響應(yīng)面優(yōu)化高速剪切法制備薄荷揮發(fā)油包合物工藝

陳紅斌，洪倫波,，汪 娟，徐建兵，楊小明，吳曉慧

（1.浙江惠松制藥有限公司，浙江杭州 310020；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

薄荷為唇形科植物薄荷（Mentha haplocalyxBriq.）的干燥地上部分，具有疏散風(fēng)熱、清利頭目等作用[1]，被廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域。研究表明，薄荷揮發(fā)油的主要成分為薄荷醇和胡薄荷酮，它們具有較好的抗氧化和抗菌活性[2]。然而，由于薄荷油易揮發(fā)，在生產(chǎn)加工過(guò)程中損失嚴(yán)重，這降低了薄荷特有的香氣和使用效果。

環(huán)糊精具有獨(dú)特的疏水空腔結(jié)構(gòu)，可以包合與其空腔大小相近的客體分子或其中的某些基團(tuán)[3]，有研究表明β-CD 的包合作用對(duì)芳香化合物起到控制釋放的作用[4]。因此，采用β-環(huán)糊精增加薄荷揮發(fā)油的穩(wěn)定性，提高了薄荷油的利用度。當(dāng)前，大多數(shù)研究資料采用飽和水溶液攪拌法和真空干燥法制備揮發(fā)油包合物[5]。例如，徐蓉蓉等[6]采用飽和水溶液法制備薏苡仁油β-環(huán)糊精（β-CD）包合物；馬君義等[7]采用水溶液攪拌法制備百里香揮發(fā)油包合物；陸寧等[8]采用水溶液攪拌法制備薄荷油β-環(huán)狀糊精包合物。攪拌法的包合時(shí)間較長(zhǎng)，如Xi 等[9]采用攪拌法研究了肉豆蔻精油，最優(yōu)包合時(shí)間為247 min。此外，有用超聲法包合揮發(fā)油。如陳秋實(shí)等[10]研究了用超聲處理方法包合薄荷揮發(fā)油；Jiang 等[11]采用超聲法研究了茶樹油的包合工藝，最優(yōu)包合時(shí)間為70 min。超聲法包合載藥量也不高，如石春韜等[12]采用超聲波制備肉桂-β-環(huán)糊精納米微膠囊，載藥量為7.05%。另外，有研究利用高壓均質(zhì)法來(lái)制備白術(shù)揮發(fā)油包合物[13]，但高速剪切機(jī)操作更方便，機(jī)器及安裝成本更低，高速剪切法通常只需幾分鐘，可以節(jié)省包合時(shí)間，因此本文嘗試選擇高速剪切法來(lái)包合揮發(fā)油。

目前，大部分研究采用真空干燥法來(lái)干燥包合物，如王鴻森等[13]考察了白術(shù)揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備工藝，最大收率為75.46%。真空干燥法制備需經(jīng)過(guò)冷藏、抽濾、洗滌和干燥等繁瑣復(fù)雜的工序，損失較多，收率不高，所以本文嘗試用冷凍干燥法來(lái)制備包合物，省去過(guò)濾等工序，有助于提高收率。相較于其他方法，利用高速剪切法結(jié)合冷凍干燥法制備揮發(fā)油包合物的報(bào)道較少。

