響應面法優(yōu)化黑玉米粒多糖提取工藝及其抗氧化活性分析

王 燕，段雪偉，張敏君，楊慧文，劉 冰，由天輝,

（1.廣東藥科大學護理學院，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006）

黑玉米（Zea maysL.）是被子植物門單子葉植物綱，禾本目玉蜀黍屬植物[1]。黑玉米是玉米栽培品種的一種特殊類型，因富含大量黑色素而呈現黑色[2]。黑玉米渾身都是寶，其粒、須、苞葉、芯、秸稈都可生產使用，且營養(yǎng)豐富，黑玉米粒中多糖、氨基酸等含量均超過了黃玉米粒，而且微量元素硒的含量是黃玉米粒的3～8.5 倍[3-4]。

多糖是一種廣泛分布于動植物、藻類及微生物中的天然大分子聚合物，其由10 個以上的單糖通過α-或β-糖苷鍵聚合形成[5]。多項研究結果表明，植物多糖具有增強免疫力[6]、抗疲勞[7]、抗氧化[8]、抑癌[9]、降血糖[10]、降血脂[11]、抗病毒[12]等功效。目前研究表明黑玉米粒多糖具有抗疲勞、降血糖等功效，楊占群等[13-14]報道黑玉米粒多糖能夠有效延長負重小鼠的運動時間，提高肌糖原和肝糖原的含量，降低尿素氮和乳酸的含量。Zhang 等[15]研究表明黑玉米粒多糖對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠有顯著的降血糖作用。而有關黑玉米粒多糖體外抗氧化活性的研究報道不多，因此有必要對黑玉米粒多糖的提取方法開展研究，并探討其體外抗氧化活性。

植物多糖的提取方法有熱水浸提法、酶解萃取法、微波或者超聲波輔助萃取法等[14]。魏俊青等[3]用纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶分步酶法提取紫玉米多糖，多糖得率僅為8.42%，可見單用酶法得率較低。楊占群等[14]采用微波輔助酶法提取黑玉米多糖，多糖得率為49.21%。關海寧等[16]用超聲輔助酶法提取黑玉米多糖，多糖得率為46.01%。微波或超聲波輔助酶法均可大大提高黑玉米多糖的得率，但酶解法成本較高[17]，且采用微波輔助法得到的多糖分子量范圍過廣，會導致分支鏈分子質量的下降[18]，因而需要在保證提取率的同時降低成本，優(yōu)化提取方法。超聲波輔助熱水提取法可利用超聲波產生高速、強烈的空化效應增加固體與液體的界面接觸，加速植物的高效萃取速度[19]，該方法操作簡單，成本較低，具有高重現性被廣泛應用于多糖提取[20]。關海寧等[21]用超聲輔助水提醇沉法萃取黑玉米粒多糖，在超聲功率180 W、超聲溫度60 ℃、pH6.8、醇沉濃度75%的最佳操作條件下，提取1 次時多糖得率為16.11%。而研究發(fā)現提取時間、提取次數、液料比和超聲功率是超聲輔助提取多糖工藝優(yōu)化中極受關注的變量參數[22-26]，同時對原材料進行預處理有利于除雜[27]，也有助于提高多糖提取率，因此本文對原材料進行浸泡預處理，并將提取次數、提取時間和料液比等因素作為考察條件開展更全面的提取工藝優(yōu)化，旨在進一步提高超聲波輔助水提醇沉法對黑玉米粒多糖的提取效率，并考察黑玉米粒多糖對DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率，對其體外抗氧化活性進行研究，為其開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮黑玉米 吉林省金塔實業(yè)（集團）股份有限公司；苯酚、濃硫酸 分析純，廣東廣試試劑科技有限公司；無水乙醇 分析純，天津市大茂化學試劑廠；葡萄糖 分析純，常德比克曼生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

