維生素A和乙酸交互作用對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳成分合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

郭詠梅，劉陽，武汭，閆素梅，趙艷麗，郭曉宇

維生素A和乙酸交互作用對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳成分合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

郭詠梅，劉陽，武汭，閆素梅，趙艷麗，郭曉宇

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室，呼和浩特 010018

【目的】在前期研究發(fā)現(xiàn)維生素A（VA）對奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)內(nèi)乳脂和乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)具有顯著促進(jìn)效果的基礎(chǔ)上，以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究對象，添加乳脂肪合成前體物乙酸(acetic acid,AA)，旨在探究VA和AA二者在乳成分合成相關(guān)基因表達(dá)上是否存在互作關(guān)系，借此更系統(tǒng)地了解VA參與乳脂、乳蛋白合成的調(diào)控機(jī)制，為奶牛飼料中合理添加VA及改善乳品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。【方法】采用膠原酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞，將第三代BMECs分為6個處理組，分別加入不同濃度的VA和AA混合工作液， 6個處理組依次命名為對照組（0 mg·mL-1VA+0 mol·L-1AA）、AA處理1組（0 mg·mL-1VA+0 .006 mol·L-1AA）、AA處理2組(0 mg·mL-1VA+0.01 mol·L-1AA)、VA處理組(0.001 mg·mL-1VA+0 mol·L-1AA)、VAAA1組(0.001 mg·mL-1VA+0.006 mol·L-1AA)和VAAA2組(0.001 mg·mL-1VA+0.01 mol·L-1AA)。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液樣品，采用MTT法測定細(xì)胞增殖率；采用試劑盒法測定甘油三酯含量、乳脂和乳蛋白合成關(guān)鍵酶的活性；采用實時定量PCR技術(shù)測定并計算乳脂和乳蛋白合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量。【結(jié)果】添加VA后顯著提高了細(xì)胞增殖率（＜0.001），但添加AA、VA與AA的組合效應(yīng)均對細(xì)胞增殖率無顯著影響（＞0.05）。VA和AA在乳脂合成方面存在互作效應(yīng)，AA能提高BMECs內(nèi)的甘油三酯（TG）含量（=0.01），同步添加VA則對TG的合成產(chǎn)生明顯的抑制作用(=0.01)；AA能提高細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成酶（FASN）、乙酰輔酶A羧化酶（ACACA）的活性及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（）基因的表達(dá)（＜0.05；＜0.05；＜0.001），同時添加VA則極顯著地抑制（＜0.001;=0.01;＜0.01）；AA顯著提高了BMECs內(nèi)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）含量（=0.05）、p70核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）酶活性（＜0.001），并上調(diào)了κ-酪蛋白（）的基因表達(dá)（＜0.001），與β-酪蛋白（）的基因表達(dá)受到兩者互作效應(yīng)的影響（=0.02），同時添加VA與AA時會減弱單獨添加VA或AA后對與的基因表達(dá)的下調(diào)作用。【結(jié)論】AA處理組2對乳脂合成的促進(jìn)效果較好，VAAA2組較弱；AA處理1組對乳蛋白合成促進(jìn)作用較好，VAAA1組較弱。因此，單獨添加0.01 mol·L-1的AA對促進(jìn)乳脂合成較好，0.006 mol·L-1的AA則更利于乳蛋白的合成。

