開花期番茄circRNA的測序分析及功能分析

殷子賀，楊成成，趙鈺慧，趙麗，呂秀榮，楊振超，武永軍

開花期番茄circRNA的測序分析及功能分析

殷子賀，楊成成，趙鈺慧，趙麗，呂秀榮，楊振超，武永軍

西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100

【背景】開花期作為植物生長發(fā)育過程中至關(guān)重要的時(shí)期之一，直接影響植物果實(shí)成熟和種子發(fā)育。circRNA是一類普遍存在于真核細(xì)胞的共價(jià)閉環(huán)RNA分子，在番茄的發(fā)育過程和應(yīng)激反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用。但目前番茄的circRNA研究主要集中在果實(shí)和葉片中，缺少對(duì)番茄花期circRNA較為系統(tǒng)的研究?！灸康摹胯b定和分析開花期番茄circRNA，對(duì)番茄中miRNA、circRNA的功能研究有重要意義，也為番茄生長、發(fā)育和脅迫響應(yīng)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā窟x擇開花期番茄植株的花、根、葉3個(gè)組織樣品進(jìn)行circRNA測序，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，鑒定circRNA并對(duì)其基本特性進(jìn)行分析；篩選組織特異性的circRNA檢測成環(huán)能力，并對(duì)鑒定的circRNA宿主基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測分析circRNA的作用方式和作用位點(diǎn)，構(gòu)建番茄響應(yīng)生長發(fā)育的潛在circRNA-miRNA-mRNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?！窘Y(jié)果】利用高通量測序方法，共獲得532個(gè)circRNA，其中83%為外顯子類型，且circRNA在花期番茄各染色體中的分布不均勻，其中1號(hào)染色體產(chǎn)生的circRNA最多，5號(hào)染色體最少。對(duì)開花期番茄花、葉、根3個(gè)組織的circRNA差異表達(dá)分析表明，花與葉中差異表達(dá)的circRNA有79個(gè)、花與根中差異表達(dá)的circRNA 133個(gè)、葉與根中差異表達(dá)的circRNA 132個(gè)。其中花、葉、根3個(gè)組織中均有顯著差異表達(dá)的circRNA 14個(gè)。從14個(gè)差異表達(dá)circRNA中隨機(jī)選擇8個(gè)circRNA進(jìn)行成環(huán)能力檢測，結(jié)果表明這8個(gè)circRNA均具有成環(huán)能力。GO分析和KEGG分析表明開花期番茄中的circRNA主要與核酸、蛋白及其他小分子物質(zhì)結(jié)合以及各類生物大分子的合成和代謝相關(guān)。最后構(gòu)建了14個(gè)circRNA、10個(gè)miRNA和136個(gè)mRNA組成的番茄circRNA-miRNA-mRNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?！窘Y(jié)論】開花期番茄circRNA具有明顯的組織特異性，共鑒定到342個(gè)組織特異性的circRNA，其中均顯著特異性表達(dá)的14個(gè)，成功鑒定成環(huán)8個(gè)，構(gòu)建了開花期番茄特異性的circRNA-miRNA-mRNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)開花期circRNA的研究奠定了基礎(chǔ)。

circRNA；番茄；開花期；miRNA；ceRNA

0 引言

【研究意義】番茄（）屬于茄科（），由南美洲馴化而來，在世界各地廣泛種植，是人類飲食中重要的營養(yǎng)來源，也是研究果實(shí)的典型模式植物。開花期作為番茄生長發(fā)育最關(guān)鍵的階段之一，開花的時(shí)期、數(shù)目、質(zhì)量直接決定著番茄的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益[1]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）作為非編碼RNA的一種，廣泛參與植物的生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。因此，研究開花期番茄的circRNA，對(duì)探索開花期番茄的分子機(jī)制有重要的理論意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】circRNA是一種共價(jià)閉合的環(huán)狀RNA分子，相比普通RNA，circRNA沒有5′末端和3′ ploy（A）尾巴，它以共價(jià)鍵連接首尾，從而形成封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)使它不易被核酸外切酶R （RNase R）降解[2]。一般來說，根據(jù)circRNA與其宿主基因的位置關(guān)系，可將其分為外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA和基因間circRNA三種類型[3]。前人研究表明，特定的植物circRNA在一定條件下，可以通過競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)并對(duì)植物的生長發(fā)育（尤其是花發(fā)育）起至關(guān)重要的作用[4-6]。近些年來，一些關(guān)于番茄circRNA的報(bào)道也逐漸被關(guān)注。Zuo等[7]在番茄果實(shí)中預(yù)測到一些circRNA參與了冷脅迫響應(yīng)過程。Tan等[8]在番茄果實(shí)中鑒定了一些來源于果實(shí)色素生物合成基因的circRNA，并表明其中有些circRNA的豐度受到果實(shí)成熟的調(diào)控。Wang等[9]證明了circRNA在番茄果實(shí)乙烯途徑中的復(fù)雜調(diào)控作用，并表明番茄果實(shí)中乙烯途徑可能受各種circRNA調(diào)控。此外，非編碼RNA，如miRNA和長鏈非編碼RNA（lncRNA）可能通過調(diào)控花組織內(nèi)膜的形成，與多種分子結(jié)合，影響代謝途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而在開花番茄植株的生長發(fā)育和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[10]。Zuo等[11]研究了番茄果實(shí)成熟過程中可能與潛在靶向的乙烯或類胡蘿卜素途徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵酶通過差異表達(dá)的circRNA。Yang等[12]揭示了番茄葉片中多個(gè)被分離出來的circRNA在低溫脅迫下受到不同的調(diào)控，并繪制了低溫脅迫下的circRNA-miRNA-mRNA潛在網(wǎng)絡(luò)。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)番茄circRNA的研究大多是在果實(shí)和葉片中進(jìn)行，研究方向也主要是脅迫響應(yīng)和果實(shí)發(fā)育方面居多，對(duì)開花期番茄circRNA的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從開花期番茄的ssRNA-seq（鏈特異性RNA測序）文庫中鑒定和分析circRNA，獲得高質(zhì)量的circRNA序列信息，又從中選取部分circRNA進(jìn)行成環(huán)驗(yàn)證；并對(duì)其中少數(shù)靶標(biāo)miRNA進(jìn)行推測，建立開花期番茄的circRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長條件