因此，本文采用高速剪切和冷凍干燥的工藝來(lái)制備薄荷油包合物。根據(jù)文獻(xiàn)資料及單因素實(shí)驗(yàn)表明，包合工藝中的各因素可能存在交互影響[3]。如溫度的升高可增加β-CD 的溶解性，從而提高包合率，但溫度升高也使揮發(fā)油更容易揮發(fā)。另外，加入更多的β-CD 會(huì)增加包合幾率，但過(guò)多的加入β-CD 也會(huì)使得包合物載油量降低。為了優(yōu)化包合工藝，本文運(yùn)用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝。為了驗(yàn)證包合效果，本文利用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)包合物中的胡薄荷酮含量，并利用FTIR 對(duì)包合物進(jìn)行表征，研究對(duì)薄荷油包合物的制備有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薄荷 產(chǎn)自江蘇，浙江惠松制藥有限公司，惠遠(yuǎn)醫(yī)藥（浙江）有限公司藥材飲片部鑒定為唇形科植物薄荷的干燥地上部分；β-環(huán)糊精（β-CD）醫(yī)藥級(jí)，曲阜天利藥用輔料有限公司；胡薄荷酮對(duì)照品 批號(hào)：111706-201907，中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇色譜級(jí)，Scharlab 公司；純凈水 娃哈哈集團(tuán)有限公司；AL204 電子分析天平 梅特勒托力多儀器（上海）有限公司；TSC-E 電子臺(tái)秤 索沃電子秤有限公司；OSC-10L 多功能攪拌器 群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠；ZD25 高速剪切機(jī) 卓的儀器設(shè)備有限公司；DHG-9070A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TC-15 恒溫電熱套 海寧華星實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TD-100 微型提取濃縮機(jī)組 浙江森力機(jī)械科技有限公司；FZG-2 真空干燥箱 南京康方機(jī)械科技有限公司；Agilent 1290 高效液相色譜儀美國(guó)Agilent 公司；Thermo-Nicolet iS5 傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo 公司；LGJ-100F 真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薄荷揮發(fā)油包合物制備工藝 薄荷揮發(fā)油的提取：取薄荷飲片4 kg，投入提取罐中，加入10 倍量的水，保持微沸狀態(tài)水蒸氣蒸餾，提取至揮發(fā)油不再流出，得到油水混合物。將得到的油水混合物放入4 ℃冷藏庫(kù)內(nèi)放置24 h，使油水自然分層，分離回收揮發(fā)油層，即得。

β-CD 包合物的制備方法：稱取一定量的β-CD，加入一定量的純化水中，加熱至一定的溫度，保溫，備用。將制備好的β-CD 飽和水溶液置于恒溫水浴鍋內(nèi)，將薄荷揮發(fā)油溶液緩慢滴入β-CD 溶液中，待揮發(fā)油全部加入后開始計(jì)時(shí)[14]，繼續(xù)攪拌，或剪切至規(guī)定時(shí)間，于4 ℃冷藏24 h，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥5 h（冷凍溫度-40 ℃，升華溫度40 ℃）；或真空干燥（抽濾，無(wú)水乙醇洗滌3 次，置于真空干燥箱內(nèi)于45 ℃干燥5 h）。

1.2.2 干燥方法的比較 按照1.2.1 方法配制樣品，β-CD 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，β-CD 與揮發(fā)油比例為8:1，包合溫度為50 ℃，剪切速度為8000 r/min，4 ℃冷置24 h，分別用冷凍干燥和真空干燥法干燥樣品，分別做3 個(gè)平行樣，測(cè)定含油率、包合率和收率。

1.2.3 高速剪切法與攪拌法對(duì)比 稱取一定量的β-CD 分別加入純化水中，使水溶液中β-CD 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，加熱至包合溫度50 ℃，β-CD 與揮發(fā)油比例為8:1，分別用攪拌和高速剪切的兩種方法制備包合物，邊攪拌（邊剪切）邊加入薄荷油。攪拌轉(zhuǎn)速分別為500、800、1000 r/min，攪拌法分別攪拌3 h；應(yīng)用高速剪切機(jī)的一檔、二檔、三擋速度分別對(duì)應(yīng)剪切速度分別為8000、13000、18000 r/min，剪切法分別剪切1 min；按照1.2.1 的制備方法制備薄荷揮發(fā)油包合物，冷凍干燥（-40 ℃時(shí)冷凍5 h，然后升溫到40 ℃），分別做3 個(gè)平行樣，測(cè)定揮發(fā)油包合率及包合物含油率。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 冷置時(shí)間對(duì)包合的影響 按照1.2.1 方法配制樣品，β-CD 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，β-CD 與揮發(fā)油比例為8:1 g/mL，包合溫度為50 ℃，剪切速度為8000 r/min，4 ℃冷置6、12、24、36 和72 h，冷凍干燥，重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n=5），測(cè)定包合物含油量和包合率。

1.2.4.2β-CD 與揮發(fā)油比例的影響 按照相同方法配制樣品，β-CD 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，包合溫度50 ℃，剪切速度為8000 r/min，β-CD 與揮發(fā)油比例分別為3:1、6:1、9:1、12:1、15:1 g/mL，放置冷卻24 h，冷凍干燥，重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n=5），測(cè)定包合物含油量和包合率。

1.2.4.3 包合溫度的影響 按照相同方法配制樣品，β-CD 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，β-CD 與揮發(fā)油比例為8:1 g/mL，剪切速度為8000 r/min，包合溫度分別為45、50、55、60 和65 ℃，放置冷卻24 h，冷凍干燥，重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n=5），測(cè)定包合物含油量和包合率。