維生素A；乙酸；互作；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；乳成分

0 引言

【研究意義】2022年中央一號文件提出要把重點放在糧食生產(chǎn)和重要農(nóng)產(chǎn)品供給上，加快奶業(yè)生產(chǎn)規(guī)模，保證“菜籃子”產(chǎn)品供給。在乳品消費方面，由于我國人民生活水平的提高，消費者的需求不斷增加，且消費者更青睞使用國內(nèi)新鮮奶源加工而成的乳制品。奶業(yè)作為農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的重要標(biāo)志之一，同時為滿足消費內(nèi)需和初級農(nóng)產(chǎn)品的有效供給，我們國家的奶業(yè)急需加強(qiáng)內(nèi)功和核心競爭力[1]。乳脂肪和乳蛋白是乳中的主要成分，也是衡量乳品品質(zhì)的重要營養(yǎng)指標(biāo)。根據(jù)目前我們國家的奶業(yè)生產(chǎn)的飼料資源和生產(chǎn)環(huán)境等狀況，促進(jìn)乳蛋白合成和改善乳品質(zhì)在提高我國奶業(yè)核心競爭力方面屬于重中之重[2]。乳品質(zhì)直接影響奶牛養(yǎng)殖場及乳品廠的經(jīng)濟(jì)效益，改善牛奶成分，生產(chǎn)高質(zhì)量的鮮奶是提升奶牛生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。因此，如何通過營養(yǎng)調(diào)控措施來提高和改善牛奶質(zhì)量，增加其營養(yǎng)價值，尤其是提高牛奶乳脂肪和乳蛋白的含量，優(yōu)化牛奶組分是國際牛奶產(chǎn)業(yè)研究的熱點問題。【前人研究進(jìn)展】維生素A（VA）作為機(jī)體重要營養(yǎng)素之一，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝。有大量研究證明，飼料中添加維生素A會影響動物機(jī)體內(nèi)脂類分解代謝，大劑量的視黃醇灌服會導(dǎo)致大鼠肝臟中脂滴的累積[3]，還會增加不同亞型大鼠肝臟內(nèi)的膽固醇、脂肪酸及TG含量。VA通過影響脂質(zhì)分解代謝改善反芻動物的生產(chǎn)性能，從分娩前60 d至產(chǎn)后42 d，給奶牛飼喂17 000 IU/d的VA，其產(chǎn)奶量顯著高于飼喂50 000 IU/d的VA[4]，同時還促進(jìn)了乳脂和乳蛋白等乳成分的合成。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)體外添加VA在不同程度上提高了BMECs細(xì)胞增殖率及TG含量、乳脂乳蛋白合成相關(guān)酶活性和基因表達(dá)，且0.001 mg·mL-1的濃度促進(jìn)效果最好。牛乳中的脂肪酸主要來源于兩個部分，一部分是日糧經(jīng)過水解形成的脂肪酸，另一部分是瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的脂肪酸，主要包括乙酸（acetic acid, AA）和丁酸，為乳腺內(nèi)脂肪酸的合成提供了碳源，其在血液中的濃度直接影響了乳脂和乳蛋白的合成。有研究顯示，AA的濃度與乳腺組織合成乳脂的能力呈正向相關(guān)，同時對乳蛋白的合成也有一定調(diào)節(jié)作用，但濃度過高時脂肪組織利用較多。Purdie等[5]研究指出，奶牛陰外動脈灌注AA顯著增加了乳蛋白率，乳脂率也有增加的趨勢；塔娜等[6]研究結(jié)果表明，培養(yǎng)液中添加12 mmol·L-1的乙酸鈉能顯著上調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells, BMECs）中脂肪合成相關(guān)基因脂肪酸合成酶（FASN）、乙酰輔酶A羧化酶（ACACA）、二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma, PPARG）的表達(dá)，并且顯著提高細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）含量。在此之前，本課題組也進(jìn)行了AA對BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)及TG含量影響的探索，研究發(fā)現(xiàn)BMECs內(nèi)PPARG、瘦素[7]及ACACA、FASN的基因表達(dá)[8]均受到AA的正向調(diào)控，且最佳作用濃度均在8—12 mmol·L-1；生冉[9]研究表明，添加6 mmol·L-1的AA會下調(diào)BMECs中酪蛋白s1-酪蛋白（CSN1S1）mRNA的相對表達(dá)量；可以上調(diào)β-酪蛋白（CSN2）、κ-酪蛋白（CSN3）mRNA的相對表達(dá)量以及CSN2的蛋白表達(dá)水平。關(guān)于乳腺內(nèi)乳蛋白合成調(diào)控最受人們關(guān)注的是Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號途徑，AA對mTOR信號通路相關(guān)基因與JAK2、的表達(dá)也有一定的促進(jìn)作用，由此可以得出，AA作為乳脂合成的前體物同時影響著乳脂和乳蛋白的合成。【本研究切入點】乳脂、乳蛋白以及乳產(chǎn)量等都是反映奶牛產(chǎn)奶性能的重要指標(biāo)，在不同影響因素的作用下，乳脂合成的前體物AA不僅影響乳脂合成而且乳蛋白合成也受其影響，但VA對乳脂和乳蛋白合成的影響效果是否會被AA濃度變化改變，目前尚不得知?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒于此，本試驗旨在探究在添加不同濃度AA后，VA對BMECs內(nèi)乳脂乳蛋白合成的調(diào)控作用是否改變，探討二者之間是否存在互作關(guān)系，以便更系統(tǒng)地了解VA參與乳脂、乳蛋白合成的調(diào)控機(jī)制，為奶牛生產(chǎn)中VA的合理添加以及改善乳成分的合成提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要試劑包括：視黃酸（Sigma，貨號：R2625）、乙酸鈉（Sigma，貨號：S5636-500G）、培養(yǎng)基DMEM/F12（Gibco，貨號：12400-024）、PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa，貨號：DRR036A）、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa，貨號：DRR820A）、RNAiso Plus（TaKaRa，貨號：D9109B）。

1.2 試劑配制

VA貯備液的配制：將100 mg視黃酸RA溶于5 mL的DMSO溶液中，配制成20 mg·mL-1的VA母液，按照試驗要求將其稀釋成濃度分別為0、1.0 mg·mL-1的VA貯備液。

AA貯備液的配制：將乙酸鈉溶于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中配制成濃度為2.4 mol·L-1的母液，進(jìn)一步添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別稀釋配制成濃度為0.6、1.0 mol·L-1貯備液。

VA+AA工作液：經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，將上述貯備液分別配制成VA工作液（濃度為0、0.001 mg·mL-1）和AA工作液（濃度為0、0.006、0.01 mol·L-1），以制備符合各細(xì)胞組處理要求的工作液。工作液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后低溫避光保存。