SN-QX-65 型超聲波清洗機 上海市尚儀儀器設備有限公司；DD-6M 型低速離心機 長沙市平凡儀器儀表有限公司；RE-5299 型旋轉蒸發(fā)器 廣州市星爍儀器有限公司；Multiskan FC 型酶標儀 賽默飛世爾科技公司；VORTEX-5 型漩渦混合儀 ?？谑衅淞重悹杻x器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑玉米粒多糖的提取 黑玉米粒曬干后，95%乙醇浸泡過夜，50 ℃干燥至恒重，粉碎過60 目篩。將脫脂粉碎后的黑玉米粒粉末與去離子水以料液比1:20（g/mL）混合，70 ℃、100 W 超聲提取1 h；然后3000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液，沉淀物再次超聲輔助水提，重復以上步驟2 次；將2 次離心所得上清液旋蒸，濃縮至原液體積的1/5；向濃縮液中加入3 倍體積的95%乙醇沉淀，不斷攪拌，4 ℃靜置過夜后，3000 r/min、4 ℃離心10 min，收集沉淀，沉淀物用去離子水溶解后旋蒸，冷凍干燥得黑玉米粒粗多糖，于干燥器中4 ℃保存，用于體外抗氧化活性測定。

1.2.2 單因素實驗 以黑玉米粒為原材料，采用超聲輔助水提醇沉法提取多糖進行單因素實驗考察。在固定料液比1:20（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時間60 min、提取2 次的基礎上，分別考察超聲波功率（60、80、100、120、140 W）對多糖得率的影響；在固定料液比1:20（g/mL）、提取溫度70 ℃、超聲功率100 W、提取2 次的基礎上，分別考察提取時間（20、30、40、50、60、70、80 min）對多糖得率的影響；在固定料液比1:20（g/mL）、超聲功率100 W、提取時間60 min、提取2 次的情況下，分別考察不同提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對多糖得率的影響；在固定提取溫度70 ℃、超聲功率100 W、提取時間60 min、提取2 次的情況下，分別考察不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對多糖得率的影響；在固定料液比1:20（g/mL）、提取溫度70 ℃、超聲功率100 W、提取時間60 min 的基礎上，分別考察提取次數（1、2、3、4、5 次）對黑玉米粒多糖得率的影響。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗 在單因素實驗的結果上，基于Box-Behnken 試驗設計原理[28]，選用對多糖得率影響較大的提取次數、料液比、提取溫度、提取時間為自變量，以黑玉米粒多糖的得率為觀察指標，設計四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，試驗因素和水平設計如表1 所示。

表1 響應面因素與水平設計Table 1 Response surface factors and level design

1.2.4 多糖含量的測定 用苯酚-濃硫酸法[29]測定黑玉米粒多糖含量，以葡萄糖標準品質量濃度為x，吸光度為y，繪制標準曲線方程為y=5.8155x+0.0798，R2=0.9946。配制1 mg/mL 的黑玉米粒多糖溶液，用去離子水稀釋至0.1 mg/mL，準確吸取40 μL 待測液，加入體積分數6%的苯酚溶液40 μL 及濃硫酸200 μL，靜置30 min 后，在波長490 nm 處測定吸光度值，按下式計算多糖得率：

式中：C 為樣品溶液中黑玉米粒多糖質量濃度，mg/mL；V 為提取液總體積，mL；N 為提取液稀釋倍數；M 為黑玉米粒原料粉末重量，mg。

1.2.5 黑玉米粒多糖抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH·清除率測定 參考文獻[30-31]操作方法并稍加修改：配制0.1 mmol/L DPPH 溶液，取質量濃度分別為1、2、4、6、8、10 mg/mL 的黑玉米粒多糖溶液100 μL，加入DPPH 溶液100 μL，搖勻，置暗處反應30 min，在波長517 nm 處測其吸光度為A1。取100 μL 樣品溶液加入100 μL 無水乙醇，在波長517 nm 處測定吸光值為A2。取100 μL 蒸餾水加入100 μL DPPH 溶液，在波長517 nm 處測定吸光值為A3，以抗壞血酸為陽性對照，按下式計算自由基清除率：

1.2.5.2 ABTS+自由基清除率測定 參考文獻[32-33]操作方法并稍加改動：配制7 mmol/L ABTS 溶液、2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液，將兩者等比例混勻，室溫避光反應12 h 以上，取適量混合液與無水乙醇混合稀釋，使其在波長734 nm 時的吸光度值為0.70±0.02，即得到ABTS 工作液。分別取40 μL 的濃度分別為1、2、4、6、8、10 mg/mL 的黑玉米粒多糖溶液加入4 mL ABTS，均勻混合后，30 ℃避光反應20 min，在734 nm 處檢測其吸光度為A1。取40 μL 樣品溶液加入4 mL 蒸餾水，在734 nm 處測定吸光值為A2，取40 μL 蒸餾水加入4 mL ABTS 工作液，在734 nm 處測定吸光值為A3，以抗壞血酸為陽性對照，按下式計算自由基清除率：

