-1、S-3 和S-4 的多糖含量差異不顯著（P>0.05），分別為1.27%、1.20%和1.19%?？偡雍孔罡叩氖荢-4，為0.34%，其總酚含量顯著高于（P<0.05）其余4 種桑黃子實(shí)體?？傸S酮含量最高的是S-3，為1.67%，其次是S-4，為1.37%，含量最低的是S-5，為0.11%?？?cè)坪孔罡叩氖荢-1，為2.85%，其次是S-4，為2.71%，最低的是S-5，為1.59%。

2.2 桑黃子實(shí)體多糖抗氧化能力比較分析

為篩選產(chǎn)高抗氧化能力多糖的桑黃，對(duì)供試桑黃子實(shí)體多糖進(jìn)行抗氧化能力的比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。不同桑黃子實(shí)體多糖的抗氧化能力存在顯著差異（P<0.05）。從S-4 中提取的多糖，其對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基和自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，體現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。還原力最強(qiáng)的是S-2，S-4 次之，但S-2 的多糖對(duì)這三種自由基的清除率均顯著低于S-4（P<0.05）。綜合考慮，選擇S-4作為目標(biāo)桑黃，并對(duì)其多糖進(jìn)行抗氧化能力驗(yàn)證和性質(zhì)分析。

圖1 桑黃子實(shí)體多糖抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of polysaccharides of fruiting bodies of Phellinus igniarius

2.3 目標(biāo)桑黃分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)ITS 測(cè)序獲得S-4 的ITS 序列（GeneBank No.OQ028234.1），用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示其與楊樹(shù)桑黃（Sanghuangporus vaninii）聚為一族，如圖2 所示，因此將該桑黃命名為Sanghuangporus vaniniiS-4。

圖2 S-4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of S-4

2.4 目標(biāo)桑黃多糖抗氧化能力測(cè)定

由圖3 可知，在一定濃度范圍內(nèi)，S-4 多糖的抗氧化能力隨多糖濃度的升高而升高，呈現(xiàn)出劑量依賴性，在達(dá)到最高抑制率或最大還原力后，不再增加。在多糖濃度為100 μg/mL 時(shí)，S-4 多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到最大值，最大清除率為89.81%（圖3A）。在多糖濃度為50 μg/mL 時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除率達(dá)到最大值，最大清除率為99.81%（圖3B）。S-4 多糖對(duì)自由基清除能力在多糖濃度200 μg/mL 時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，最大清除率64.63%（圖3C）。S-4 多糖的還原力在多糖濃度100 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)吸光值為1.981（圖3D）。S-4 多糖對(duì)DPPH和ABTS+自由基有極強(qiáng)的的清除能力，并且最大清除率與VC相當(dāng)，體現(xiàn)出較好的抗氧化能力。

圖3 S-4 多糖抗氧化能力Fig.3 Antioxidant capacity of polysaccharides from S-4

S-4 多糖對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基和自由基的IC50值分別為35.07、12.87、91.34 μg/mL，并且對(duì)于ABTS+自由基的清除能力要強(qiáng)于DPPH 自由基和自由基。因此，該多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.5 紫外光譜分析

S-4 多糖紫外掃描結(jié)果如圖4 所示，在波長(zhǎng)200 nm 附近有明顯糖類特征吸收峰，在波長(zhǎng)260、280 nm 附近無(wú)明顯核酸和蛋白質(zhì)吸收峰，表明多糖經(jīng)過(guò)Sevag 除蛋白、活性炭脫色和透析后不含大量的核酸和蛋白質(zhì)。

圖4 S-4 多糖紫外掃描圖譜Fig.4 UV absorption spectrum of polysaccharides from S-4

2.6 FT-IR 分析

S-4 多糖紅外光譜分析結(jié)果如圖5 所示，3404 cm-1附近是多糖中O-H 鍵之間的伸縮振動(dòng)[32]；2928 cm-1附近是甲基或亞甲基的C-H 鍵伸縮振動(dòng)[33]；1420～1200 cm-1范圍內(nèi)為C-H 的變角振動(dòng)峰，以上三個(gè)區(qū)域的吸收峰可判定S-4 多糖具有糖類結(jié)構(gòu)[34]。1629 cm-1附近的吸收峰是羧基中C=O 非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起，也是糖醛酸的特征吸收峰[35]；1200～1000 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)2 個(gè)吸收峰位置，表明含有呋喃糖[36]；890 cm-1出現(xiàn)吸收峰表明其糖苷鍵以β-構(gòu)型為主[37]。因此，該多糖為含有β-型糖苷鍵和呋喃環(huán)的多糖，并且含有糖醛酸。