本研究使用的番茄品種為Ailsa Craig。番茄植株的生長環(huán)境為光照/黑暗16 h/8 h，光照強(qiáng)度250 μmol?m-2?s-1，晝/夜溫度26 ℃/18 ℃，濕度80%。番茄第一次開花時(shí)，收集植株頂端的第3片葉、去除萼片的花和根作為試驗(yàn)材料（每個(gè)樣品包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。取樣后，立即用液氮速凍，并置于-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2 circRNA文庫的構(gòu)建及測序

使用TRIzol（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）提取花期番茄植物各組織（葉、花和根）的總RNA，使用Ribo-Zero Gold kit（Epicentre, San Diego, CA, USA）分別處理開花期番茄植株的花、葉和根3個(gè)組織總RNA樣品。總RNA樣品經(jīng)DNase I（NEB，MA，USA）處理后，使用NEBNext?Ultra? Directional RNA（NEB，MA，USA）進(jìn)行rRNA消除。對(duì)得到的RNA進(jìn)行RNase R（Epicentre, San Diego, CA, USA）處理去除線性RNA分子，參照Yang等[13]的方法構(gòu)建circRNA-seq文庫，并按照供應(yīng)商推薦的方案在Illumina Hiseq 4000（LC Bio，China）上進(jìn)行了配對(duì)末端測序。

1.3 circRNA鑒定

使用StringTie對(duì)基因組比對(duì)后的Reads進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)。使用cuffcompare對(duì)重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行相互比較，并刪除冗余的轉(zhuǎn)錄本。基于Prensner等[14]的方法，對(duì)重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行過濾和篩選。并將重構(gòu)后的轉(zhuǎn)錄本分別使用軟件CIRI和find_circ進(jìn)行circRNA檢測，將CIRI和find_circ鑒定的所有circRNA進(jìn)行交集分析，能夠在CIRI和find_circ兩個(gè)軟件中同時(shí)預(yù)測到的circRNA作為circRNA鑒定的最終結(jié)果。

1.4 circRNA 表達(dá)水平及差異表達(dá)分析方法

circRNA表達(dá)量采用RPM（back-spliced reads per million mapped reads）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。參照Yang等[13]的方法，circRNA的差異表達(dá)分析采用差異倍數(shù)（Fold Change）和value進(jìn)行差異circRNA 篩選，篩選條件為：log2Fold Change的絕對(duì)值≥1且value≤0.05。

1.5 circRNA的驗(yàn)證和qRT-PCR鑒定

從所有已鑒定的circRNA中，基于堿基位點(diǎn)數(shù)目和高度差異表達(dá)選擇8個(gè)circRNA用于試驗(yàn)驗(yàn)證。使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法提取基因組DNA作為circRNA驗(yàn)證過程中不同引物的陰性對(duì)照[15]。將用于RNA-seq的總RNA樣品用DNase I去除DNA污染后，根據(jù)Epicenter Ribo-Zero Gold Kit程序去除rRNA，并且通過在37 ℃下與3 μg RNase R孵育15 min去除線性RNA。使用Primer 5設(shè)計(jì)每種circRNA的兩套引物：發(fā)散引物，預(yù)期僅可擴(kuò)增跨反向剪接連接處的circRNA，以及用于擴(kuò)增線性mRNA形式的收斂引物（引物信息見表1）。

通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega, Madison, WI,將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。使用SYBR Green PCR Master Mix（Promega, Madison, WI,）和Bio-Rad CFX manager 3.1（Bio-Rad, Hercules, CA USA）程序進(jìn)行qRT-PCR。內(nèi)參基因使用，通過2-ΔΔCT方法進(jìn)行定量分析數(shù)據(jù)。所有結(jié)果使用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的SD值（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。RT-qPCR引物使用發(fā)散引物R和F，引物信息見表1。

1.6 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的建立

基于針對(duì)miRBase 21.0版的比對(duì)，采用Targetscans（v7.0）和miRanda分析預(yù)測開花期番茄circRNA的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，該方法利用了34種植物物種中的miRNA（http://www.mirbase.org/）。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測circRNA與miRNA的互作可能性及對(duì)應(yīng)的互作位點(diǎn)，使用PlantCircNet（http://bis.zju. edu.cn/plantcircnet/）可視化circRNA-miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。所有檢測到的circRNA和miRNA均用于相互作用分析。