1.2.5.3 ·OH 清除率測定 參考文獻[34]的操作方法并略微修改：取質量濃度分別為1、2、4、6、8、10 mg/mL 的黑玉米粒多糖溶液1 mL，與1 mL FeSO4溶液（6 mmol/L）、1 mL H2O2溶液（6 mmol/L）混勻，反應10 min，再加入1 mL 水楊酸溶液（6 mmol/L），37 ℃水浴30 min，測定510 nm 下吸光度為A1。用1 mL 蒸餾水代替水楊酸溶液測得吸光度為A2。用1 mL 蒸餾水代替樣品溶液測得吸光度為A3，以抗壞血酸為陽性對照，按下式計算·OH 清除率：

1.3 數據處理

所有實驗至少重復3 次，數據以平均值±標準差表示，采用Design-Expert 12 軟件完成響應面設計并進行數據分析，并采用Duncan 檢驗對各數據進行比較，P<0.01 為極顯著差異，P<0.05 為顯著差異；采用GraphPad prism 8 進行作圖及差異性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲功率對多糖得率的影響 從圖1 可以看出，在一定的超聲功率范圍內，隨著超聲功率的增大，黑玉米粒多糖得率明顯提高，當超聲功率為100 W時，多糖得率為39.21%，合適的超聲功率有助于多糖的釋放。但當超聲功率增加至120 W 時，黑玉米粒多糖得率與超聲功率100 W 時的得率相比沒有明顯差異，繼續(xù)增加超聲功率至140 W 時，多糖得率反而顯著降低（P<0.05）。研究發(fā)現適當功率的超聲波有助于多糖的釋放，但過高功率的超聲會導致提取溶液中的多糖濃度增加，混合物黏度的增加會引起內聚力的增加，空化作用減弱[23]，并且多糖提取的同時伴隨著多糖的降解，過高的超聲功率還可能增加機械斷裂效應，導致更多大分子多糖的降解[35-36]，從而降低多糖得率。因此最終確定最佳超聲功率為100 W。

圖1 超聲功率對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響 由圖2 可知，當提取時間在20～60 min 之間逐步延長，多糖得率也隨之提高，當提取時間為60 min 時，多糖得率達到39.23%。繼續(xù)增加提取時間多糖得率卻降低，原因是在合適的范圍內延長超聲時間，細胞受到超聲波機械和空化作用增強，細胞壁破裂增多，多糖溶出增多，會導致多糖得率的升高[24]，但是提取時間過長會由于超聲波空穴效應使多糖發(fā)生降解[22]，并易導致黑玉米粒中其他成分釋放，從而影響多糖得率[27,37]?？紤]超聲提取時間在50、60、70 min 時所提取的多糖得率有明顯差異，因此選取50、60、70 min 來進行響應面試驗。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

2.1.3 提取溫度對多糖得率的影響 溫度通過影響多糖分子之間的熱效應，進而改變細胞膜的通透性和溶液黏度[38]。由圖3 可知，隨著溫度的升高，黑玉米粒多糖的得率也隨之升高，當溫度為70 ℃時，多糖得率達到39.35%。這是由于溫度的上升增加了細胞膜的通透性和傳熱動力，使細胞內物質加快擴散利于物質浸出；當溫度高于70 ℃，多糖得率卻降低，原因為溫度過高易使多糖分解，破壞多糖結構從而影響提取效果[37,39]?？紤]超聲提取溫度在60、70、80 ℃時對多糖得率的影響有統(tǒng)計學差異，因此選取60、70、80 ℃為優(yōu)化工藝的提取溫度。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

2.1.4 料液比對多糖得率的影響 料液比可影響細胞內外滲透壓，適當的料液比不但有利于多糖的溶出，并且能節(jié)約浸提液[40]。由圖4 可知，當料液比在1:20（g/mL）以下時，多糖得率隨著溶劑用量的增加而提高，當液料比為1:20（g/mL）時，多糖得率達到38.21%。這是由于隨著溶劑用量增加，多糖更易擴散，黑玉米粒粉末與溶劑的接觸面積增大，反應更充分，利于多糖的析出，因此得率升高。繼續(xù)增加溶劑用量，多糖得率反而下降，原因為達到一定比例后，溶劑用量的增加可能導致其他非多糖物質的析出，并影響多糖的醇沉，從而影響得率[37]?？紤]料液比在1:15、1:20、1:25（g/mL）時對多糖得率的影響有統(tǒng)計學差異，因此選擇料液比1:15、1:20、1:25（g/mL）來進行響應面優(yōu)化。