1.2.4.4β-CD 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 按照相同方法配制樣品，β-CD 與揮發(fā)油比例為8:1 g/mL，包合溫度為55 ℃，剪切速度為8000 r/min，水溶液中β-CD 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%、30%，放置冷卻24 h，冷凍干燥，重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n=5），測(cè)定包合物含油量和包合率。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 響應(yīng)面試驗(yàn)因素采用高速剪切法和冷凍干燥法制備包合物；在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)揮發(fā)油包合率和包合物含油率影響較大的3 個(gè)因素，即β-CD 與揮發(fā)油比例（因素A）、包合溫度（因素B）、β-CD 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（因素C），采用3 因素3 水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面法因素水平Table 1 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

1.2.6 含油率及包合率的測(cè)定 稱取一定量的包合物置于500 mL 圓底燒瓶中，加蒸餾水200 mL，按照《中國(guó)藥典》（2020 版四部）通則中“揮發(fā)油測(cè)定法”項(xiàng)下甲法測(cè)定包合物中揮發(fā)油的含量[15]?？瞻谆厥章屎桶下蕝⒖记破嫉萚16]的研究方法，收率參考高杰等[17]的研究方法，含油率根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求計(jì)算包合物載藥量所得公式。

1.2.7 綜合評(píng)價(jià)指標(biāo) 以揮發(fā)油包合率和包合物含油率的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)[18-19]，因包合物含油率數(shù)值相差較小，所以選擇含油率和包合率兩個(gè)指標(biāo)的權(quán)重為2:8，即

1.2.8 高效液相色譜法測(cè)定胡薄荷酮含量 色譜條件：色譜柱：CORTECS T3；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；流速：0.35 mL/min，流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸（B）；梯度洗脫條件：0～5 min，10% A→25% A；5～9 min，25% A→33% A；9～14 min，33%；14～22.5 min，33% A→50% A；22.5～26 min，50% A→95% A；26～27 min，95% A；27～30 min，95% A→10% A。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：取胡薄荷酮對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 mL 含50 μg 的溶液，即得。

供試品溶液制備：取薄荷油適量，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得薄荷油供試品。取包合物樣品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，立即取出樣品3000 r/min離心10 min，取上清液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得包合物供試品。

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

1.2.9 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析 取約200 mg溴化鉀（KBr）置于瑪瑙乳缽中研成極細(xì)粉末，轉(zhuǎn)移至專用模具中壓成透明KBr 薄片，將薄荷揮發(fā)油1 滴滴于KBr 薄片上[20-21]；取β-CD 或包合物適量，加入適量的KBr 混合均勻，壓制成片；取混合物（β-CD 和薄荷揮發(fā)油按照10:1 的比例，攪拌混合均勻），加入適量的KBr 混合均勻，壓制成片；在500～4000 cm-1間范圍內(nèi)掃描紅外光譜。設(shè)定紅外光譜分辨率為0.741 cm-1，掃描信號(hào)累加32 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)做3～5 組平行，采用Origin 2022 版軟件進(jìn)行圖表繪制；利用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采取方差分析（ANOVA），P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著；通過(guò)Design-Expert 11 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥方法的比較

由于用真空干燥法需要抽濾、無(wú)水乙醇洗滌，工序多、損失較多；而冷凍干燥法則無(wú)需抽濾、洗滌，減少了工序，對(duì)比兩種干燥方法得出含油率、包合率和收率如表2 所示，結(jié)果可見(jiàn)兩種干燥方法對(duì)包合率和含油率影響不大，但由于用真空干燥法需要抽濾、無(wú)水乙醇洗滌的步驟，工序較多損失較多，收率較低；而凍干法制備包合物的工序少、收率較高，一般在97%以上，優(yōu)勢(shì)比較明顯，因此，本文選擇冷凍干燥進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 真空干燥和冷凍干燥工藝的對(duì)比Table 2 Comparison of vacuum drying and freeze-drying process