2 結(jié)果

2.1 番茄circRNA的鑒定

從番茄開花植株的葉片、花和根中共獲得731 707 984個(gè)原始讀數(shù)，在去除銜接子和引物序列以及短的低質(zhì)量序列后，其中99.98%是清潔讀數(shù)。結(jié)果表明，RNA-seq讀數(shù)和番茄參考基因組均具有較高的質(zhì)量。發(fā)現(xiàn)平均82.76%的讀取可以映射到唯一的基因組位置（表2）。

在比較基因組讀數(shù)的基礎(chǔ)上，利用StringTie對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行重組和組裝。經(jīng)線性RNA去除后，使用CIRI和find_circ兩款circRNA預(yù)測軟件分別鑒定得到 1 137和2 144個(gè)circRNA，通過對(duì)兩款軟件鑒定到的circRNA進(jìn)行交集匯總，總共得到2 749個(gè)circRNA，選取兩款軟件共同鑒定到的532個(gè)circRNA（附表）用于后續(xù)分析（圖1-A）。這些circRNA有較強(qiáng)的組織特異性，在所有的532個(gè)circRNA中只有74個(gè)（14%）circRNA可以在番茄花、葉、根3個(gè)組織中同時(shí)鑒定得到，其中根組織特異性circRNA在番茄花期中鑒定的最多，總共為219個(gè)，占所有番茄circRNA總數(shù)的41.2%（圖1-B）。

表1 引物序列

F：發(fā)散引物；S：收斂引物 F: Divergent primer; S: Convergent primer

表2 circRNA測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

F：花；L：葉；R：根。下同 F: Flower; L: Leaf; R: Root. The same as below

2.2 番茄circRNA的分類及特征

對(duì)上述鑒定所得的532個(gè)circRNA類型分析顯示，開花期番茄circRNA中，占比最高的為外顯子circRNA（83%），其次為基因間circRNA（16%），內(nèi)含子circRNA在花期番茄circRNA中鑒定最少，僅占1%（圖2-A）。circRNA在花期番茄各染色體中的分布不均勻（圖2-B），但相較于其他染色體，1號(hào)染色體對(duì)circRNA的產(chǎn)生明顯具有更大的貢獻(xiàn)，而5號(hào)染色體形成circRNA的能力明顯要低于其他染色體，且本研究發(fā)現(xiàn)來源于線粒體的circRNA中基因間circRNA占有較大比例。

A：利用CIRI和find_circ鑒定的番茄circRNA；B：番茄各組織總circRNA維恩圖分析

A：鑒定的番茄 circRNA分類圖；B：番茄各染色體circRNA數(shù)量及類型比例分析；C：番茄中不同長度circRNA的分布及類型；D：番茄花、葉、根中不同表達(dá)量（RPM）的circRNA數(shù)量

此外，隨著circRNA長度的增加，circRNA的數(shù)目不斷減少（圖2-C）。值得關(guān)注的是，超過80.6%的番茄circRNA長度較短（≤3 600 bp），外顯子circRNA一般是較短的circRNA（＜3 600 bp）。而在較長的circRNA（＞3 600 bp）中，基因間circRNA占有更大的比例，尤其是在9 000 bp以上的circRNA中，基因間circRNA所占比例超過了77.5%，約為基因間circRNA整體占比的5倍。根據(jù)circRNA RPM表達(dá)量值，分別統(tǒng)計(jì)了RPM表達(dá)量≥0.0、0.05、0.15、0.25、0.5的circRNA數(shù)目（圖2-D）。結(jié)果顯示，隨著circRNA表達(dá)量的升高，circRNA的數(shù)目逐漸減少。但是，雖然花組織和葉組織circRNA的數(shù)目隨表達(dá)水平的變化趨勢(shì)類似，但是相比于花組織和葉組織，根組織中RPM＜0.15時(shí)，circRNA的數(shù)目明顯更多；在RPM＞0.15后，根組織的circRNA數(shù)目才與葉組織和花組織中的數(shù)目類似，呈現(xiàn)出基本穩(wěn)定的減少趨勢(shì)（圖2-D）。

2.3 番茄circRNA差異表達(dá)分析

由于表達(dá)值分析中開花期番茄花、葉、根3個(gè)組織中circRNA顯示出一定的差異性，因此，本研究對(duì)上述開花期番茄花、葉、根，3個(gè)組織的circRNA進(jìn)一步進(jìn)行差異表達(dá)分析。聚類圖（圖3-A）顯示了532個(gè)番茄circRNA在花、葉、根3個(gè)組織中的總體表達(dá)水平分布。根據(jù)聚類結(jié)果，將番茄3個(gè)組織的circRNA進(jìn)行差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)，總共得到花與葉中差異表達(dá)的circRNA 79個(gè)，花與根中差異表達(dá)的circRNA 133個(gè)，葉與根中差異表達(dá)的circRNA 132個(gè)。分別對(duì)這些circRNA進(jìn)行表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，與根組織相比，葉與花中的circRNA主要呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)（圖3-B）。番茄circRNA在花、葉、根3個(gè)組織中的具體表達(dá)如火山圖所示（圖3-C—E）。

