響應(yīng)面法優(yōu)化白英粗多糖提取工藝及其體外抗氧化活性的分析

黃明浩，黃泰奇,2，鄧麗娟,

（1.武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430212；2.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430065）

白英（SolanumlyratumThunb.）為茄科草質(zhì)藤本，又名山甜菜、白毛藤、排風(fēng)草。白英以全草及根入藥，具有祛風(fēng)利濕、清熱解毒、抗腫瘤等功效[1]，是臨床上常用抗癌中草藥[2-4]，可用于制作保健食品[5]。白英多糖是白英的主要活性成分，具有抑菌[6]、抗癌[7-8]、增強(qiáng)免疫力[9]等藥理活性。目前，白英多糖的提取工藝多采用傳統(tǒng)方法，王林江等[10]通過石油醚回流脫脂、乙醇回流除去單糖和低聚糖，采用沸水浸提法提取白英多糖。楊惠麟等[11]通過乙醇超聲波提取去除單糖等小分子物質(zhì)，采用加熱回流法提取白英多糖。Wu 等[12]采用沸水抽提同時進(jìn)行機(jī)械攪拌的方法提取白英多糖。上述方法皆采用沸水提取白英多糖，不僅提取時間長，而且高溫易造成多糖降解及失活[13]，從而使提取率降低。超聲波輔助提取是通過超聲波的機(jī)械效應(yīng)及空化效應(yīng)，使植物細(xì)胞壁破碎，有利于有效成分的溶出，目前已被廣泛運(yùn)用于天然活性物質(zhì)的提取。Chen 等[14]采用不同方法提取山楂多糖發(fā)現(xiàn)沸水抽提山楂多糖平均得率為5.88%±0.19%，超聲波提取山楂多糖平均得率為7.47%±0.05%。結(jié)果表明，就山楂多糖的提取而言，超聲波法與沸水抽提法相比，具有提取速度快，提取率高，提取溫度低等明顯優(yōu)勢。目前暫無超聲波法輔助提取白英多糖的報道。另外，有研究發(fā)現(xiàn)白英的醇提物具有一定的抗氧化作用[15]，但白英的水提物的抗氧化活性未見報道。毛建山等[16]對白英多糖進(jìn)行紅外光譜檢測，發(fā)現(xiàn)其具有可供氫官能團(tuán)，這表明白英多糖具有潛在的抗氧化作用。因此，本研究采用超聲波法提取白英多糖，通過響應(yīng)面設(shè)計對白英多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測定其抗氧化活性，旨為白英多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白英干品 購于安徽省亳州市亳源通中藥材種植有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）合肥巴斯夫生物科技有限公司；抗壞血酸（VC）天津登峰化學(xué)試劑廠；無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、乙醇等試劑均為分析純。

KQ-100DE 超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲波儀器有限公司；ZT-2L 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州紫拓儀器設(shè)備有限公司；7200 可見光分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；SHZ-D 循環(huán)水真空泵 鄭州杜甫儀器廠；NanoDrop 2000 超微量分光光度計 賽默飛世爾科技公司；Nicolet iS5 傅里葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白英多糖的提取方法

1.2.1.1 白英粉末的前處理 將白英干品用小型粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩后按1:10 比例加入95%乙醇超聲提取1 h，去除其中的還原糖和雜質(zhì)，過濾后烘干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 白英多糖的提取 稱取白英全草粉末25.0 g，在預(yù)設(shè)超聲條件下進(jìn)行提取過濾后得提取液，減壓濃縮至10 mL，將濃縮液通過活性炭脫色，收集脫色液。加入等體積6%三氯乙酸與脫色液混合，冷藏過夜后過濾，用10% NaOH 調(diào)pH 至中性，減壓濃縮，向濃縮液中加入3 倍體積的95%乙醇4 ℃靜置2 h，5000 r/min 離心5 min，取其沉淀，依次用丙酮、乙醚反復(fù)洗滌，60 ℃烘干至恒重得白英多糖[11]。

1.2.2 多糖得率的測定 參考張鵬等[17]報道的方法：配置0.1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，精密吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 分別置于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，于490 nm 處測定吸光值。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程：y=11.848x+0.0244，R2=0.9993。取0.5 g 白英粉末，在預(yù)設(shè)超聲條件下進(jìn)行提取，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶內(nèi)定容，得供試品溶液。準(zhǔn)確吸取供試品溶液0.2 mL，依照上述方法測定白英多糖濃度，并依據(jù)公式計算白英多糖得率：

式中：C 表示白英多糖濃度，g/mL；V 表示供試品溶液體積，mL；D 表示稀釋倍數(shù)；W 表示白英粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實驗 固定超聲功率120 W，超聲波頻率40 kHz，料液比1:30 g/mL，提取時間30 min，提取溫度20 ℃，分別探究料液比（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100 g/mL），提取時間（20、30、40、50、60、80、100 min），提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對白英多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以料液比（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）為變量，以白英多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平試驗，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.2.5 白英多糖的紫外光譜分析 精確配制濃度為1 mg/mL 白英多糖水溶液，以純水作空白，進(jìn)行全波長掃描（200～800 nm）。

