基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討健脾益腎化濁方治療多囊卵巢綜合征的作用機(jī)制*

李玲義，馮亞宏，張曉靜，馬梅香

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅蘭州 730030

2 寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院 寧夏銀川 750021

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是發(fā)生在青少年女性及育齡期婦女的一組癥候群，以高雄激素、排卵障礙、卵巢多囊樣改變?yōu)樘卣鱗1]。其中醫(yī)病因病機(jī)關(guān)及到肝脾腎等多臟腑，西醫(yī)具體病理機(jī)制至今仍不十分清楚。近期臨床表現(xiàn)主要為稀發(fā)排卵或無排卵引起的月經(jīng)后錯，甚至閉經(jīng)、不孕，伴有不同程度的高雄激素血癥（肥胖、多毛、痤瘡、黑棘皮癥）以及糖脂代謝紊亂（肥胖、血脂血糖異常）；遠(yuǎn)期影響主要為長期的血糖、血脂代謝障礙而出現(xiàn)糖尿病、高血壓、心腦血管疾病等繼發(fā)疾病，持續(xù)偏高的雌激素水平還可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌的發(fā)生。

健脾益腎化濁方是寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院婦科名家王淑斌主任及導(dǎo)師馮亞宏主任根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，沿襲經(jīng)方二仙湯、蒼附導(dǎo)痰丸和四君子湯化裁而成，方中以黃芪、黨參健脾益氣，仙茅、淫羊藿補(bǔ)腎壯陽助氣化，同時溫化脾陽，四藥合為君藥；白術(shù)益氣健脾以利水，茯苓健脾利水以滲濕，菟絲子、桑寄生補(bǔ)腎益氣，為臣藥；蒼術(shù)、荷葉健脾化濕，香附行三焦之氣，并引諸藥入肝經(jīng)，陳皮行氣調(diào)中，燥濕化痰，為佐藥[2]。在臨床跟師學(xué)習(xí)過程中總結(jié)，發(fā)現(xiàn)老師在臨床診治肥胖型PCOS 從“脾腎兩虛、痰濕內(nèi)聚”立論，以“健脾益腎、化痰祛濁”為法，治療PCOS療效頗佳。課題組前期臨床觀察已證實[3]，此方治療PCOS 療效可觀，動物實驗進(jìn)一步驗證健脾益腎化濁方治療PCOS 的作用機(jī)制可能是通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活，減少卵巢組織中炎性因子的釋放，有效減輕 PCOS 炎癥狀態(tài)，改善卵巢功能，調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌水平[4]，筆者想通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步探討其他作用機(jī)制。

現(xiàn)臨床上中醫(yī)藥因可選擇性大、靈活多樣而成為治療多囊的更優(yōu)選擇，2018 年《多囊卵巢綜合征中國診療指南》[5]首次將中醫(yī)治療寫入PCOS 患者治療指南當(dāng)中，這也說明中醫(yī)治療PCOS 確實有效。但中醫(yī)藥活性成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確，闡明中藥藥理作用和分子機(jī)制仍存在一定困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門多學(xué)科、多中心綜合的新型學(xué)科，能夠?qū)χ兴幓钚猿煞帧⒆饔冒悬c及作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測分析，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供理論依據(jù)，有利于中醫(yī)藥在臨床治療過程中的科學(xué)化。因此，本研究想通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討健脾益腎化濁方治療PCOS 的可能機(jī)制，以冀為臨床中醫(yī)藥治療PCOS 提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下。

