益生菌酵素制劑對(duì)斷奶仔豬腸道微生物菌群及代謝能力的影響

范 星，王 茹，張學(xué)松，張飛燕

（1.石家莊醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河北石家莊 050599；2.河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊 050599）

集約化、現(xiàn)代化養(yǎng)殖是畜牧業(yè)發(fā)展的主要趨勢(shì)，為提高母豬的生產(chǎn)效率，養(yǎng)豬場(chǎng)會(huì)采取多種措施對(duì)出生還不足月的仔豬進(jìn)行斷奶，但易使仔豬的免疫功能和腸道功能紊亂（石志芳，2021）。為此，學(xué)者紛紛開(kāi)始關(guān)注斷奶仔豬的腸道健康問(wèn)題，并對(duì)如何加強(qiáng)腸道功能展開(kāi)探討與研究。目前關(guān)于該方面的研究已經(jīng)取得一定的研究成果。如秦旭等（2023）以42 只斷奶仔豬為研究對(duì)象，通過(guò)觀察仔豬注射脂多糖后空腸內(nèi)凋亡和自噬相關(guān)基因隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化情況，討論脂多糖是否會(huì)對(duì)空腸凋亡與自噬信號(hào)通路產(chǎn)生激活作用；郭彤等（2022）以144 只三元雜交仔豬為研究對(duì)象，分析在日糧中加入普通氧化鋅、納米氧化鋅及蒙脫石負(fù)載型氧化鋅后，斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腹瀉率、腸黏膜形態(tài)和腸道菌群多樣性受到的影響；賀峰等（2022）將釀酒酵母添加到斷奶仔豬日糧中，探討此類添加劑對(duì)仔豬腸道消化功能、微生物區(qū)系、免疫功能、抗菌能力及生長(zhǎng)性能的影響?；谏鲜鲅芯浚敬窝芯酷槍?duì)斷奶仔豬腸道的微生物菌群及代謝能力，探討益生菌酵素制劑的效用。希望通過(guò)本次研究，可為緩解仔豬早期斷奶應(yīng)激綜合征指出新的研究方向，同時(shí)，為新型腸道保護(hù)藥物的研制及在日糧中的精準(zhǔn)使用提供可靠的數(shù)據(jù)及理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 益生菌酵素制劑主要成分包括保加利亞乳桿菌、乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、青春雙歧桿菌，購(gòu)買于濟(jì)南圣和化工有限公司。

1.2 基礎(chǔ)日糧配制 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧為玉米- 豆粕型，日糧配方參考NRC（2012）7 ～11 kg 仔豬的營(yíng)養(yǎng)需要，日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 試驗(yàn)方法 以體重近似、性別比例固定等條件為前提，將60 只出生僅20 日齡的健康三元雜交仔豬平均劃分為兩個(gè)處理組，即對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧+ 益生菌酵素制劑，其益生菌酵素制劑添加量為10%，內(nèi)含納豆芽孢桿菌、乳酸菌兩種高菌落量的活菌與干酪乳。此外，在仔豬飼養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)仔豬實(shí)行一豬一籠、自由飲食的飼養(yǎng)方式，飼喂次數(shù)為每天3 次，飼喂量保證仔豬吃飽后仍有剩余。飼養(yǎng)30 d 后，采集仔豬回腸、盲腸及尿液樣本。仔豬空腹一天后進(jìn)行頸靜脈放血，在快速屠宰過(guò)程中從腹腔內(nèi)取相同長(zhǎng)度與重量的十二指腸后段（即回腸）、盲腸樣本，然后采集空腸黏膜樣品，并將樣品放入液氮罐中速凍，并置于-80℃的冰箱中保存（張衛(wèi)輝，2023）。用于代謝能力試驗(yàn)活動(dòng)的尿液樣本通過(guò)動(dòng)物代謝試驗(yàn)籠托盤取得，經(jīng)過(guò)含有磷酸鹽緩沖液的氧化氘與離心機(jī)處理，將上清液裝入核磁管內(nèi)待用。應(yīng)用十六烷基三甲基溴化銨測(cè)定法測(cè)定腸道樣本，具體操作如下。

準(zhǔn)備腸道樣本和標(biāo)準(zhǔn)液。取一定量的腸道樣本，并加入適量的溶劑使其達(dá)到適當(dāng)?shù)南♂尦潭取Ｔ谝粋€(gè)容器中加入適量的標(biāo)準(zhǔn)液作為對(duì)照組。向樣本和對(duì)照組中添加十六烷基三甲基溴化銨試劑。將容器密封并攪拌混合反應(yīng)物質(zhì)。放置一段時(shí)間后，通過(guò)離心或過(guò)濾等方法分離沉淀。使用分光光度計(jì)測(cè)量上清液的吸光度值，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的十六烷基三甲基溴化銨含量。