對(duì)上述鑒定的circRNA進(jìn)一步進(jìn)行交集分析（圖3-F），共得到花期番茄花、葉、根3個(gè)組織均有顯著差異表達(dá)的circRNA 14個(gè)，對(duì)這14個(gè)顯著差異表達(dá)的circRNA分層聚類的結(jié)果（圖3-G）顯示，這14種新型circRNA在花、葉、根3個(gè)組織中表達(dá)的重復(fù)性較高，同時(shí)聚類樹圖將這14種circRNA分為3大類型。其中，circ_301、circ_714具有類似的表達(dá)模式，均在葉中的表達(dá)量較小，而在花與根中表達(dá)水平較高；circ_113、circ_239、circ_250、circ_116、circ_7、circ_433在葉中表達(dá)水平更高；circ_228、circ_504在根中有高表達(dá)；circ_37、circ_325、circ_609、circ_1118在花中表達(dá)量較高。研究結(jié)果表明，circRNA在花期番茄的葉、花和根中有組織特異性表達(dá)。

2.4 番茄circRNA的成環(huán)能力及差異表達(dá)驗(yàn)證

為了確認(rèn)對(duì)番茄circRNA的鑒定，基于BS位點(diǎn)數(shù)目和高度差異表達(dá)篩選了8個(gè)circRNA用于試驗(yàn)驗(yàn)證。擴(kuò)增結(jié)果顯示，所有候選circRNA均可被收斂引物在cDNA樣品和基因組DNA樣品中擴(kuò)增，而利用發(fā)散引物時(shí)只可以在cDNA樣品中順利擴(kuò)增，不能在基因組DNA樣品中擴(kuò)增得到（圖4-A、B），證明8個(gè)候選circRNA可以在番茄體內(nèi)成環(huán)。

進(jìn)一步對(duì)這8個(gè)候選circRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示circRNA在番茄不同組織中表現(xiàn)不同的調(diào)控模式（圖4-C）。circRNA19、circRNA240在番茄花組織中具有高水平表達(dá)，而circRNA105、circRNA473在番茄葉組織中具有極顯著的高水平表達(dá)，但在番茄根組織中表達(dá)量較低；與circRNA105和circRNA473正好相反，circRNA 136在番茄根組織中具有高水平表達(dá)，但在番茄葉組織中表達(dá)量較低。此外，circRNA97與circRNA228在花、根、葉組織中并沒有顯著的表達(dá)差異。

2.5 GO/KEGG通路分析差異表達(dá)的circRNA-宿主基因

由于circRNA與其親本蛋白編碼基因具有相似或相反的表達(dá)模式，為了探索番茄差異表達(dá)circRNA的推定功能，對(duì)circRNA-宿主基因進(jìn)行GO富集和KEGG途徑分析。GO富集將532個(gè)circRNA（342個(gè)顯著性差異的基因數(shù)目）的宿主基因分為89個(gè)功能項(xiàng)，包括3個(gè)主要的GO分類類別（“生物過程”“細(xì)胞組分”和“分子功能”），分別包含28、23和38個(gè)功能項(xiàng)。KEGG途徑分析將circRNA的宿主基因分為78個(gè)功能項(xiàng)。在細(xì)胞組分類別中，circRNA主要集中在細(xì)胞質(zhì)（GO：0005737）、胞質(zhì)部分（GO：0044444）和質(zhì)膜（GO：0005886）中。表明開花期番茄的circRNA很可能通過ceRNA方式與胞質(zhì)中的miRNA結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)；也可能是為后續(xù)果實(shí)發(fā)育積累一些物質(zhì)和能量條件。對(duì)于分子功能，富集的GO類別主要包括核苷酸結(jié)合（GO：0000166）、轉(zhuǎn)移酶活性（GO：0016740）、離子結(jié)合（GO：0043167）、碳水化及衍生物結(jié)合（GO：0097367）和激酶活性（GO：0016301），推測circRNA可能通過與核酸、蛋白以及其他小分子物質(zhì)的結(jié)合，來調(diào)節(jié)植物開花期的分子功能。對(duì)于生物過程，大多數(shù)circRNA-宿主基因主要參與生物調(diào)節(jié)（GO：0065007）、細(xì)胞代謝過程調(diào)節(jié)（GO：0031323）、基因表達(dá)調(diào)控（GO：0010468）、細(xì)胞分解代謝過程（GO：0044248）和RNA代謝過程調(diào)節(jié)（GO：0051252）。推測開花期番茄circRNA主要通過在胞質(zhì)中結(jié)合核酸、蛋白以及一些小分子物質(zhì)，來參與番茄開花過程中生物調(diào)控、細(xì)胞代謝調(diào)控以及基因表達(dá)調(diào)控等過程（圖5-A、表3）。

A：番茄circRNA在花、葉、根3個(gè)組織中的總體表達(dá)水平分布聚類圖；B：番茄花、葉、根3個(gè)組織的circRNA進(jìn)行差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)和上/下調(diào)水平統(tǒng)計(jì)；C、D和E分別顯示番茄葉片、花和根中DE circRNA基因（Degs）的火山圖，C是F-vs-L的DEGS_Volcano，D是L-vs-R的DEGS_Volcano，E是F-vs-R的DEGS_Volcano，紅色、綠色和灰色分別表示上調(diào)、下調(diào)和非DEG；F：番茄花、葉、根3個(gè)組織的差異表達(dá)的circRNA交集分析；G：對(duì)番茄花、葉、根3個(gè)組織均顯著差異表達(dá)的14個(gè)circRNA分層聚類的結(jié)果