1.2.6 白英多糖的紅外光譜分析 稱取2 mg 白英多糖，加入適量的光譜純KBr 粉末研磨混勻壓片，紅外光譜儀掃描范圍為400～4000 cm-1，初步分析白英多糖的官能團(tuán)及結(jié)構(gòu)。

1.2.7 白英多糖的抗氧化活性分析

1.2.7.1 白英多糖對DPPH 自由基清除能力的測定 配制不同濃度的白英多糖溶液，各取2 mL 與DPPH 溶液（2 mL，0.2 mmol/L）混合，在室溫下避光反應(yīng)30 min。以無水乙醇為空白，Vc 為陽性對照，在517 nm 下測定吸光值[18]，重復(fù)3 次，按下式計算DPPH 自由基清除率：

式中：As為白英多糖溶液與DPPH 溶液混合后的吸光值；Ab為白英多糖溶液與無水乙醇混合后的吸光值；A0為純水與DPPH 溶液混合后的吸光值。

1.2.7.2 白英多糖對ABTS 自由基清除能力的測定 配制7.4 mmol/L ABTS 二銨鹽儲備液和2.6 mmol/L K2S2O8儲備液，將上述兩種儲備液各取1 mL 混合，避光環(huán)境下室溫放置12 h，用磷酸鹽緩沖液（pH7.4）將上述混合液稀釋至吸光度為0.70±0.02，此溶液即為ABTS+自由基工作液。配制不同濃度的白英多糖溶液，各取0.4 mL 與4 mL ABTS 自由基工作液在室溫下避光反應(yīng)6 min，在734 nm 處測定吸光值，重復(fù)3 次。以Vc 為對照組，利用如下公式計算ABTS+自由基清除率[19-20]：

式中：A0為純水與ABTS 工作液混合后的吸光值；A1為白英多糖溶液與ABTS 工作液混合后的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 2022 軟件作圖，通過Design Expert 13 軟件對響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行模型構(gòu)建和方差分析，使用SPSS Statistics 23 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 料液比對白英多糖得率的影響 不同料液比對白英多糖得率的影響見圖1。隨著料液比的增大，白英多糖得率呈上升趨勢，在1:60 g/mL 時達(dá)到最大（6.50%±0.09%），之后白英多糖得率顯著下降，可能是因為過多的水會使體系的單位空化能量降低，從而不利于白英多糖的溶出，導(dǎo)致多糖得率降低[21-22]。因此，響應(yīng)面優(yōu)化試驗的料液比選擇1:40、1:60、1:80 g/mL。

圖1 料液比對白英多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid to material ratio on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.1.2 提取時間對白英多糖得率的影響 不同提取時間對白英多糖得率的影響見圖2。在40 min 時白英多糖得率達(dá)到最大（7.05%±0.10%），隨著提取時間的延長，白英多糖得率緩慢下降，可能是因為多糖在超聲時間過長后會被誘導(dǎo)降解，導(dǎo)致多糖得率下降[23]。因此，響應(yīng)面試驗的提取時間選擇20、40、60 min。

圖2 提取時間對白英多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.1.3 提取溫度對白英多糖得率的影響 不同提取溫度對白英多糖得率的影響見圖3。隨著提取溫度升高，白英多糖的得率先上升后下降，提取溫度為70 ℃時，白英多糖得率最高（7.31%±0.16%），這說明提取溫度的升高會增加溶液體系內(nèi)的分子熱運(yùn)動，有利于白英多糖的溶出；但提取溫度過高，可能會使多糖糖苷鍵斷裂，造成多糖水解從而導(dǎo)致得率降低[24]。因此，響應(yīng)面試驗的提取溫度選擇60、70、80 ℃。

圖3 提取溫度對白英多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。采用Design-Expert 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項擬合回歸，所得模型：Y=7.13-0.1413A+0.24B-0.8688C-0.29AB-0.2425AC-0.31BC-0.2028A2-0.2602B2-1.18C2。從表3 可以看出，該回歸模型的P<0.0001，具有極顯著差異，說明該模型具有較好的穩(wěn)定性[25]，失擬項P=0.8476>0.05，不顯著，說明未知因素對實驗結(jié)果干擾較小。模型決定系數(shù)（R2）=0.9801，調(diào)整決定系數(shù)（R2Adj）=0.9545，表明此模型擬合程度良好[26]。通過F值檢驗可以看出，溫度對白英多糖得率影響最大，其次為時間，最后是料液比。

表3 回歸模型的顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of regression models