1.3 BMECs的制備

BMECs的培養(yǎng)參照王新朋等[10]研究中所用的膠原酶消化法。于內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞清真冷庫采集奶牛乳腺組織樣，除去外層組織樣，按照3×雙抗的PBS、醫(yī)用酒精（75%，30 s）、含1×雙抗的PBS的順序依次清洗內(nèi)層組織塊。去掉上述組織表層后，于腺泡豐富處剪取1 mm3大小的小組織塊裝入離心管，剪成糊狀后加入等體積的II型膠原酶（0.5%）放入37 ℃培養(yǎng)箱中消化1 h，每20 min輕晃一次確保組織塊充分消化。然后用80目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，將濾液離心后棄上清。用PBS溶液清洗細(xì)胞沉淀后重新懸浮離心后棄上清，使細(xì)胞再次懸浮，接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)。原代細(xì)胞貼壁生長至80%—90%時，棄培養(yǎng)液，經(jīng)PBS溶液清洗和經(jīng)胰蛋白酶（0.05%）作用后，差速法純化細(xì)胞。終止消化后并傳代得到第三代BMECs。

1.4 試驗設(shè)計

本試驗在內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室進(jìn)行。采用二因素完全隨機(jī)試驗設(shè)計，將第三代BMECs隨機(jī)分為6個處理組，每組6個重復(fù)。6個處理組依次命名為對照組、AA處理組1、AA處理組2、VA處理組、VAAA組1和VAAA組2。試驗設(shè)計詳見表1。培養(yǎng)結(jié)束后采集樣本，并按照測定指標(biāo)的要求進(jìn)行檢測。其中，VA和AA的濃度的確定基于課題組前期研究結(jié)果，分別為0.001 mg·mL-1和0.006、0.01 mol·L-1。

表1 試驗設(shè)計

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 細(xì)胞增殖率 采用MTT法測定細(xì)胞增殖率。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)BMECs，饑餓培養(yǎng)24 h，根據(jù)上述試驗設(shè)計進(jìn)行后續(xù)試驗。每孔加入20 μL的MTT（5 mg·mL-1），置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后棄上清，并甩板拍干液體。每個培養(yǎng)孔中加入100 μLDMSO，用全自動酶標(biāo)儀（Synergy4, BioTek）振蕩10 min后于490 nm波長處測吸光值（OD490）。細(xì)胞存活率=試驗組OD490/對照組OD490×100%。

1.5.2 細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量 培養(yǎng)結(jié)束經(jīng)PBS溶液清洗細(xì)胞去除甘油，接著加入裂解液（200 mL/孔）作用10 min后離心5 min（12 000 r/min），于70 ℃加熱上清液10 min，離心5 min（2 000 r/min）后取上清，按照細(xì)胞甘油三酯酶法測定甘油三酯含量。

1.5.3 乳脂、乳蛋白合成關(guān)鍵酶的活性 培養(yǎng)完成后加PBS溶液清洗細(xì)胞后添加動物細(xì)胞裂解液（600 μL，含1%PMSF），冰浴30 min，收集細(xì)胞和裂解液后離心10 min（4 ℃，12 000 r/min），收集上清液低溫冷凍保存。測定指標(biāo)包括BMECs內(nèi)乳脂肪合成相關(guān)酶FAS、ACC、脂蛋白酯酶（lipoprteinlipase, LPL）、脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl-CoA desaturase, SCD）的活性，乳蛋白合成相關(guān)酶p70核糖體蛋白S6激酶1（p70 ribosomal protein S6 kinase, S6K1）的活性以及mTOR的含量。測定方法按照ELISA試劑盒的操作說明書進(jìn)行。

1.5.4 細(xì)胞內(nèi)乳脂、乳蛋白合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量 使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行RNA純度、濃度及總RNA完整性的測定。根據(jù)PrimeScript RT Master Mix試劑盒的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒對得到的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR（qRT PCR）分析，反應(yīng)體系為20 μL。以作為內(nèi)參基因，對乳脂合成相關(guān)基因[、、、、脂肪酸結(jié)合蛋白3（）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（）、]及乳蛋白合成相關(guān)基因[、、、真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（）、、、]的相對表達(dá)量進(jìn)行測定，上述基因的引物序列及qRT-PCR反應(yīng)程序參見文獻(xiàn)[11]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用EXCEL進(jìn)行初步統(tǒng)計整理，并用SAS 9.0軟件中2×3二因子設(shè)計的MIXED程序進(jìn)行分析，混合模型包括主效應(yīng)VA、AA及VA與AA交互作用。＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖率和甘油三酯含量

添加VA后顯著提高了細(xì)胞增殖率（表2，＜0.001），但添加AA、VA與AA的組合效應(yīng)均對細(xì)胞增殖率無顯著影響。BMECs內(nèi)TG含量受到VA及AA濃度的顯著影響（0.01），0.001 mg·mL-1VA組TG含量顯著低于0 mg·mL-1VA組；0.006、0.01 mol·L-1AA組TG含量均顯著高于0 mol·L-1AA組（＜0.05），且兩組間并無顯著差異；VA與AA的互作效應(yīng)對TG含量有極顯著影響（＜0.01），VA添加量為0時，添加0.006、0.01 mol·L-1AA后TG含量較高，尤以10 mol·L-1AA組最高，顯著高于其他各組（＜0.05）；VAAA2組與對照組較低，且與其余各組無顯著差異。

2.2 細(xì)胞內(nèi)乳脂合成關(guān)鍵酶活性及乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá)

