香蕉枯萎病拮抗放線菌8N—10的分離鑒定及抑菌效果評(píng)價(jià)

王飛+周登博+廉法欽+陳宇豐+高祝芬+戚春林+張錫炎

摘要：為了分離對(duì)香蕉枯萎病病原菌有拮抗作用的放線菌，對(duì)菌株8N-10進(jìn)行鑒定及測(cè)定抗菌活性。采用梯度稀釋涂布平板法和平板對(duì)峙法分離拮抗菌，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征、16S rDNA序列測(cè)定及建樹分析確定其分類學(xué)地位。用平板對(duì)峙的方法測(cè)定菌株對(duì)9種香蕉病原菌的拮抗作用，最后用盆栽試驗(yàn)的方法驗(yàn)證菌株8N-10對(duì)香蕉枯萎病的防效。結(jié)果表明，共分離出10株拮抗放線菌，初步鑒定拮抗性最好的菌株8N-10為諾爾斯氏鏈霉菌（Streptomyces noursei）對(duì)香蕉枯萎病病原菌4號(hào)小種的抑菌帶達(dá)（15.5±0.65） mm。菌株8N-10對(duì)所有供試病原菌均具有不同程度的拮抗活性，表現(xiàn)出良好的廣譜抗菌特性。其中，菌株8N-10對(duì)香蕉葉緣枯斑病病原菌（Alternaria musae）、粉蕉葉枯病病原菌（Pestalogiopsis sp.）、香蕉長(zhǎng)形斑病病原菌（Curvularia fallax）的抑菌帶均達(dá)到10 mm以上，顯示了較強(qiáng)的抑制活性。菌株8N-10發(fā)酵液對(duì)香蕉枯萎病的相對(duì)防治率達(dá)92.708%，具有很好的防治效果。諾爾斯氏鏈霉菌8N-10對(duì)香蕉枯萎病的抑菌活性高，且其抑菌譜廣，具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎?。晦卓咕?；諾爾斯氏鏈霉菌

中圖分類號(hào)： S476

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0179-05

香蕉枯萎病，別稱巴拿馬病、黃葉病，是由尖孢鐮刀菌古巴?；鸵鸬臍缧酝羵骶S管束病害[1]。該菌分為4個(gè)生理小種[2]，其中4號(hào)小種侵染范圍最廣，幾乎危害所有的香蕉品種。目前該病已經(jīng)傳遍我國(guó)廣東、廣西、福建、云南、海南等主要香蕉種植產(chǎn)區(qū)[3]，因此分離具有拮抗作用的放線菌，從而達(dá)到生物防治香蕉枯萎病的效果不失為一個(gè)很有意義的研究方向。生物防治是植物病蟲害綜合治理的重要手段，是保護(hù)生態(tài)環(huán)境、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保障[4]。何欣等研究發(fā)現(xiàn)施用生物有機(jī)肥能顯著促進(jìn)香蕉植株生長(zhǎng)，有效降低香蕉枯萎病的發(fā)病指數(shù)[5]。隨著人們的不斷探究，發(fā)現(xiàn)放線菌中的鏈霉菌對(duì)香蕉枯萎病菌的抑制作用非常明顯[6]。秦涵淳等用分離出的2株放線菌發(fā)酵液進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，結(jié)果對(duì)香蕉枯萎病防效達(dá)86%以上，極顯著高于惡霉靈藥劑處理[7]。本研究對(duì)采集的香蕉根際土壤放線菌進(jìn)行了分離篩選，選其中1株對(duì)香蕉枯萎病菌拮抗作用最強(qiáng)的的放線菌 8N-10 進(jìn)行菌株鑒定，并測(cè)定該菌株對(duì)香蕉枯萎病的抑制效果以及菌株對(duì)其他香蕉病原菌的廣譜拮抗性能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌為香蕉枯萎病病原菌（Fusarium oxysporium f. sp. cubense 4，F(xiàn)OC4）、香蕉長(zhǎng)形斑病菌（Curvularia fallax）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉大灰斑病菌（Curvularia lunata）、貢蕉眼斑病菌（Bioplaris oryzae）、香蕉果尖腐爛病菌（Deightoniella troulosa）、香蕉葉緣枯斑病菌（Alternaria musae）、貢蕉煙頭病菌（Fusarium sp.）、粉蕉葉枯病菌（Pestalogiopsis sp.）均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存[8]。供試土壤為海南省臨高縣南寶鎮(zhèn)（109°51′18″E，19°47′3″N）香蕉園健康植株根際土壤。除去石子、根系等雜物，混勻后用無菌封口袋采集，于 4 ℃ 冰箱保存。培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[9]的方法配制。放線菌分離和培養(yǎng)采用高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，倒平板前加入0005% 的重鉻酸鉀來抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)；用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行病原菌的培養(yǎng)以及拮抗試驗(yàn)；鑒定用培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[10]的方法配制。