A：circRNA成環(huán)驗(yàn)證原理；B：番茄circRNA的成環(huán)能力檢測；C：番茄差異表達(dá)circRNA的驗(yàn)證

為了更進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能，將532個(gè)（232個(gè)顯著性差異的基因數(shù)目）差異表達(dá)的circRNA宿主基因分配到78個(gè)通路。KEGG途徑分析顯示，circRNA的親本基因主要與某些生物大分子的合成、代謝有關(guān)，例如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，磷酸戊糖途徑，花生四烯酸代謝，脂肪酸的降解，精氨酸的生物合成等。且circRNA-宿主基因在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝通路顯著富集，戊糖磷酸途徑富集程度較高，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的代謝具有顯著性差異的基因數(shù)目最多，戊糖磷酸途徑和脂肪酸降解具有顯著性差異基因較多（圖5-B、表4）。表明開花期番茄circRNA的許多親本基因參與氨基酸、糖、脂肪酸等生物大分子的合成和代謝途徑，推測這些可能是為后期番茄果實(shí)發(fā)育和成熟積累的養(yǎng)分和能量。也進(jìn)一步證明，circRNA確實(shí)在開花期番茄中對(duì)番茄的生長發(fā)育起到積極的調(diào)控作用。

表3 差異表達(dá)circRNA的宿主基因GO注釋

僅列出基因數(shù)量最多的3種GO類別 Only the three GO term with the largest number of genes are listed

A：番茄中circRNA順式靶基因的基因本體富集分析（GO），垂直軸代表基因數(shù)目，水平軸代表富集項(xiàng)目列出了Biological process（BP）前10條，Cellular component（CC）前10條，Molecular function（MF）前16條；B：番茄中circRNA順式靶基因的KEGG途徑富集（前24條），垂直軸上的項(xiàng)目/路徑按照路徑的分類繪制（不同的顏色代表不同的類別），水平軸代表富集系數(shù)

A: The vertical axis represents the number of genes in tomato, the horizontal axis represents the enrichment items listing the top 10 biological process (BP), cellular component (CC) Top 10 bars, Top 16 of molecular function (MF); B: KEGG pathway enrichment of circRNA cis-target genes in tomato (top 24), items / paths on the vertical axis are drawn by the classification of paths (different colors represent different categories), the horizontal axis represents the enrichment coefficient

圖5 GO/KEGG通路分析差異表達(dá)的circRNA-hosting gene

Fig. 5 GO/KEGG pathway analysis Gene ontology enrichment analysis (GO) of circRNA cis-target genes in circRNA-hosting gene

2.6 開花期番茄circRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

為了揭示circRNA是否可以靶向miRNA并進(jìn)一步影響基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，研究circRNA、miRNA和mRNA之間的潛在相互作用。首先，采用Targetscans（v7.0）和miRanda軟件對(duì)開花期番茄的circRNA和miRNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)14個(gè)circRNA是兩個(gè)軟件共同預(yù)測到的circRNA（表5）。結(jié)果顯示有14個(gè)circRNA、10個(gè)miRNA和136個(gè)mRNA可能存在潛在的相互作用。其中多個(gè)circRNA（或miRNA）被預(yù)測與一個(gè)以上的miRNA（或circRNA）相互作用。其中circ_1403可以分別與sly-miR167b-3p、sly-miR9479-3p結(jié)合；而sly-miR5303可與circ_1420和circ_547進(jìn)行結(jié)合；sly-miR396b也可與circ_1112和circ_473進(jìn)行結(jié)合。sly-miR482d-5p也有circ_703和circ_733兩個(gè)circRNA富集。其中circRNA結(jié)合最多的miRNA是sly-miR9478-3p，它可以與circ_10、circ_176和circ_1079這3個(gè)circRNA結(jié)合。此外，還發(fā)現(xiàn)circ_473可直接作用于靶基因Solyc01g110700.2。隨后對(duì)這14個(gè)circRNA親本基因的功能注釋進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在生物過程中，主要與蛋白結(jié)合（GO：0005515）、ATP結(jié)合（GO：0005524）、輔酶結(jié)合（GO：0006306）以及在含磷酸酐中作用于酸酐的水解酶活性（GO：0016818）有關(guān)；在分子功能中，主要與谷氨酸代謝（GO：0006536）、胞外多糖的生物合成（GO：0045226）、DNA模板化轉(zhuǎn)錄調(diào)控（GO：0006355）有關(guān)；在細(xì)胞組分中，主要存在于細(xì)胞核（GO：0005634）和線粒體基質(zhì)（GO：0005759）中（表6）。

表4 差異表達(dá)circRNA的宿主基因KEGG注釋 Table 4 KEGG annotations of the host genes with differentially expressed circRNA KEGG通路名稱Name of the KEGG pathwayKEGG編號(hào)KEGG number宿主基因數(shù)量No. of host genes 丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的代謝Alanine, aspartate and glutamate metabolismsly0025030 精氨酸的生物合成Arginine biosynthesissly0022012 磷酸戊糖途徑Pentose phosphate pathwaysly0003010 脂肪酸的降解Fatty acid degradationsly00071 6 脂肪酸的生物合成Fatty acid biosynthesissly00061 5 脂肪酸代謝Fatty acid metabolismsly01212 3 花生四烯酸代謝Arachidonic acid metabolismsly00590 2 僅列出基因數(shù)量最多的7種KEGG通路Only the seven KEGG pathways with the largest number of genes are listed