BMECs內(nèi)ACC、FAS的活性在添加VA后顯著降低（表3，＜0.001，=0.01），同時受到VA與AA互作效應(yīng)的極顯著影響（＜0.001，＜0.01）。ACC活性以AA處理1組、AA處理2組較高，且顯著高于其他各處理組（＜0.05）；以VAAA2組最低。AA處理1組的FAS活性最高，其次是AA處理2組和VAAA1組，但三組之間沒有顯著差異，VAAA2組最低，顯著低于其他所有處理（＜0.05）。添加VA和AA有提高SCD活性的趨勢（=0.06，=0.06），0.006 mol·L-1AA組高于0 mol·L-1AA組；VA和AA的交互作用對SCD活性有明顯影響（=0.05），VAAA2組最高，明顯高于其他組合，其次是AA處理1組和VAAA1組，而其他組無顯著差異。VA與AA交互作用顯著影響了LPL活性（=0.01），以AA處理1組最高，且顯著高于對照組和AA處理2組（＜0.05），VA處理組、VAAA1組、VAAA2組三組次之，與AA處理1組之間差異不顯著。

表2 VA和AA對BMECs細(xì)胞增殖率和甘油三酯含量的影響

表3 VA和AA對BMECs內(nèi)乳脂合成關(guān)鍵酶活性的影響

由圖1可知，VA顯著降低了基因和的表達(dá)量（＜0.01；0.03；＜0.01）。添加0.01 mol·L-1AA后，PPARG基因表達(dá)量增加，并明顯高于0和0.006 mol·L-1AA組，而0 mol·L-1AA組則明顯高于0.006 mol·L-1AA組（＜0.001）。0.006、0.01 mol·L-1AA組ACACA的基因表達(dá)量趨向高于0 mol·L-1AA組（=0.10）。VA與AA共同作用時對表達(dá)有顯著影響（=0.03），以AA處理2組效果最好且顯著高于其他組（＜0.05），VAAA1組效果最弱。LPL的基因表達(dá)受到AA濃度的顯著影響（0.01），0.01 mol·L-1AA組顯著高于0、0.006 mol·L-1AA組（＜0.05）；VA與AA互作也顯著影響了基因的表達(dá)（＜0.05），其中AA處理2組、VA處理組和VAAA2組顯著提高（0.03），且三組間差異不顯著。與0 mg·mL-1VA處理組相比，0.001 mg·mL-1VA處理組基因的表達(dá)顯著增加（＜0.001），表達(dá)還受到VA和AA互作效應(yīng)的顯著影響（0.02），促進(jìn)作用以VAAA2組最佳，VAAA1組、VA處理組稍低，AA處理1組和AA處理2組與對照組差異不顯著（圖1）。SREBP1的基因表達(dá)未受到VA與AA的影響。FABP3的基因表達(dá)量隨AA濃度的增加顯著增加（＜0.05），其中0、0.006 mol·L-1AA組之間差異不顯著。

2.3 細(xì)胞內(nèi)乳蛋白合成關(guān)鍵酶活性及乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)

添加VA顯著降低mTOR活性（=0.02）；而AA的添加可以使mTOR活性顯著提高（=0.05），0 mol·L-1AA組顯著低于0.01 mol·L-1AA組（＜0.05），0.006 mol·L-1AA組分別與0、0.01 mol·L-1AA組的mTOR活性無顯著組間差異；同時添加VA和AA對mTOR活性影響不顯著。VA的添加會降低S6K1活性（＜0.001），AA的添加則顯著提高其活性（＜0.001），0 mol·L-1AA組效果顯著低于0.006、0.01 mol·L-1AA組（＜0.05），且這兩組間差異不顯著；VA和AA同時補(bǔ)加對S6K1活性影響不顯著（=0.19，表4）。

表4 VA和AA對BMECs內(nèi)乳蛋白合成關(guān)鍵酶活性的影響

如圖2所示，VA和AA濃度都能顯著影響B(tài)MECs內(nèi)的相對表達(dá)，0.001 mg·mL-1VA組顯著高于0 mg·mL-1VA組（＜0.01），0.006、0.01 mol·L-1AA組顯著低于0 mol·L-1AA組（＜0.05）。表達(dá)受到VA濃度的顯著影響，其中0.001 mg·mL-1VA組顯著低于0 mg·mL-1VA組（0.04），同時補(bǔ)充VA和AA時表達(dá)顯著降低（0.02），其中VAAA1組和VAAA2組下降最明顯。0.001 mg·mL-1VA組表達(dá)顯著高于0 mg·mL-1VA組（＜0.01）。的基因表達(dá)也隨AA添加濃度的增加顯著提高，0.01 mol·L-1AA組＞0.006 mol·L-1AA組＞0 mol·L-1AA組（＜0.001）。VA與AA互作效應(yīng)顯著影響的表達(dá)，各種組合的處理組相比對照組表達(dá)均降低（0.02）。AA濃度顯著影響的表達(dá)，0.006 mol·L-1AA組顯著高于0、0.01 mol·L-1AA組（＜0.01）。VA和AA濃度均顯著影響表達(dá)（＜0.05），0.001 mg·L-1VA組和0.01 mol·L-1AA組的表達(dá)分別依次高于0 mg·mL-1VA組（＜0.001）和0、0.006 mol·L-1AA組（＜0.001）。AA濃度顯著影響表達(dá)，0.01 mol·L-1AA組顯著高于0、0.006 mol·L-1AA組（＜0.001）。AA的添加量還顯著影響表達(dá)，0.006 mol·L-1AA組顯著高于0 mol·L-1AA組，0 mol·L-1AA組顯著高于0.01 mol·L-1AA組（＜0.001）。