2.2 高速剪切法與攪拌法對(duì)比結(jié)果

攪拌法包合揮發(fā)油通常需要3～6 h，預(yù)估高速剪切可以快速將揮發(fā)油擠壓進(jìn)入β-環(huán)糊精的空腔，為了提高揮發(fā)油包合物的生產(chǎn)效率，選擇高速剪切法與常用的攪拌法對(duì)比，結(jié)果如表3 所示，攪拌法包合率與文獻(xiàn)[6]中包合率63%接近。應(yīng)用高速剪切法制備揮發(fā)油包合物時(shí)，剪切速度在8000 r/min 以上，高速剪切法制備的含油率和包合率較高，與攪拌法相比分別高出約3%和19%。由此可見(jiàn)高速剪切法在結(jié)果上優(yōu)于攪拌法，剪切法用時(shí)1 min，節(jié)省時(shí)間并且操作和清洗簡(jiǎn)單。因此，本文選擇高速剪切法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 攪拌和剪切工藝的對(duì)比Table 3 Comparison of stirring and shearing process

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

冷置時(shí)間對(duì)包合的影響如圖1a 所示，隨著冷置時(shí)間增長(zhǎng)包合物含油率和揮發(fā)油包合率都增大，可能是當(dāng)溫度降低，使得包合物沉淀后更穩(wěn)定。當(dāng)冷藏時(shí)間到達(dá)24 h，β-CD 含油率為10.25%，揮發(fā)油包合率為86.02%，冷藏時(shí)間繼續(xù)增大到36 h，β-CD 含油率為10.61%，變化不顯著，揮發(fā)油包合率為87.27%，增加緩慢，考慮時(shí)間成本，因此在之后的實(shí)驗(yàn)中冷置時(shí)間皆為24 h。

圖1 各因素對(duì)含油率和包合率的影響Fig.1 Effects of various factorson responses of inclusion process

β-CD 與揮發(fā)油比例的影響如圖1b 所示，隨著β-CD 與揮發(fā)油比例增大，β-CD 的含油量先升高后降低，當(dāng)其比例達(dá)到9:1 時(shí)，β-CD 的含油量達(dá)到最大為10.90%，之后比例繼續(xù)增大，含油量開始下降；隨著β-CD 與揮發(fā)油比例的增大，揮發(fā)油包合率先快速增加，比例增大到9:1 時(shí)，揮發(fā)油包合率為96.48%，之后包合率則不再有顯著變化，其原因可能是β-CD 分子空腔有限，前期隨著β-CD 的量增加，包埋量增大，形成包合物幾率增大，含油率增高，但β-CD 用量過(guò)大時(shí)，大量的β-CD 未參與反應(yīng)[22]。所以選擇9:1 為響應(yīng)面因素比例的中心點(diǎn)。

包合溫度的影響如圖1c 所示，隨著包合溫度的升高，含油率和包合率都先升高再降低，該趨勢(shì)與文獻(xiàn)結(jié)果一致[17,23]。之后開始當(dāng)包合溫度為55 ℃時(shí)，揮發(fā)油包合率最大為93.69%，之后隨著包合溫度的升高，揮發(fā)油包合率開始迅速下降，表明高于55 ℃，薄荷揮發(fā)油非常容易揮發(fā)，從而使包合率迅速下降。當(dāng)包合溫度為55 ℃時(shí)，β-CD 的含油率達(dá)到最大為11.48%，之后隨著包合溫度的升高，β-CD 的含油率快速降低。溫度的升高，有助于更多的β-CD 溶解于水中而發(fā)揮作用[22]，提高β-CD 的含油率，達(dá)到55 ℃注：a：冷藏時(shí)間；b：β-CD 與揮發(fā)油比例；c：包合溫度；d：β-CD 百分含量；不同小寫字母表示各組含油量差異極顯著（P<0.01），不同大寫字母表示各組包合率差異極顯著（P<0.01）。后，溫度繼續(xù)升高，揮發(fā)油則更快速地?fù)]發(fā)，導(dǎo)致β-CD 含油率也開始下降。綜上所述，選擇55 ℃為響應(yīng)面因素包合溫度的中心點(diǎn)。