2.2.2 各因素響應(yīng)面分析 采用Design-Expert 程序?qū)憫?yīng)面試驗的結(jié)果作曲面圖，同時分析各因素之間的交互作用。響應(yīng)面圖中曲面越彎曲表明研究因素對結(jié)果影響越大[27]，等高線的形狀呈橢圓形表明研究因素之間的交互作用影響顯著，呈圓形則說明交互作用影響不顯著[28]。由圖4 可知，溫度與料液比和溫度與時間的響應(yīng)面曲面的彎曲程度較大且均向溫度彎曲，其等高線圖為橢圓形，說明這兩種交互作用對白英多糖得率的影響顯著，溫度對于白英多糖提取的影響最為顯著，與方差分析F值檢驗所得結(jié)果一致。

圖4 各因素交互作用對白英多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graphs of the interaction of various factors on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.2.3 最優(yōu)提取工藝驗證 Design-Expert 軟件給出的最優(yōu)白英多糖提取條件為提取溫度65.18 ℃、提取時間57.95 min、料液比1:57.15 g/mL，預(yù)測的得率為7.448%。根據(jù)實際操作可行性，調(diào)整提取溫度65 ℃、提取時間58 min、料液比為1:57 g/mL，在此條件下白英多糖實測得率為7.54%±0.12%，與預(yù)測值差異較小。該結(jié)果與王林江等[10]、楊惠麟[11]、Wu等[12]用沸水抽提的結(jié)果（1.84%、0.96%、2.37%）相比有較大提升。與Wu 等[12]的提取時間（5 h）相比有較大的優(yōu)化。說明與沸水抽提法相比較，超聲波輔助提取可有效提高白英多糖的得率，同時縮短提取時間。

2.3 白英粗多糖的紫外和傅里葉變換光譜分析

白英多糖紫外光譜圖見圖5。白英多糖樣品在237 nm 處有最大吸收峰，說明樣品中可能含有不飽和羰基、羧基等[29]。在260 和280 nm 處沒有明顯的吸收峰，說明白英多糖提取物中的核酸和蛋白質(zhì)已去除。

圖5 白英多糖紫外光譜圖Fig.5 Ultraviolet spectrogram of Solanum lyratum polysaccharide

白英多糖的紅外光譜結(jié)果見圖6。3430.94 cm-1附近的寬而強(qiáng)的吸收峰是由O-H 鍵的伸縮振動引起，此為多糖的特征吸收峰[30]。2926.14 cm-1處的吸收峰是由糖環(huán)上C-H 鍵的對稱伸縮振動引起[31]，1623.91 和1434.29 cm-1處的吸收峰為羧基和羰基引起，表明白英多糖中存在糖醛酸結(jié)構(gòu)[32]，1151.29 cm-1處的峰為糖苷鍵C-O-C 的伸縮振動引起[33]。400～900 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，表明存在吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)[34]。綜上，紅外光譜表明樣品具有糖類化合物的特征峰，可以判斷為糖類化合物。這與毛建山等[16]研究結(jié)果相似。

圖6 白英多糖紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram of Solanum lyratum polysaccharides

2.4 白英粗多糖的體外抗氧化活性分析

圖7 為白英多糖體外抗氧化活性結(jié)果。白英多糖在濃度0.2～5.0 mg/mL 和0.1～6.0 mg/mL 時分別具有較強(qiáng)的DPPH 和ABTS+自由基清除活性，均呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。白英多糖濃度越高，其抗氧化能力越強(qiáng)；在濃度為5.0 mg/mL 時其對DPPH自由基的清除率最大，達(dá)到98.35%±0.54%；在濃度為6.0 mg/mL 時其對ABTS+自由基的清除率最大，為96.57%±0.79%。白英多糖對DPPH 和ABTS+自由基的半抑制濃度（IC50）分別為1.104、1.408 mg/mL，表明白英多糖具有良好的體外抗氧化活性。

圖7 白英多糖體外抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of Solanum lyratum polysaccharides in vitro

3 結(jié)論

本研究采用超聲波法輔助提取白英粗多糖，用苯酚-硫酸法測定白英粗多糖含量。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計，得到最佳的白英粗多糖提取工藝為：料液比1:57 g/mL、提取時間58 min、提取溫度65 ℃。最后所得白英粗多糖得率為7.54%±0.12%，與預(yù)測值差距較小，說明該提取工藝穩(wěn)定可靠。通過紫外和傅里葉變換紅外光譜掃描發(fā)現(xiàn)，白英粗多糖具有典型的多糖光譜吸收峰，其中含有糖醛酸，說明白英多糖可能為酸性多糖。白英粗多糖對DPPH 自由基和ABTS+自由基的半抑制濃度（IC50）分別為1.104、1.408 mg/mL，說明白英粗多糖具有良好的抗氧化活性。本研究為白英粗多糖的提取提供了一種高效的提取方法，為白英多糖的進(jìn)一步開發(fā)提供了理論依據(jù)。但白英多糖的主要片段、單糖組成、分子量分布、構(gòu)象仍有待進(jìn)一步深入研究。