3 討論

3.1 對細(xì)胞增殖率及甘油三酯含量的影響

VA是機(jī)體重要營養(yǎng)素之一，在細(xì)胞增殖分化、胚胎發(fā)育等生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。視黃酸受體（RAR）和類視黃醇X受體（RXR）是介導(dǎo)VA調(diào)控的兩種核受體家族，全反式視黃酸和9-順式視黃酸與受體結(jié)合后對上皮細(xì)胞增殖分化起到調(diào)控作用。細(xì)胞膜上的糖基視黃醇磷酸可能與膜的接觸抑制、分化識別環(huán)境等功能有關(guān)，因此VA可能與膜糖蛋白的合成有關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)VA的添加對BMECs的細(xì)胞增殖率有顯著的促進(jìn)作用，這與蘇芮等[11]的研究結(jié)果相似。齊利枝等[7]研究發(fā)現(xiàn)，添加AA的濃度與BMECs的細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)二次曲線劑量依賴關(guān)系，因此低劑量的AA可以提高BMECs的細(xì)胞增殖率，但是劑量過高則會抑制細(xì)胞的增殖。然而，本試驗中并未發(fā)現(xiàn)添加AA對細(xì)胞增殖率的影響，目前關(guān)于AA對細(xì)胞增殖率影響的研究較少，原因尚待進(jìn)一步研究。盡管共同添加VA和AA時差異不顯著，但VA處理組和VAAA1組在細(xì)胞增殖率的數(shù)值上比VAAA2組高，證明AA對VA的促細(xì)胞增殖作用有一定負(fù)面影響，添加VA的基礎(chǔ)上加入0.01 mol·L-1AA會抑制BMECs細(xì)胞增殖率，AA濃度相同時，加入VA組細(xì)胞增殖率要高于未添加組，證明VA能減輕AA對細(xì)胞增殖率的抑制作用。

TG是乳脂肪的主要組成形式，由95%的脂肪酸及1%的磷酸與甘油結(jié)合而成，于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上融合成脂滴分泌到乳汁中[14]，因此BMECs中TG含量可以作為細(xì)胞分泌乳脂肪能力的評定指標(biāo)，這與奶牛的乳脂產(chǎn)量、牛奶的乳脂率息息相關(guān)。來自血液中的游離脂肪酸或在BMECs內(nèi)重新合成的脂肪酸在甘油分子的羥基上發(fā)生酯化。研究發(fā)現(xiàn)，AA的濃度關(guān)系著細(xì)胞乳脂合成的能力，它是脂肪酸從頭合成的重要前體物，添加0.016 mol·L-1的AA對BMECs內(nèi)TG的分泌有顯著促進(jìn)作用[15]；齊利枝等[7]及生冉[9]也得到相似的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AA對BMECs內(nèi)TG的積累以及脂滴的形成的具有促進(jìn)作用，且這種作用隨AA濃度的增加呈線性或二次曲線增強(qiáng)。研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)AA添加使BMECs內(nèi)TG含量顯著增加，這進(jìn)一步驗證了其對乳脂合成的促進(jìn)作用，mTOR/eIF4E信號通路在AA對乳脂合成的調(diào)節(jié)中起著不可或缺的作用[16]。本試驗中，VA添加的抑制了TG的合成，且同時添加VA與AA也顯著影響TG含量，這表明VA對TG的抑制作用與AA之間存在一定相關(guān)性。與單獨添加VA組相比，VA與AA共同添加后TG含量在數(shù)值上明顯降低，且互作效應(yīng)使TG含量顯著低于單獨添加相同劑量的AA組，這表明VA和AA的互作效應(yīng)對AA促進(jìn)BMECs乳脂合成有抑制作用，VAAA1組TG數(shù)值高于VAAA2組，說明AA濃度的高低會影響VA和AA對乳脂合成的互作效應(yīng)，高濃度AA添加會導(dǎo)致VA抑制BMECs乳脂的合成；而單獨添加適宜劑量的VA會促進(jìn)乳脂的合成。