表5 開花期番茄circRNA的miRNA靶基因及結(jié)合位點(diǎn) Table 5 miRNA target genes and binding sites of tomato circRNAs during flowering Trans IDmiR ID結(jié)合位點(diǎn)Binding sites靶向基因數(shù)量No. of target genes circ_1420/NC_015447.2: 2008132-2031198sly-miR530338 circ_547/NC_015449.2: 53700671-5371156238 circ_459/NC_015444.2: 21380917-21381396sly-miR9476-5p5 circ_1112/NC_015444.2: 64279962-64300043sly-miR396b30 circ_473/NC_015444.2: 64279949-64300043 circ_10/NC_015444.2: 208457-238616sly-miR9478-3p 4 circ_1079/NC_015444.2: 230400-238546 circ_176/NC_015444.2: 210427-211962 4 circ_437/NC_015438.2: 97435162-97451603sly-miR156e-3p 4 circ_704/NC_015438.2: 95819397-95828905sly-miR482d-5p 1 circ_733/NC_015438.2: 95819397-95825691 circ_739/NC_015438.2: 90765535-90770648sly-miR1916 6 circ_309/NC_015445.2: 2493994-2498871sly-miR1918 3 circ_1403/NC_015439.2: 47259582-47353207sly-miR9479-3p 1 sly-miR167b-3p 2

隨后用PlantCircNet（http://bis.zju.edu.cn/plantcircnet/）對(duì)circRNA、miRNA和mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析（圖6）。表5是開花期番茄circRNAs與靶向miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。其中circ_1420、circ_1112、circ_547和circ_473對(duì)應(yīng)miRNA富集的mRNA相對(duì)較多。而這些miRNA的主要功能也有其他研究者提出，例如sly-miR167b-3p、sly-miR156e-3p、sly- miR396b、sly-miR9479-3p這4個(gè)miRNA主要與非生物脅迫、干旱響應(yīng)和不同光質(zhì)處理有關(guān)[16-19]。sly-miR5303、sly-miR482d-5p、sly-miR9478-3p、sly-miR1916、sly- miR1918、sly-miR9476-5p這6個(gè)miRNA主要與免疫反應(yīng)、病害感染、植物激素有關(guān)[20-23]。推測可能是番茄開花期的生長發(fā)育環(huán)境刺激了這些circRNA- miRNA-mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致響應(yīng)開花的下游基因表達(dá)以及各種發(fā)育信號(hào)應(yīng)答反應(yīng)。

圖6 開花期番茄circRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的可視化圖 Fig. 6 Visualization plot of the circRNA-miRNA-mRNA co-expression network in flowering tomato

表6 circRNA-miRNA-mRNA模塊中靶基因GO注釋 Table 6 GO annotation of target genes in the circRNA-miRNA-mRNA module GO類別GO categoryGO名稱GO nameGO ID宿主基因數(shù)量No. of target genes 生物過程Biological process谷氨酸代謝Glutamate metabolic processGO: 0006536 4 胞外多糖的生物合成Extracellular polysaccharide biosynthetic processGO: 0045226 4 DNA模板化轉(zhuǎn)錄調(diào)控Regulation of transcription, DNA-templatedGO: 0006355 3 細(xì)胞組分Cellular component細(xì)胞核NucleusGO: 000563410 線粒體基質(zhì)Mitochondrial matrixGO: 0005759 2 分子功能Molecular functionATP結(jié)合ATP bindingGO: 000552412 蛋白結(jié)合Protein bindingGO: 000551512 輔酶結(jié)合Coenzyme bindingGO: 0050662 4

P-value＜0.05：均具有顯著性富集 P-value＜0.05: All were significant enriched

3 討論

3.1 開花期番茄中circRNA的鑒定與特征分析

研究表明，circRNA作為關(guān)鍵的調(diào)控分子，以ceRNA的形式參與植物的生長發(fā)育，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)起著重要的調(diào)控作用[5,24-25]。番茄作為果實(shí)研究的模式作物，一些與番茄果實(shí)成熟[8]和果實(shí)著色[9]有關(guān)的circRNA已被鑒定。但對(duì)番茄開花相關(guān)的研究還主要集中在編碼基因上，對(duì)circRNA研究相對(duì)較少。因此，揭示開花相關(guān)的circRNA對(duì)進(jìn)一步了解番茄的生長發(fā)育和生理代謝通路具有重要意義。本研究探索了circRNA在番茄開花過程中的表達(dá)和潛在功能，發(fā)現(xiàn)342個(gè)circRNA在花、葉和根中有顯著差異，根組織特異性circRNA在花期番茄中鑒定的最多，這與之前在大豆中的報(bào)道類似[26]。表明花期番茄的circRNA在不同組織中具有一定的特異性，其中根組織中剪接生成的circRNA最多。推測可能是由于花期番茄處于生長發(fā)育與生殖發(fā)育的交接期，需要從土壤中汲取更多的營養(yǎng)和水分所導(dǎo)致。