應(yīng)用超高效液相色譜- 高分辨質(zhì)譜法測(cè)定尿液樣本：

準(zhǔn)備尿液樣本和質(zhì)控樣品。提取尿液中的目標(biāo)化合物，對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。使用超高效液相色譜儀將樣品進(jìn)行分離。通過(guò)質(zhì)譜儀將目標(biāo)化合物轉(zhuǎn)化為離子態(tài)。使用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)量/ 荷電比（m/z）的檢測(cè)和信號(hào)采集。分析所獲得的數(shù)據(jù)，包括目標(biāo)化合物的相對(duì)峰面積或響應(yīng)，并結(jié)合內(nèi)標(biāo)或質(zhì)控樣品進(jìn)行定量計(jì)算（何祉安，2021）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SAS 9.4 軟件進(jìn)行單因素方差分析，運(yùn)用方差分析法分析組間差異，P＜0.05 表示組間差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 復(fù)合益生菌制劑對(duì)仔豬腸道形態(tài)的影響由表2 可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中仔豬十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值均得到提高（P＜0.05），由此可表明，復(fù)合益生菌制劑可改變斷奶仔豬的小腸腸道形態(tài)。

表2 斷奶仔豬腸道形態(tài)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.2 復(fù)合益生菌制劑對(duì)仔豬腸道菌群多樣性的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在Observed species、Shannon、Simpson、Chao1、Ace 和PD whole tree 等指數(shù)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。因此可以證明，復(fù)合益生菌制劑對(duì)仔豬腸道菌群多樣性產(chǎn)生了顯著影響。

表3 仔豬腸道菌群多樣性指數(shù)

2.3 復(fù)合益生菌制劑對(duì)仔豬代謝途徑的影響由圖1 可知，在代謝途徑分布圖中，每個(gè)圓即代表一條通路，圓的大小與表示通路影響因子和顯著性差異的P值相關(guān)，圓圈越大表示該通路在機(jī)體整體的代謝輪廓中所占的比重越大，對(duì)機(jī)體的作用越明顯。依據(jù)圖中分析可知，仔豬所有代謝物的可代謝途徑共有8 個(gè)，其中D- 谷氨酰胺和D-谷氨酸的代謝物較多，對(duì)應(yīng)P值越大，代謝為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的代謝物較少，對(duì)應(yīng)P值越小。由此可證明，益生菌酵素制劑對(duì)仔豬內(nèi)源性代謝途徑有較大干擾，使得代謝為D- 谷氨酰胺和D-谷氨酸的代謝物增多。

圖1 代謝途徑分布圖

3 討論

師麗剛（2020）研究表明，復(fù)合益生菌制劑中含有多種活性物質(zhì)，可提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能及生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)可知，在基礎(chǔ)日糧中添加益生菌酵素制劑后，斷奶仔豬的腸道形態(tài)發(fā)生了改變。具體表現(xiàn)為十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度以及絨毛高度與隱窩深度之間的比值均提高。劉公言等（2020）研究表明，仔豬糞便尿樣中微生物數(shù)量可以反映消化道微生物區(qū)的變化情況，仔豬腸道優(yōu)勢(shì)種群為厭氧菌，其占比達(dá)到99% 以上，而需氧菌及兼性厭氧菌只有1%。本研究在基礎(chǔ)日糧中添加益生菌酵素制劑，發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌制劑對(duì)仔豬腸道菌群多樣性產(chǎn)生了顯著影響，主要表現(xiàn)在Observed species、Shannon、Simpson、Chao1、Ace 和PD whole tree 等指數(shù)顯著高于對(duì)照組，由此證明，益生菌酵素制劑可調(diào)節(jié)仔豬腸道微生物菌群，提高乳酸菌等有益菌數(shù)量，減少大腸桿菌等有害菌數(shù)量，使有益菌能發(fā)揮抗炎、菌群調(diào)節(jié)、促進(jìn)消化、保護(hù)黏膜等功能，促進(jìn)腸道環(huán)境穩(wěn)定，提高腸胃蠕動(dòng)速度，幫助腸道功能恢復(fù)健康狀態(tài)，減少仔豬腹瀉的情況發(fā)生。此外，益生菌飼料對(duì)機(jī)體的內(nèi)源性代謝途徑產(chǎn)生了較大干擾，使D-谷氨酰胺和D- 谷氨酸代謝途徑在整體代謝輪廓中占比較大，從而增強(qiáng)了其對(duì)機(jī)體的效用力度。

4 結(jié)論

綜上所述，益生菌酵素制劑可改善仔豬腸道形態(tài)，提升仔豬腸道菌群的多樣性，并對(duì)仔豬的內(nèi)源性代謝途徑有較大干擾。