3.2 對乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)及酶活性的影響

乳脂合成中所需的脂肪酸大部分由乳腺上皮細(xì)胞從頭合成，因此從頭合成的原料乙酸和丁酸對泌乳期奶牛格外重要，有效的瘤胃發(fā)酵是供給揮發(fā)性脂肪酸充足的保證[17]。瘤胃發(fā)酵生成的揮發(fā)性脂肪酸包括AA、丙酸、丁酸等。瘤胃上皮細(xì)胞將丁酸轉(zhuǎn)化生成β-羥丁酸，AA與β-羥丁酸是脂肪酸從頭合成的主要前體物，當(dāng)ATP檸檬酸裂解酶缺乏時，由于不能直接利用葡萄糖導(dǎo)致脂肪酸無法合成[18]。二者進(jìn)入乳腺細(xì)胞后，在ACACA、FASN的共同作用下進(jìn)行脂肪酸的從頭合成，脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）與脂肪酸轉(zhuǎn)移蛋白的分化抗原簇36協(xié)同作用，將脂肪酸轉(zhuǎn)移至BMECs的TG結(jié)合位，使其進(jìn)一步延伸去飽和[19]。ACACA作為一種限制性酶，催化乙酰輔酶A向丙二酸單酰輔酶A的羧化，而FASN在飽和脂肪酸、中鏈脂肪酸的合成中起著重要作用，兩者都是脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶[20]。本試驗中，添加VA使BMECs內(nèi)FASN、ACACA的基因表達(dá)和酶活顯著降低，AA則對其無顯著影響，二者共同添加對FASN、ACACA的酶活有顯著影響，同時趨于顯著地影響了FASN的基因表達(dá)，表明VA與AA的互作影響B(tài)MECs內(nèi)TG含量可能與其調(diào)控脂肪酸的從頭合成相關(guān)。與對照組相比，分別添加0.006和0.01mol·L-1的AA，可以明顯促進(jìn)BMECs中ACACA和FASN的活性，這表明AA的補(bǔ)充增加了ACACA和FASN蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)了脂肪酸的從頭合成，增加了BMECs的TG含量。前人的研究得出了相似的結(jié)果，AA的添加可以促進(jìn)BMECs內(nèi)ACACA和FASN的基因表達(dá)[6,8]。本研究中雖未發(fā)現(xiàn)ACACA和FASN的基因表達(dá)顯著改變，但在數(shù)值上有增加的趨勢。然而，VAAA1組和VAAA2組的ACACA、FASN酶活性相比AA處理1組和AA處理2組顯著降低，這與細(xì)胞內(nèi)TG含量的變化規(guī)律一致，表明AA與VA共同作用抑制BMECs內(nèi)ACACA和FASN的酶活性，可能導(dǎo)致脂肪酸從頭合成減少，降低TG含量。SCD作為產(chǎn)生單不飽和脂肪酸的限速酶在BMECs內(nèi)的TG合成起關(guān)鍵作用，其催化產(chǎn)物同時可作為底物產(chǎn)生多不飽和脂肪酸[21]。分娩后，奶牛乳腺中的SCD基因表達(dá)和酶活性會立刻上調(diào)，泌乳期相比分娩前可上調(diào)40多倍，同時SCD的高表達(dá)與ACACA、FASN有關(guān)，因此SCD與脂肪酸的從頭合成有直接關(guān)系。JACOBS等[22]發(fā)現(xiàn)0.005 mol·L-1乙酸鈉能顯著上調(diào)SCD1的基因表達(dá)，生冉[9]的研究表明這種調(diào)控作用隨AA濃度增加而呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的趨勢。本試驗中VA的添加可以上調(diào)SCD的基因表達(dá)，但這種調(diào)控作用在AA添加后未被發(fā)現(xiàn)。同時VA與AA的互作效應(yīng)也顯著影響基因SCD的相對表達(dá)，與VA處理組、VAAA1組相比，VAAA2組SCD表達(dá)顯著提高，表明VA和AA可能協(xié)同促進(jìn)SCD基因表達(dá)，其具體機(jī)制仍需深入探討研究；VA和AA相互作用對SCD活性的影響較大，其變化與其基因表達(dá)一致。LPL和FABP3對BMEC中長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運非常重要，LPL決定脂肪細(xì)胞的大小和TG積累的程度，F(xiàn)ABP3在泌乳期的基因表達(dá)最高[2]。前人研究發(fā)現(xiàn)，AA的添加促進(jìn)了BMECs內(nèi)FABP3的基因表達(dá)[7,9]，而不同濃度AA對LPL的基因表達(dá)無顯著影響[9]。本試驗得出相似結(jié)果，高濃度AA對FABP3基因表達(dá)有顯著促進(jìn)作用，AA處理2組和VAAA2組的FABP3基因表達(dá)均顯著上調(diào)，但VA與AA互作對其并無顯著影響，表明添加VA并沒有明顯影響AA促進(jìn)的作用；LPL基因表達(dá)和酶活性也受到VA和AA之間相互作用的明顯影響，兩者的最佳組合是沒有添加AA的組。然而，這一效果仍然沒有明確的規(guī)律。PPARG和SREBP1是脂肪酸合成的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，有多個下游靶基因調(diào)節(jié)脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運、合成和去飽和，PPARG可以調(diào)節(jié)SCD、LPL、SREBP1的表達(dá)，SREBP1可以調(diào)節(jié)ACACA、FASN、FABP的表達(dá)[23-24]。研究報道表明AA能上調(diào)BMECs中和的表達(dá)，這與AA調(diào)節(jié)和等基因表達(dá)的證據(jù)相一致[16]。本試驗中VA使表達(dá)降低，AA以及VA與AA的互作也均對表達(dá)產(chǎn)生顯著影響；VA濃度不變，0.006 mol·L-1AA組顯著低于0、0.01 mol·L-1AA組，AA濃度為0.01 mol·L-1時，未添加VA組顯著高于添加組，表明VA不僅自身下調(diào)表達(dá)，而且會與AA協(xié)同作用下調(diào)的表達(dá)。雖然AA及其與VA的互作效應(yīng)對SREBP1基因表達(dá)沒有產(chǎn)生顯著影響，但單獨添加AA時SREBP1基因表達(dá)量在數(shù)值上要高于同濃度添加VA組，這和BMECs內(nèi)ACACA、FASN基因表達(dá)在VA和AA的互作效應(yīng)下降低的結(jié)果類似，表明VA和AA協(xié)同可能是通過抑制PPARG、SREBP1基因表達(dá)來下調(diào)脂肪酸從頭合成基因，進(jìn)一步降低細(xì)胞內(nèi)的TG含量。