此外，在分析circRNA的特性時(shí)，發(fā)現(xiàn)番茄開花期過程中，circRNA來源于不同的基因組區(qū)域，但本研究鑒定的絕大多數(shù)屬于外顯子circRNA（83%），這與之前對(duì)擬南芥（85.1%）[27]、番茄（86.40%）[28]、白菜（70.49%）[29]和蕓苔（87.63%）[30]等許多植物物種的研究一致。此外，與番茄果實(shí)著色[8]和番茄乙烯途徑[9]中染色體上的circRNA分布一致，相較于其他染色體，1號(hào)染色體的circRNA密度最高，說明circRNA在花期番茄各染色體中的分布不均勻。對(duì)circRNA進(jìn)行分類后發(fā)現(xiàn)，隨著番茄circRNA長度的增加，circRNA的數(shù)目不斷減少，外顯子circRNA作為最常見的類型，在長度較短的circRNA（≤3 600 bp）中所占比例明顯較高，這與番茄果實(shí)得到的結(jié)果類似[8]。表明番茄在生長過程中更有可能形成較短的外顯子circRNA來調(diào)控番茄的發(fā)育。結(jié)合前人研究，在番茄生長發(fā)育的重要時(shí)期（開花期、著色期和完熟期）中，1號(hào)染色體剪接的circRNA均最豐富，且容易形成長度較短的circRNA參與開花、果實(shí)著色以及果實(shí)成熟過程。證明番茄在不同發(fā)育階段的circRNA具有高度保守性，且1號(hào)染色體剪接的circRNA可能與番茄的生長發(fā)育密切相關(guān)。

3.2 番茄響應(yīng)開花期相關(guān)的circRNA成環(huán)驗(yàn)證及生物學(xué)作用分析

前期研究表明，番茄的circRNA具有高度保守性以及組織特異性。因此，本研究參考Yang等[13]的方法，利用發(fā)散引物和收斂引物挑選了開花期差異表達(dá)的8個(gè)circRNA進(jìn)行成環(huán)驗(yàn)證，驗(yàn)證成功后對(duì)其在花、根、葉不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步證實(shí)了circRNA在番茄開花期中具有組織特異性。

由于circRNA的功能可能與其親本基因的功能有關(guān)，本研究使用GO和KEGG分析注釋了circRNA親本基因的生物學(xué)作用，以便于更好地理解circRNA在番茄開花期中的潛在功能。發(fā)現(xiàn)circRNA親本基因可能參與番茄花期發(fā)育相關(guān)的各種重要過程和功能，如核酸結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶、激酶活性、生物調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、細(xì)胞的分解代謝途徑等。KEGG分析表明，circRNA的親本基因涉及78條通路。另外，在所列出的前24條KEGG通路中發(fā)現(xiàn)，在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、磷酸戊糖途徑、花生四烯酸的代謝以及脂肪酸代謝合成中均有較高的富集。這些途徑可以為植物的生長發(fā)育提供大量的能量。此外，這些circRNA被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上大量表達(dá)。前人研究表明細(xì)胞核中的circRNA主要起調(diào)控親本基因的作用，而存在于細(xì)胞質(zhì)中的circRNA則起ceRNA的作用[3]。綜上，在開花期番茄中，circRNA可以在根、花、葉組織中特異性表達(dá)，預(yù)測參與多種核酸結(jié)合、基因表達(dá)調(diào)控和分解代謝途徑，以及各類生物大分子的合成與代謝。進(jìn)一步驗(yàn)證了花期番茄的circRNA以ceRNA的方式，調(diào)控番茄開花期的基因表達(dá)與調(diào)控，從而在番茄花期的生長發(fā)育和能量代謝過程中發(fā)揮重要作用。

3.3 番茄響應(yīng)開花期相關(guān)的潛在circRNA-miRNA- mRNA調(diào)控模塊

研究表明，circRNA可以作為ceRNA，通過與mRNA、miRNA或RNA結(jié)合蛋白（RBP）相互作用來直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[31-32]。然而對(duì)植物中circRNA-miRNA- mRNA網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測，與動(dòng)物和人類相比相對(duì)較少，目前只在擬南芥[24]、油菜[25]、番茄[12]和大豆[26]等少數(shù)作物中有研究。本研究基于ceRNA作用原理構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)在番茄開花期中有14個(gè)circRNA、10個(gè)miRNA和165個(gè)mRNA可以參與相關(guān)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。其中，大多數(shù)circRNA和miRNA是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系；也有多個(gè)circRNA靶向一個(gè)miRNA的情況出現(xiàn)；但是circRNA靶向多個(gè)miRNA的只有一個(gè)，即circ_1403可以分別靶向sly-miR167b-3p、sly-miR9479-3p。這表明circRNA可以與miRNA相互作用，通過miRNA響應(yīng)元件（microRNA response elements，MREs）與miRNA結(jié)合，從而緩解miRNA導(dǎo)致的基因沉默或降解，促使miRNA靶基因的基因表達(dá)量升高，參與調(diào)節(jié)番茄花期的生長發(fā)育。在預(yù)測網(wǎng)絡(luò)中還注意到一些已報(bào)道的miRNA，例如miR156、miR167、miR396、miR482、miR1918和sly-miR5303均參與了番茄生長發(fā)育、乙烯的生物合成以及果實(shí)成熟等過程[9,33-34]。miR1916、miR9476、miR9478和miR9479在番茄生長發(fā)育研究中較少有人報(bào)道，但在響應(yīng)非生物脅迫和病害感染免疫應(yīng)答中有作用[16,35-37]。番茄的花期生長發(fā)育并不是一個(gè)獨(dú)立的過程，不僅需要為幼苗期的番茄發(fā)育到生殖期提供生理生化保障，也需要為下一步的果實(shí)成熟積蓄能量。因此，推測花期番茄的circRNA-miRNA- mRNA可能在番茄生長發(fā)育、果實(shí)成熟以及脅迫應(yīng)答過程中起到協(xié)同調(diào)控的作用。