圖4 料液比對多糖得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides

2.1.5 提取次數對黑玉米粒多糖得率的影響 由圖5可知，隨著提取次數的增加，多糖得率先升高，后逐漸下降，在提取2 次時，黑玉米粒多糖得率達到39.3%，后續(xù)增加提取次數，多糖得率反而下降。由于超聲波與細胞壁共同產生“屏障效應”，因此單次超聲輔助提取多糖類活性成分往往得率較低，需要多次提取來提高得率[23]，而提取次數過多易導致多糖結構破壞，使多糖得率反而下降[37]，因此選擇提取次數為1、2、3 次進行響應面試驗。

圖5 提取次數對多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on the yield of polysaccharides

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗結果 基于黑玉米粒多糖單因素實驗結果，以多糖得率（Y）為考察指標，根據統(tǒng)計學分析結果選擇對多糖得率影響有統(tǒng)計學差異的四個因素（提取次數、料液比、提取溫度與提取時間）進行四因素三水平響應面試驗，確定最佳提取工藝條件，結果見表2。

表2 響應面試驗設計及試驗結果Table 2 Experimental design and results of the response surface methodology

利用表2 實驗數據進行回歸擬合，得黑玉米粒多糖得率Y 對各因素回歸方程的模型為：Y=39.23+7.89A+2.12B+4.19C+4.13D-3.7AB-0.7975AC+3.04AD-3.66BC+2.9BD+2.81CD-5.49A2-6.67B2-6.55C2-8.17D2。

回歸模型方差分析結果見表3。從表3 得出，此模型極顯著（P<0.0001）；失擬項不顯著（P>0.05），說明此回歸模型較為理想；R2=0.96、R2Adj=0.9201，表明模型準確度高，可用于優(yōu)化多糖提取得率。根據模型中的P值可以得出，A、C、D、A2、B2、C2、D2對黑玉米粒多糖得率的影響都為極顯著（P<0.01），而一次項B 和交互項AB、AD、BC、BD、CD 均表現為差異顯著（P<0.05）。各因素對多糖得率的影響依次為A（提取次數）>C（提取溫度）>D（提取時間）>B（料液比）。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations

2.2.2 響應面交互作用分析 各因素交互作用的響應面和等高線圖見圖6～圖11。響應面曲面的陡峭程度反映了不同因素對黑玉米粒多糖得率的影響程度，響應面越陡，說明該因素對結果的影響越大，反之對試驗結果影響越小[41-42]。等高線呈橢圓形，說明兩個因素之間存在顯著交互作用，呈圓形則說明交互作用對于響應值沒有顯著影響[43]。由圖6～圖11 可知，AB、AD、BC、BD、CD 所形成的響應面曲面坡度較陡峭，其等高線呈橢圓形，表明AB、AD、BC、BD、CD 各自交互作用明顯，對多糖得率的影響顯著。對比可知，與表3 模型方差分析結果一致。

圖6 提取次數和料液比對多糖得率的影響Fig.6 Influence of extraction times and solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides

圖8 提取次數和提取時間對多糖得率的影響Fig.8 Influence of extraction times and extraction time on the yield of polysaccharides

圖9 料液比和提取溫度對多糖得率的影響Fig.9 Influence of solid-liquid ratio and extraction temperature on the yield of polysaccharides

圖10 料液比和提取時間對多糖得率的影響Fig.10 Influence of solid-liquid ratio and extraction time on the yield of polysaccharides

圖11 提取溫度和提取時間對多糖得率的影響Fig.11 Influence of extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharides

2.2.3 最佳條件確定與回歸模型的驗證 基于回歸模型預測多糖提取的最佳條件為提取次數2.56 次，料液比1:20.491（g/mL），提取溫度73.921 ℃，提取時間59.333 min，在此條件下黑玉米粒多糖的理論得率為41.672%?？紤]到實際操作，調整最佳提取條件為提取次數3 次、料液比1:20（g/mL）、提取溫度74 ℃、提取時間60 min 時，在此工藝條件下進行3次重復驗證實驗，黑玉米粒多糖實際得率為41.09%±0.59%，與模型預測值高度相符，驗證了此模型的有效性。本文在預先浸泡處理的基礎上，降低超聲功率、延長提取時間、增加提取溫度和提取次數，最終得出了高于文獻[21]的黑玉米粒多糖提取得率，工藝簡便，適用性強，對黑玉米粒多糖的開發(fā)有實用意義。