β-CD 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖1d 所示，β-CD的百分含量對(duì)包合工藝也有明顯影響，隨著水溶液中β-CD 百分含量的增加，含油率和包合率先增大后降低，該趨勢(shì)與文獻(xiàn)[17]研究結(jié)果一致。當(dāng)β-CD 的百分含量增加至15%時(shí)，β-CD 含油量和揮發(fā)油包合率最大，分別為11.82%和94.57%。當(dāng)β-CD 的百分含量繼續(xù)增加時(shí)，包合物含油率和揮發(fā)油包合率開始降低。說(shuō)明在一定的溫度和剪切速度下，β-CD 的百分含量超過(guò)15%后，繼續(xù)增加β-CD 用量會(huì)對(duì)其在水中的溶解造成影響，從而使得含油率和包合率開始下降。包合方法和條件不同，評(píng)分最佳的β-CD 含量有差異[17,23]。本實(shí)驗(yàn)選擇15%為響應(yīng)面因素β-CD 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的中心點(diǎn)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 多元二次模型方程的建立及方差分析 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4，回歸模型和方差分析見(jiàn)表5。采用Design-Expert11 軟件對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行二次元多元回歸擬合，回歸方程：Y=98.02+6.37A-1.09B+9.76C+2.61AB+0.5746AC-0.1712BC-15.15A2-16.09B2-9.48C2，決定系數(shù)R2=0.9984，校正系數(shù)為R2Adj=0.9964。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5，P<0.0001，說(shuō)明二次多元回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說(shuō)明試驗(yàn)誤差小，可信度高，該方程對(duì)模擬真實(shí)的三因素三水平的分析是可行的。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken

表5 回歸模型和方差分析Table 5 Regression model and analysis of Variance

由方差分析結(jié)果可以看出，一次項(xiàng)A（P<0.01）和C（P<0.01），二次項(xiàng)A2和C2（P<0.01）均在1%的水平內(nèi)極顯著，表明在工藝過(guò)程中，β-CD 與揮發(fā)油比例和β-CD 的百分含量對(duì)包合工藝有極其顯著的影響。一次項(xiàng)B（P<0.05）和二次項(xiàng)B2（P<0.01）表明溫度對(duì)包合工藝有顯著性影響。

交互項(xiàng)AB（P<0.01）在1%的水平內(nèi)顯著（極顯著），AC（P>0.05）和BC（P>0.05）的交互作用對(duì)包合工藝影響不顯著。從圖2 的響應(yīng)面彎曲度和等高線圖可以看出，AB 交互作用圖形可以看出，AB 交互作用的響應(yīng)面坡度較為陡峭，等高線較為密集，AB 交互作用對(duì)包合工藝綜合評(píng)分影響顯著。AC 和BC交互作用響應(yīng)面較為緩平，等高線較為稀疏，因此AC 和BC 交互作用對(duì)包合工藝影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致。由圖2 表明β-CD 與揮發(fā)油比例與包合溫度對(duì)包合工藝的交互作用影響顯著，將β-CD 與揮發(fā)油比例固定在9:1 g/mL 時(shí)，包合工藝的綜合評(píng)分隨著溫度的升高先增加后降低，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃后，綜合評(píng)分開始下降。溫度大于55 ℃時(shí)，薄荷油會(huì)加速揮發(fā)，從而影響包合效果，降低了綜合評(píng)分。在溫度固定在55 ℃時(shí)，隨著β-CD 與揮發(fā)油比例的增大，綜合評(píng)分先升高后降低，比例達(dá)到數(shù)值9:1 g/mL 之后，綜合評(píng)分開始下降，說(shuō)明當(dāng)β-CD 已經(jīng)過(guò)飽和，繼續(xù)增加比例會(huì)降低含油率，從而使綜合評(píng)分下降。

圖2 AB、AC、BC 兩兩因素交互對(duì)綜合評(píng)分的影響的三維響應(yīng)面圖Fig.2 Response surfaces of effects of interaction of AB,AC,BC on scores

2.4.2 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert11 軟件分析給出最優(yōu)工藝為β-CD 與揮發(fā)油比例為9.39:1（g/mL），包合溫度55.09 ℃，β-CD 百分含量為17.00%，綜合得分99.9。考慮工藝應(yīng)用的方便性，工藝修正為β-CD 與揮發(fā)油比例為9:1（g/mL），包合溫度55 ℃，β-CD 含量17%，在優(yōu)選出的最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3），得到包合物含油率為10.9%，揮發(fā)油包合率為97.6%，綜合得分為99.7，RSD 值為1.59%。因此，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值基本一致。

2.5 HPLC 測(cè)定胡薄荷酮的含量

如圖3a 中為胡薄荷酮對(duì)照品的液相圖譜，在薄荷油和包合物的液相圖譜中均能找到胡薄荷酮的峰，在10～11 min 處，說(shuō)明包合物中含有胡薄荷酮指標(biāo)成分。如圖3b 計(jì)算得出薄荷油中胡薄荷酮含量為20.518 mg/g。如圖3c 所示，計(jì)算三批包合物中胡薄荷酮平均含量為2.465 mg/g，RSD 值為0.65%，證明包合物中含有薄荷油的特征成分，特征成分含量也較高。