3.3 對乳蛋白合成相關(guān)基因及酶活性的影響

乳蛋白是衡量牛奶質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，酪蛋白含量在牛奶蛋白中的占比高達(dá)80%，其中CSN1占總酪蛋白的45%—55%，且主要為CSN1S1，CSN1S2占少部分，CSN2和CSN3分別占總酪蛋白的25%—35%和8%—15%[25]；免疫球蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白以及具有特定生物活性的乳過氧化物酶和乳鐵蛋白等都是乳清蛋白的主要成分[26]。已有研究表明AA可以抑制S1的合成，但促進(jìn)和的合成[27]。塔娜等[6]的研究中0.012 mol·L-1乙酸鈉能顯著提高BMECs內(nèi)和的基因表達(dá)，并且降低了S1表達(dá)，但0.006 mol·L-1AA促進(jìn)S1表達(dá)。在本試驗中，VA添加的主效應(yīng)顯著增加了S1和的表達(dá)，降低了的表達(dá)；AA添加顯著增加了BMECs中的表達(dá)，降低了的表達(dá)；VA和AA相互作用顯著影響了的表達(dá)；VA和AA互作明顯影響了的表達(dá)，在沒有VA的情況下隨AA濃度的增加而減少，但在有VA的情況下隨AA濃度的增加而增加，說明VA只在有AA的情況下削弱了CSN2基因表達(dá)的下調(diào)作用。這可能是由于VA對的下調(diào)作用。

乳腺組織中乳蛋白的合成受到不同信號通路的調(diào)控，目前主要集中在JAK-STAT和mTOR兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，兩者與細(xì)胞凋亡、增殖等多種生理過程有關(guān)。JAK-STAT主要在催乳素等激素作用下在基因轉(zhuǎn)錄水平起調(diào)控作用[28]，在催乳素-乳蛋白信號途徑起重要作用，是乳腺中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，上游信號JAK2可對其活化，激活后入核實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控。已有研究顯示，的過表達(dá)能夠促進(jìn)BMECs內(nèi)、、和β-酪蛋白的mRNA水平的表達(dá)量[29]。mTOR通路主要在蛋白質(zhì)翻譯水平來發(fā)揮生乳和維乳作用[30]。BMECs中mTOR通路的上游信號分子主要由蛋白激酶B、磷脂酰肌醇3-激酶組成，通過磷酸化其下游的eIF4E、4EBP1和S6K1進(jìn)而調(diào)控蛋白質(zhì)的合成[31-32]。mTOR受到抑制時，PPARG蛋白表達(dá)水平下降，未磷酸化的4EBP1會與eIF4E結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)而抑制蛋白的翻譯起始及合成[33]。本試驗結(jié)果顯示，VA可顯著提高4EBP1基因的表達(dá)，補(bǔ)充AA可使S6K1、4EBP1基因表達(dá)顯著提高，且0.01 mol·L-1AA有顯著促進(jìn)作用，0.006 mol·L-1無顯著影響，說明S6K1、4EBP1的基因表達(dá)與AA濃度有關(guān)，高濃度AA更能促進(jìn)其表達(dá)；VA與AA互作效應(yīng)對、的表達(dá)無顯著影響，說明VA的添加沒有改變AA的這種促進(jìn)作用。此外，結(jié)果顯示補(bǔ)充AA顯著增加S6K1活性，但補(bǔ)充VA則相反，且二者交互作用對其活性無顯著影響，這與基因表達(dá)的結(jié)果一致，表明VA不會影響AA的作用結(jié)果。本試驗還發(fā)現(xiàn)0.006 mol·L-1AA能促進(jìn)表達(dá)，而0.01 mol·L-1AA可能會產(chǎn)生抑制作用，表明高濃度AA抑制的表達(dá)，但本試驗沒有涉及AA或VA對下游基因的影響，仍需進(jìn)一步探究。生冉[9]的結(jié)果還表明不同濃度AA均會使BMECs內(nèi)eIF4E、4EBP1、S6K1基因表達(dá)量升高，本試驗中添加AA也顯著影響表達(dá)，但0.01 mol·L-1AA組顯著低于0.006 mol·L-1AA組，在數(shù)值上也低于0 mol·L-1AA組，提示高濃度AA可能抑制的表達(dá)。目前，尚未有太多關(guān)于AA或者VA對酪蛋白合成調(diào)控以及對乳蛋白合成影響的研究，體內(nèi)灌注乙酸鈉對乳蛋白影響的試驗結(jié)果也不盡一致。綜合本研究及前人研究結(jié)果，AA可能通過調(diào)控mTOR信號通路影響B(tài)MECs中酪蛋白的基因表達(dá)，但不同AA濃度對信號通路中不同基因的影響機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。結(jié)果也表明，VA與AA協(xié)同對mTOR基因表達(dá)有一定影響，相比主效應(yīng)VA或主效應(yīng)AA時一定程度上對mTOR的表達(dá)有促進(jìn)作用，這可能與CSN2基因表達(dá)的互作效應(yīng)有關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究。