1.2 拮抗放線菌的分離與篩選

1.2.1 土壤放線菌的分離 稱取土樣5 g，加入45 mL無菌水，于28 ℃、200 r/min的搖床中振蕩1 h，吸取上清液用無菌水逐級(jí)稀釋成10-2、10-3和10-4濃度，每個(gè)濃度各吸取 100 μL 涂布到含重鉻酸鉀的高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，封口膜封口后倒置培養(yǎng)在28 ℃的生化培養(yǎng)箱中，適時(shí)挑取不同形態(tài)的單個(gè)菌落分離劃線，純化并保存。

1.2.2 篩選拮抗放線菌 采用瓊脂塊平板對(duì)峙培養(yǎng)法[11]篩選拮抗放線菌，用打孔器截取直徑5 mm的香蕉枯萎病病原菌菌餅于PDA平板中央，并在周圍4個(gè)角距離病原菌邊緣 2.5 cm 處接種待測(cè)菌株，對(duì)照只接病原菌菌餅，倒置培養(yǎng)在28 ℃的生化培養(yǎng)箱中，對(duì)照組菌絲鋪滿培養(yǎng)基時(shí)觀察試驗(yàn)組抑菌情況，測(cè)量抑菌帶的寬度。根據(jù)有無抑菌帶篩出對(duì)FOC4有拮抗效果的菌株，連續(xù)接種5代進(jìn)行復(fù)篩，選取抑菌帶最寬的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3 拮抗菌株的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 將拮抗菌株劃線接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基，28 ℃插片培養(yǎng) 7～14 d，顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征。

1.3.2 培養(yǎng)特征觀察 采用文獻(xiàn)[12]提供的方法，將拮抗菌株分別接種在高氏一號(hào)、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)8～15 d，觀察培養(yǎng)基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的生長(zhǎng)狀況和可溶性色素的顏色。

1.3.3 生理生化特性測(cè)定 測(cè)定拮抗菌株明膠液化、酯酶、脲酶、淀粉水解、纖維素利用、硝酸鹽還原、H2S的產(chǎn)生、pH值和氯化鈉耐受范圍、碳源利用、氮源利用等生理生化特性[10]。

1.3.4 細(xì)胞壁化學(xué)成分分析 采用快速薄板層析法[13]對(duì)菌株8N-10的全細(xì)胞水解液的氨基酸和糖型進(jìn)行分析。

1.3.5 分子生物學(xué)鑒定 采用堿裂解法提取基因組DNA[14]，用通用引物27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL，10 μL DNA模板、引物1 492R、27F各17 μL、25 μL DreamTaqTMGreen PCR master mix、22 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序獲得的16S rDNA序列通過Blast程序、BioEdit、Mega 6.0軟件進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 抗菌譜的測(cè)定

將指示真菌菌盤接種在PDA平板中央，在真菌菌餅周圍四角距離2.5 cm處接種8N-10菌株，對(duì)照只接病原菌菌餅，倒置培養(yǎng)在28 ℃的生化培養(yǎng)箱中，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。待對(duì)照長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)觀察測(cè)量抑菌帶的寬度并拍照記錄。

1.5 拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)FOC4抑制作用的測(cè)定

1.5.1 拮抗菌發(fā)酵液的制備 將拮抗菌接種到大豆粉液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。

1.5.2 制備FOC4孢子懸浮液 選取FOC4菌絲鋪滿平板的PDA培養(yǎng)基，用無菌水配制成1×106 CFU/mL孢子懸浮液。

1.5.3 拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)FOC4孢子萌發(fā)影響情況的測(cè)定 將拮抗菌發(fā)酵液8 000 r/min離心5 min，上清液用微孔濾膜過濾除菌后與FOC4孢子懸浮液等體積混合均勻置于玻片上，光照培養(yǎng)在28 ℃、濕度為80%的人工氣候箱中24 h，無菌水對(duì)照。在顯微鏡下觀察，以孢子萌發(fā)的芽管長(zhǎng)度達(dá)到或超過孢子直徑長(zhǎng)度的一半定為萌發(fā)[15]，并計(jì)算各處理的孢子萌發(fā)率，以5次重復(fù)的平均值作為測(cè)定結(jié)果。