圖3 胡薄荷酮（a）、薄荷油（b）和包合物（c）的高效液相圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of Pulegone (a),volatile oil (b) and inclusion complex (c)

2.6 FTIR 對(duì)比分析包合物的表征

如圖4 所示，3424 cm-1附近為O-H 伸縮振動(dòng)吸收峰；2924 cm-1附近為亞甲基的C-H 非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰[24]。

圖4 薄荷油、β-CD 及兩者包合物與混合物的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of volatile oil,β-CD and its inclusion complex and mixtures

薄荷油紅外光譜中峰2957、2871 cm-1是-CH3中C-H 鍵非對(duì)稱和對(duì)稱振動(dòng)所產(chǎn)生[25]；1736～1023 cm-1為飽和醇類、酯類特征峰[26]，本試驗(yàn)中這類特征峰歸屬于在揮發(fā)油[27]。1736 cm-1為芳香酸酯類中C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，1710 cm-1為酮類化合物中C=O伸縮振動(dòng)，1643 和1456 cm-1為芳環(huán)C=C 的拉伸振動(dòng)[28]；1244 cm-1為飽和酯鹽的C-O 拉伸振動(dòng)[26]；1048 和1023 cm-1為飽和醇類物質(zhì)中C-O 伸縮振動(dòng)吸收峰[29]。

β-CD 紅外光譜峰值3424 cm-1歸于O-H 伸縮振動(dòng)，2927 cm-1歸于C-H 伸縮振動(dòng)，1157 cm-1歸于C-O 伸縮振動(dòng)[29]。1500～1000 cm-1歸因于C-O和C-O-C 鍵的不對(duì)稱拉伸振動(dòng)，β-CD 紅外指紋帶歸因于β-CD 的葡萄糖鏈狀結(jié)構(gòu)[30]。

混合物的典型峰值與β-CD 和薄荷油紅外峰值重疊，在β-CD 和薄荷油的光譜中均可以找到，只是伸縮振動(dòng)的峰的強(qiáng)度減弱，然而，沒(méi)有顯著差異，表明揮發(fā)油和環(huán)糊精沒(méi)有發(fā)生相互作用?；旌衔锱c包合物的紅外峰值存在差別，如在2952、2871 和1710 cm-1處，表明β-CD 與薄荷油的簡(jiǎn)單混勻物與包合物存在結(jié)構(gòu)上的差異，表明包合物形成了新的結(jié)構(gòu)。

薄荷油紅外光譜信息復(fù)雜，而被β-CD 包合后，復(fù)雜的光譜信息消失，因此包合物與β-CD 紅外光譜類似。在包合物紅外光譜中，揮發(fā)油在2957、2871、1736、1456 和1048 cm-1處的特征峰消失了；710、1367 cm-1處吸收峰減弱。說(shuō)明了基團(tuán)被包進(jìn)了β-CD 的空腔，一個(gè)新的包合物形成了。一旦客體分子進(jìn)入了β-CD 的空腔，它就會(huì)產(chǎn)生限制，減少其伸縮振動(dòng)，并削弱典型的峰值[29]。與β-CD 紅外光譜相比，包合物的紅外光譜在1710 cm-1產(chǎn)生新峰；在3374 cm-1有明顯的偏移；在1411、1367、1330、1157、1076、1026、944 cm-1特征峰強(qiáng)度更大，表明包合物與β-CD 是不同的物相[31]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高速剪切法和冷凍干燥法制備薄荷油β-CD 包合物，實(shí)驗(yàn)證明高速剪切法比攪拌法效率高，含油率和包合率都相對(duì)較高；冷凍干燥法工序簡(jiǎn)單且收率高，平均收率為97.6%。通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了薄荷揮發(fā)油的包合工藝，得出最優(yōu)的包合工藝修正為：β-CD 與揮發(fā)油比例為9:1（g/mL），包合溫度55 ℃，β-CD 含量17%，得到包合物含油率為10.9%，揮發(fā)油包合率為97.6%；綜合得分為99.7，RSD 值為1.59%。因此，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值基本一致。包合物用HPLC 測(cè)得胡薄荷酮含量為2.465 mg/g；采用FTIR 分析證明了包合物新物相的形成；證明了包合方法可靠，對(duì)于揮發(fā)油包合的工藝有一定指導(dǎo)作用。