圖5 S-4 多糖紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectrogram of polysaccharides from S-4

2.7 單糖組成分析

對(duì)S-4 多糖和單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PMP 柱前衍生化高效液相色譜分析，結(jié)果如圖6 所示，單糖種類及含量見(jiàn)表3。S-4 多糖的單糖組成為甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖。其中，葡萄糖含量最高，為238159.38 mg/kg，半乳糖含量次之，為194119.69 mg/kg。巖藻糖、葡萄糖醛酸和核糖的含量分別為114574.88、43532.40、33480.93 mg/kg。甘露糖含量最低，僅有8122.79 mg/kg。

圖6 液相色譜圖Fig.6 Liquid chromatography.

表3 S-4 多糖單糖組成Table 3 Monosaccharide composition of polysaccharides of S-4

Wan 等[38]從楊樹(shù)桑黃子實(shí)體中提取出的對(duì)人非小細(xì)胞肺癌有明顯的抑制作用的水溶性多糖SVP-1，由葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和甘露糖組成，與本研究中構(gòu)成S-4 多糖的6 種單糖中有5 種同樣的單糖，并且同樣以β-構(gòu)型為主。由于實(shí)驗(yàn)條件限制，本研究并未測(cè)定多糖結(jié)構(gòu)，后續(xù)會(huì)繼續(xù)對(duì)S-4 多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。

3 討論與結(jié)論

本研究采用熱水浸提法提取桑黃多糖，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的參數(shù)下，S-4 多糖的得率為4.92%。李有貴等[39]同樣采用熱水浸提法提取野生和人工栽培桑黃子實(shí)體的多糖，但二者得率僅1%左右。形成這種差異的原因一方面是提取條件參數(shù)的設(shè)置，另一方面也與桑黃品種的不同有關(guān)。后續(xù)將嘗試采用其他安全無(wú)毒的提取方式提取S-4 多糖，旨在提升多糖得率。

在分析多糖抗氧化能力時(shí)，發(fā)現(xiàn)S-2 多糖的還原能力強(qiáng)于S-4 多糖，但其對(duì)三種自由基的清除作用卻弱于S-4 多糖，原因可能是S-2 多糖中含有某種帶有Fe2+的物質(zhì)，該物質(zhì)可能為雜質(zhì)。另外，由于實(shí)驗(yàn)方法不同，也可能是受到試劑或?qū)嶒?yàn)體系的影響。蔡銘等[40]在比較猴頭菇粗多糖的抗氧化能力時(shí)，也出現(xiàn)了類似現(xiàn)象，其中E-HeP 對(duì)于羥自由基的清除能力最強(qiáng)，但其對(duì)DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除能力和還原力卻弱于D-HeP。故在比較不同多糖的體外抗氧化能力時(shí)要全面考察，本文分析了三種自由基的清除率及還原力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為可靠。

隨著桑黃制品的不斷豐富，桑黃多糖也逐漸被應(yīng)用于各類產(chǎn)品的研發(fā)，目前也已經(jīng)可以將桑黃中的有效藥用成分提取出來(lái)，再進(jìn)行產(chǎn)品研發(fā)，充分發(fā)揮其廣泛的藥理作用。近年來(lái)，桑黃在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，日本、韓國(guó)等地已經(jīng)將桑黃列為食品、健康食品，甚至是藥品，而我國(guó)目前對(duì)于桑黃精深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)仍然較為匱乏。本研究通過(guò)對(duì)比五種桑黃的主要營(yíng)養(yǎng)、活性成分含量及多糖的四種抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)S-4 具有相對(duì)豐富的營(yíng)養(yǎng)及活性成分，其多糖具有相對(duì)較強(qiáng)的抗氧化活性，有一定的開(kāi)發(fā)潛力，作為優(yōu)良桑黃子實(shí)體應(yīng)用于桑黃精深加工產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有一定可行性，后續(xù)將嘗試?yán)肧-4 多糖以咀嚼片或口服液的形式開(kāi)發(fā)功能性食品。