孢子萌發(fā)抑制率=[（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率]×100%。

1.5.4 拮抗放線菌8N-10對(duì)香蕉枯萎病抑制的盆栽效果測(cè)定 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為染病后澆清水、染病后澆不加拮抗菌的發(fā)酵液、染病后澆拮抗菌發(fā)酵液、不染病澆清水。每處理設(shè)20個(gè)重復(fù)。

種苗染病采用蘸根接種法[14]接種后置于室溫、自然光照條件下培養(yǎng)，每3 d澆1次水。待染病各組均有香蕉苗葉片變黃后，處理2施用無菌發(fā)酵液，處理3施用拮抗菌發(fā)酵液，每株灌注100 mL，每7 d澆1次發(fā)酵液。連續(xù)試驗(yàn)90 d后統(tǒng)計(jì)各處理病情指數(shù)（DSI）。

病情分級(jí)，0級(jí)為無癥狀；1級(jí)整株無變黃葉片；2 級(jí)為1株2片葉萎蔫；3級(jí)為全株 1/3～1/2 葉片萎蔫；4級(jí)為全株1/2株黃葉葉片萎蔫；5級(jí)為全株3/4 以上葉片萎蔫或死亡[16]。

DSI=∑（病害的級(jí)別×該級(jí)別的植株數(shù)）/供試植株數(shù)[16]。

相對(duì)防治效果=[（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)]×100%[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

初步篩選獲得10株拮抗放線菌，其中8N-10對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌帶最大，達(dá)到（15.5±0.65） mm，因此選取該菌株作進(jìn)一步研究。

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果 菌株8N-10的菌絲生長(zhǎng)旺盛，分枝明顯（圖1-A），無橫膈膜（圖1-B）。

2.2.2 培養(yǎng)特征結(jié)果 菌株8N-10在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖2所示，菌落在7種培養(yǎng)基上均呈近圓形，在ISP2、ISP4、ISP5、ISP7培養(yǎng)基上褶皺明顯，在ISP1、ISP2培養(yǎng)基上氣生菌絲呈粉末狀覆蓋在表層。具體形態(tài)特征見表1。

2.2.3 生理生化特性測(cè)定 在碳源利用方面菌株8N-10能很好地利用鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、水楊苷、可溶性淀粉、纖維二糖、山梨醇、D-果糖、α-乳糖、葡萄糖、蔗糖、D-甘露醇，能較好地利用松三糖、無水乳糖、肌醇、木聚糖、核糖、蜜二糖，對(duì)D-半乳糖利用效果不是很好，不能利用海藻糖、甘露醇；在氮源利用方面能很好地利用甘氨酸、羥基脯氨酸、纈氨酸，能較好地利用四水合鉬氨酸，在蛋氨酸、苯基丙氨酸、硫酸銨、硝酸銨、絲氨酸上生長(zhǎng)一般，在組氨酸、半胱氨酸上生長(zhǎng)不佳，不能在精氨酸、草胺酸、乙酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；菌株8N-10有淀粉水解能力；能使硝酸鹽還原；能產(chǎn)生尿素酶；能分解吐溫20，不能分解吐溫40和吐溫80；不產(chǎn)H2S；不能水解纖維素；能使明膠液化；pH值為4～10均可生長(zhǎng)；在鹽度為1%～2%時(shí)生長(zhǎng)，在2%以上不能生長(zhǎng)（表2）。

2.2.4 細(xì)胞壁化學(xué)成分 細(xì)胞壁化學(xué)成分分析顯示，菌株8N-10細(xì)胞壁含有谷氨酸、丙氨酸等，化學(xué)組分屬于Ⅰ型，其全細(xì)胞水解不含特征性糖，糖型為C。

2.2.5 16S rDNA堿基序列測(cè)定 放線菌8N-10用通用引物擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物大小在1 500 bp左右，測(cè)序得出序列長(zhǎng)度為1 422 bp。與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬的菌株進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與菌株8N-10同源性達(dá)99%的均為鏈霉菌。選取20個(gè)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析（圖3），菌株8N-10與Streptomyces noursei（諾爾斯氏鏈霉菌）聚為一支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征初步將菌株8N-10歸類為諾爾斯氏鏈霉菌。