本試驗通過VA和AA的互作效應(yīng)，初步探討了BMECs乳成分合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，但由于其復(fù)雜的合成調(diào)控因素，很多問題仍需深入研究。在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用時，VA及其與AA的交互作用可能密切關(guān)系著核視黃酸受體及細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白（cRABP），VA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)的同時是否會對cRABP濃度產(chǎn)生影響，AA的受體調(diào)節(jié)作用是否受VA與AA的互作效應(yīng)影響，這些仍需進(jìn)一步探討研究。

4 結(jié)論

維生素A（VA）和乙酸（AA）在調(diào)控乳脂和乳蛋白合成方面存在互作效應(yīng)：AA能提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量、乙酰輔酶A羧化酶活性、脂肪酸合成酶活性及的表達(dá)，VA同步添加則會抑制上述指標(biāo)的合成或表達(dá)；AA顯著提高了S6K1酶活性，并上調(diào)了基因及的表達(dá)；同時，VA與AA同步添加會減弱單獨添加時對基因與表達(dá)的下調(diào)作用。綜合以上結(jié)果，單獨添加0.01 mol·L-1的AA對促進(jìn)乳脂合成較好，單獨添加0.006 mol·L-1的AA則更利于乳蛋白的合成。

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Effect of Interaction Between Vitamin A and Acetic Acid on the Expression of Genes Related to Milk Composition Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

GUO YongMei, LIU Yang, WU Rui, YAN SuMei, ZHAO YanLi, GUO XiaoYu

College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University/Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science at Universities of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010018

【Objective】Our previous research found that vitamin A (VA) has a significant effect on promoting the expression of genes related to milk fat and milk protein synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs). Based on this, this experiment was conducted by adding acetic acid (AA) to explore whether there is an interaction between VA and AA in the expression of genes related to milk composition synthesis, then gaining a more systematic understanding of the regulatory mechanism of VA involvement in milk fat and protein synthesis, this study would provide scientific basis for the rational addition of VA to feed for dairy cows and the improvement of milk quality.【Method】In this experiment, cells were cultured using digestive method of collagenase. Two factor completely randomized trial design was used in this study. The third generation BMECs was randomly divided into 6 treatment groups, with 6 replicates in each group. After starvation treatment of serum-free medium for 24 hours, medium with VA and AA at different concentrations was added, respectively. The six treatment groups were sequentially named as control group (0 mg·mL-1VA+0 mol·L-1AA), AA treatment group 1 (0 mg·mL-1VA+0.006 mol·L-1AA), AA treatment group 2(0 mg·mL-1VA+0.01 mol·L-1AA), VA treatment group(0.001 mg·mL-1VA+0 mol·L-1AA), VAAA1 group(0.001 mg·mL-1VA+0.006 mol·L-1AA), and VAAA2 group(0.001 mg·mL-1VA+0.01 mol·L-1AA). After 24 hours of continuous culture, the cells and culture medium were collected as required, and the cell proliferation rate was measured using MTT method; the content of triglycerides and the activities of key enzymes in milk fat and protein synthesis were measured using kits. The relative expression of genes related to milk fat and milk protein synthesis was measured and calculated by real-time quantitative PCR. 【Result】 The results showed that adding VA significantly increased the cell proliferation rate (＜0.001), but no significant effect on the cell proliferation rate was found followed by addition of AA or VA and AA (＞0.05). There was an interaction effect between VA and AA on milk fat synthesis. AA increased the triglyceride (TG) content in BMECs (=0.01), but the addition of VA inhibited TG synthesis in the meantime (=0.01). AA up-regulated the activities of fatty acid synthase () and acetyl CoA carboxylase () as well as peroxisome proliferator-activated receptor γ () gene expression in BMECs (＜0.05;＜0.05;＜0.001), while significant inhibitory effect of VA was observed (＜0.001;=0.01;＜0.01). AA significantly increased the content of mammalian rapamycin target protein (mTOR) (=0.05), ribosome S6 protein kinase (S6K1) enzyme activity (＜0.001), and the gene expression of=0.02). VA and AA had an interaction effect on the gene expression ofand, because the simultaneous addition of VA and AA attenuated the down-regulatory effect onandgene expression after addition of VA or AA alone. 【Conclusion】 To sum up, AA treatment group 2 had a better promoting effect on milk fat synthesis, while VAAA2 group had a weaker effect; AA treatment group 1 had a better promoting effect on milk protein synthesis, while VAAA1 group had a weaker effect. Therefore, 0.01 mol·L-1of AA alone is better for promoting milk fat synthesis, while 0.006 mol·L-1of AA is more conducive to milk protein synthesis.

vitamin A; acetic acid; interaction; bovine mammary epithelial cells; milk composition

2023-01-31；

2023-05-25

國家自然科學(xué)基金（31160466）、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研啟動項目（NDYB2020-4）、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（BR220142）、內(nèi)蒙古自治區(qū)本級事業(yè)單位引進(jìn)優(yōu)秀人才科研基金

郭詠梅，E-mail：ymguo2015@163.com。通信作者閆素梅，E-mail：yansmimau@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）