學(xué)生是學(xué)校構(gòu)成的基本主體，是學(xué)校管理的主要對(duì)象，不管是哪種規(guī)章制度，都需要學(xué)生和教師雙方的共同發(fā)展，按照科學(xué)的管理制度，提高學(xué)生的管理工作，調(diào)動(dòng)師生的積極性。管理制度的規(guī)劃是不可打破的，這樣會(huì)讓更多的學(xué)生懂得約束自己的行為，若想要真正地做到人性化和制度化的融合，這就需要管理人員轉(zhuǎn)變思想，在處理相關(guān)問題上堅(jiān)持以“學(xué)生為本”的管理理念，使學(xué)生的管理工作充分抓住重點(diǎn)，這都符合人性化和制度化管理的基本要求。

4 結(jié)論

通過在番茄花期生長發(fā)育過程中分析circRNA表達(dá)譜特征，確定了532個(gè)circRNA，其中342個(gè)circRNA具有組織特異性表達(dá)特征。此外，在染色體分布上，circRNA表現(xiàn)出高度的保守性。circRNA宿主基因的功能表征表明，circRNA主要與番茄花期生長發(fā)育中的生物大分子合成及代謝有關(guān)，如氨基酸合成代謝、磷酸戊糖途徑、花生四烯酸的代謝和脂肪酸代謝等過程。此外，發(fā)現(xiàn)14個(gè)circRNA含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，表明circRNA在基因表達(dá)中作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件發(fā)揮作用。本研究揭示了circRNA在番茄花期的生長發(fā)育過程中的潛在功能。這些結(jié)果極大地提高了對(duì)番茄開花植株發(fā)育過程中circRNA的理解，研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究circRNA在番茄開花期的功能奠定了基礎(chǔ)。

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Sequencing and Functional Analysis of Tomato circRNA During Flowering Stage

YIN ZiHe, YANG ChengCheng, ZHAO YuHui, ZHAO Li, Lü XiuRong, YANG ZhenChao, WU YongJun

College of Life Sciences/College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi

Abstract:【Background】As one of the most important periods in plant growth and development, the flowering period directly affects fruit ripening and seed development. circRNAs are a class of covalent closed-loop RNA molecules that are ubiquitous in eukaryotic cells and play an important role in the regulation of tomato development and stress response. However, the current circRNA studies on tomato mainly focus on fruit and leaves, and there is a lack of systematic studies on tomato circRNA at flowering stage.【Objective】Identification and analysis of circRNs in flowering tomato could be of great significance for the functional study of miRNA and circRNA in tomato, and also layed a foundation for the study of tomato growth, development and stress response mechanism.【Method】 circRNA sequencing was performed on 3 tissue samples of flowers, roots and leaves of flowering tomato plants, with 3 replicates for each sample. circRNAs were identified and their basic characteristics were analyzed. The cycle-forming ability of tissue-specific circRNAs was screened, and the host genes of identified circRNAs were analyzed by GO analysis and KEGG analysis. The mode and site of action of circRNAs were predicted and analyzed by bioinformatics methods to construct a potential circRNA-miRNA-mRNA interaction regulatory network in response to tomato growth and development.【Result】A total of 532 circRNAs were obtained by high-throughput sequencing, 83% of which were exon types. The distribution of circRNA in each chromosome of flowering tomato was uneven, among which chromosome 1 produced the most circRNAs and chromosome 5 produced the least. circRNAs differentially expressed in flower, leaf and root tissues of flowering tomato showed that 79 circRNAs were differentially expressed in flower and leaf, 133 circRNAs were differentially expressed in flower and root, and 132 circRNAs were differentially expressed in leaf and root tissues. Among them, 14 circRNAs were differentially expressed in flower, leaf and root tissues. The cyclization ability of 8 circRNAs randomly selected from 14 differentially expressed circRNAs was tested, and the results showed that all 8 circRNAs had cyclization ability. GO analysis and KEGG analysis showed that circRNAs in flowering tomato were mainly related to the binding of nucleic acids, proteins and other small molecules, as well as the synthesis and metabolism of various biological macromolecules. Finally, the tomato circRNA-miRNA-mRNA interaction regulatory network composed of 14 circRNAs, 10 miRNAs and 136 mRNAs was constructed.【Conclusion】A total of 342 tissue-specific circRNAs were identified, among which 14 were significantly expressed, and 8 were successfully identified. A circRNA-miRNA-mRNA interaction regulatory network was constructed for tomato at flowering stage. This study laid a foundation for the subsequent research of circRNA in flowering period.

Key words: circRNA; tomato; flowering stages; miRNA; ceRNA

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2023-04-03；

接受日期：2023-06-09

基金項(xiàng)目：陜西省農(nóng)業(yè)部技術(shù)創(chuàng)新引導(dǎo)專項(xiàng)（2021QFY08-02）

聯(lián)系方式：殷子賀，E-mail：ziheyin@nwafu.edu.cn。通信作者武永軍，E-mail：wuyongjun@nwafu.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）