2.3 體外抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH·清除率試驗 黑玉米粒多糖的DPPH·清除能力結果見圖12。DPPH·具有單一電子，其醇溶液呈紫色，在517 nm 處具有最大吸收。有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在517 nm 吸光值下降，從而可評價樣品的抗氧化能力[44]。由圖12 可知，當濃度為1～10 mg/mL時，黑玉米粒多糖對DPPH·的清除能力隨質量濃度的增大而增強，其IC50為1.959 mg/mL，顯著高于同為禾本科植物的玉米須多糖對DPPH·的清除能力[45]。結果表明，黑玉米粒多糖的DPPH·清除率在一定的范圍內與多糖濃度成正相關，黑玉米粒多糖對DPPH·的清除能力較強，但其效果不如抗壞血酸明顯。

圖12 黑玉米粒多糖對DPPH·的清除作用Fig.12 Scavenging effect of polysaccharides from black corn kernel on DPPH·

2.3.2 ABTS+·清除率試驗 黑玉米粒多糖的ABTS+·清除能力結果見圖13。ABTS+·被過二硫酸鉀氧化生成綠色的ABTS 溶液，在734 nm 處有最大吸收，當一個物質加入到ABTS 溶液后，溶液褪色，在734 nm吸光度值降低，說明該物質具有抗氧化能力[46]。從圖13 中可以看出黑玉米粒多糖濃度增加時，清除ABTS+·作用越強。當黑玉米粒多糖濃度為1～6 mg/mL時，黑玉米粒多糖對ABTS+·的清除率由40.34%上升至88.59%；當濃度為8 mg/mL 時，其對ABTS+·基的清除率達到100%，與陽性藥抗壞血酸的清除效果一樣。經計算，黑玉米粒多糖清除ABTS+·的IC50為1.529 mg/mL，顯著高于同為禾本科植物的玉米秸稈多糖對ABTS+·的清除能力[47]，說明黑玉米粒多糖具有很強的ABTS+·清除能力。

圖13 黑玉米粒多糖對ABTS+·的清除作用Fig.13 Scavenging effect of polysaccharides from black corn kernel on ABTS+·

2.3.3 ·OH 清除率試驗 黑玉米粒多糖的·OH 清除能力結果見圖14。H2O2和亞鐵離子發(fā)生反應形成·OH，加入水楊酸后可生成紫色化合物（2,3-二羥基苯甲酸），在510 nm 處具有最大吸收峰，當添加·OH 清除劑時，體系色澤變淺，吸光度降低[48]。由圖14 可知，隨著黑玉米粒多糖濃度的增大，黑玉米粒多糖對·OH 的清除效果也隨之增加，當濃度為1～10 mg/mL 時，黑玉米粒多糖對·OH 的清除率由54%上升至81.54%，略低于陽性藥抗壞血酸的清除率。其清除·OH 的IC50為0.3554 mg/mL，顯著高于同為禾本科植物的玉米芯多糖對·OH 的清除能力[49]。結果表明黑玉米粒多糖清除·OH 活性與其濃度呈一定的線性關系，說明黑玉米粒多糖具有較好的·OH 清除能力。

圖14 黑玉米粒多糖對·OH 的清除作用Fig.14 Scavenging effect of polysaccharides from black corn kernel on ·OH

3 結論

本研究以黑玉米粒為原料，以多糖提取量為指標，通過響應面法優(yōu)化獲得黑玉米粒多糖提取的最優(yōu)工藝條件：提取3 次、料液比1:20（g/mL）、提取溫度74 ℃、提取時間60 min，在此條件下測得的黑玉米粒多糖的得率為41.09%±0.59%，對于今后實際生產具有指導意義。同時對黑玉米粒多糖體外抗氧化能力進行測定，其對DPPH·、ABTS+·、·OH 清除率的IC50分別為1.959、1.529、0.3554 mg/mL，結果表明黑玉米粒多糖具有較高的體外抗氧化能力。因此，本研究為今后黑玉米的綜合開發(fā)利用奠定了基礎，也為開發(fā)天然抗氧化劑和功能食品提供了科學依據。