2.3 抗菌譜測(cè)定結(jié)果

平板對(duì)峙結(jié)果顯示菌株8N-10抗菌譜廣，對(duì)所有供試病原菌均具有不同程度的拮抗活性。其中，菌株8N-10對(duì)香蕉葉緣枯斑?。▓D4-A）、粉蕉葉枯?。▓D4-B）、香蕉長(zhǎng)形斑?。▓D4-C）病菌的抑制活性較強(qiáng)，抑菌帶均達(dá)到10 mm以上，對(duì)長(zhǎng)形斑病抑制效果最好，抑菌帶達(dá)到13.30 mm（表3）。

2.4 拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)FOC4抑制作用測(cè)定結(jié)果

2.4.1 對(duì)FOC4孢子萌發(fā)抑制作用的測(cè)定結(jié)果 對(duì)照組的FOC4孢子萌發(fā)率達(dá)到了90.25%（圖5-A），經(jīng)拮抗菌發(fā)酵液處理的FOC4 孢子萌發(fā)率為5.16%（圖5-B），發(fā)酵液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)94.28%（圖5）。

2.4.2 盆栽防效結(jié)果 連續(xù)栽種90 d后，接染病原菌后澆清水（圖6-A）的一組香蕉苗全部死亡干枯，病情指數(shù)達(dá)到5；接染病原菌后澆無菌發(fā)酵液（圖6-B）的一組香蕉苗只剩4株依然存活，且剩余4株苗全株1/2葉片萎蔫，該組病情指數(shù)4.8；接染病原菌后澆加菌發(fā)酵液（圖6-C）的一組香蕉苗存活19株，1株干枯死亡，病情指數(shù)0.35，植株長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良；未接菌澆清水（圖6-D）的一組香蕉苗均能成活，但生長(zhǎng)狀況差。初步結(jié)果表明拮抗菌發(fā)酵液對(duì)香蕉枯萎病的相對(duì)防治效果為92.708%，且種苗生長(zhǎng)狀況良好（圖6）。

3 結(jié)論與討論

大量研究結(jié)果表明，應(yīng)用拮抗微生物能安全有效地防治果蔬病害[18-19]，目前人們已成功分離和篩選到數(shù)百種對(duì)果蔬病害有明顯抑制效果的拮抗微生物[20-22]，有數(shù)十種微生物已研發(fā)成菌劑在生產(chǎn)上應(yīng)用。但香蕉枯萎病的生物防治研究起步較晚，目前還沒有成功的商業(yè)化產(chǎn)品[22]。南寶蕉園的香蕉連續(xù)留芽10年，而枯萎病的發(fā)病率依然在10%以下，除了規(guī)范化的管理以外，其土壤環(huán)境必然有特殊之處。

本研究從南寶蕉園香蕉根際土壤中分離出10株拮抗放線菌，其中8N-10在平板上對(duì)枯萎病菌的抑菌帶達(dá)到 （15.5±0.65） mm，和同類研究中的15.3 mm的抑菌帶寬度相當(dāng)[17]。結(jié)合生理生化特征、分子生物學(xué)鑒定等結(jié)果初步將菌株8N-10歸類為諾爾斯氏鏈霉菌。以諾爾斯氏鏈霉菌作為生防菌防治香蕉枯萎病目前尚未有報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌8N-10的發(fā)酵濾液對(duì)香蕉枯萎病菌的孢子萌發(fā)有很好的抑制作用，抑制率達(dá)到94.28%。其發(fā)酵液對(duì)患病香蕉苗的治療效果很好，相對(duì)防治效果為92.708%，盆栽防控效果比俞魯?shù)葓?bào)道的防治效果為74%[23]要好，而且施用發(fā)酵液的香蕉苗營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)充足，長(zhǎng)勢(shì)良好。拮抗菌8N-10對(duì)香蕉的其他8種病害病原菌均有一定的抑制作用，其抑菌譜廣。其中，菌株8N-10對(duì)香蕉葉緣枯斑病、粉蕉葉枯病、香蕉長(zhǎng)形斑病的抑菌帶均達(dá)到10 mm以上，具有較強(qiáng)的抑制活性，但其廣譜抑菌效果不如黃霄等報(bào)道的類植物乳桿菌[24]。但綜合結(jié)果表明拮抗菌8N-10在香蕉病害的防治方面具有很好的開發(fā)價(jià)值。

農(nóng)用抗生素大多來源于放線菌，因此從放線菌中篩選拮抗菌一直是生防菌研究熱點(diǎn)[25]。諾爾斯氏鏈霉菌產(chǎn)生的化合物已有報(bào)道[26]，本研究所篩選出的菌株其有效活性成分還有待進(jìn)一步試驗(yàn)，其對(duì)病原菌的拮抗機(jī)理還有待進(jìn)一步探究。

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