資料與方法

1 健脾益腎化濁方活性成分的篩選及有效成分對應(yīng)靶點的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫[6]：以黃芪、白術(shù)、黨參、茯苓、淫羊藿、仙茅、菟絲子、桑寄生、陳皮、蒼術(shù)、荷葉、香附12 味中藥為關(guān)鍵詞，檢索各中藥的活性成分。由于中藥成分復(fù)雜多樣，組方藥物較多，故需要對中藥成分進(jìn)行條件篩選，生物利用度（OB）和類藥性（DL）是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中藥活性成分篩選的重要影響因素，因此，選取同時滿足OB ≥30%、DL ≥0.18 篩選該方的活性成分。進(jìn)一步篩選各活性成分的作用靶點，去除無明確作用靶點的活性成分。應(yīng)用Uniport 蛋白數(shù)據(jù)庫對各中藥的作用靶點進(jìn)行人類蛋白基因匹配。

2 PCOS 相關(guān)靶點的篩選

通 過Gene Cards 數(shù) 據(jù) 庫[7]：以“polycystic ovary syndrome or PCOS”為關(guān)鍵詞檢索與PCOS 相關(guān)的疾病蛋白。

3 健脾益腎化濁方與PCOS 交集靶基因的篩選及相互關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過venny2.1.0 對組方潛在活性成分靶基因和PCOS 相關(guān)靶基因制作韋恩圖。用excel 數(shù)據(jù)處理中藥與疾病的交集基因。將交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置基因來源為人類，置信度為0.9。對String 數(shù)據(jù)庫中的TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.0 進(jìn)行可視化分析。

4 交集靶基因的GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

將組方靶基因和PCOS 相關(guān)靶基因的交集基因通過Meta scape 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 信號通路分析并利用微生信作圖將結(jié)果可視化分析。

結(jié) 果

1 健脾益腎化濁方活性成分的篩選及有效成分對應(yīng)靶點的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，篩選健脾益腎化濁方活性成分122 種，其中黃芪17 種，白術(shù)4 種，黨參16 種，茯苓6 種，淫羊藿23 種，仙茅6 種，菟絲子9種，桑寄生2 種，陳皮5 種，蒼術(shù)4 種，荷葉14 種，香附16 種，通過Cytoscape3.9.0 軟件構(gòu)建活性成分網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。對有明確作用的靶點通過Uniport 蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行人類蛋白匹配后導(dǎo)入Cytoscape3.9.0 軟件構(gòu)建中藥-活性成分-基因靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖1 組方活性成分網(wǎng)絡(luò)

圖2 中藥-活性成分-基因靶點網(wǎng)絡(luò)

2 健脾益腎化濁方與PCOS 交集靶基因的篩選及相互關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

檢索Gene Cards 數(shù)據(jù)庫中PCOS 相關(guān)疾病基因1297 個，與組方活性成分靶基因254 個，通過venny2.1.0 在線工具制作韋恩圖，見圖3。再通過excel 數(shù)據(jù)處理，取中藥組方與疾病的交集基因。將交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。設(shè)置置信度0.9，其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，PPI 分析：有116 個節(jié)點，451 條線，平均節(jié)點的度值7.78，平均局部聚類系數(shù)0.44。點的連接條數(shù)越多表示關(guān)聯(lián)越大。將交集基因String 數(shù)據(jù)庫中的TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.0，利用插件Cyto NCA 進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖5。圖中每個顏色代表一個基因靶點，節(jié)點顏色表示度值，度值越大，顏色越深，由黃到綠，圖標(biāo)也越大。圖中顯示健脾益腎化濁方治療PCOS 排在前十位的靶點有MAPK1、MAPK3、AKT1、TP53、TNF、MAPK14、IL6、ESR1、EGRF、RB1，這些靶點可能是治療PCOS 的關(guān)鍵基因。

圖3 疾病靶點Venn

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)

3 交集靶基因的GO 富集分析

通過Meta scape 數(shù)據(jù)庫：對健脾益腎化濁方治療PCOS 的交集靶點進(jìn)行GO 富集分析，包括生物過程、細(xì)胞成分和分子功能3 個方面的分析。將從數(shù)據(jù)庫下載的GO.csv 文件通過excel 進(jìn)行處理，分別選取前20 位GO 條目，結(jié)果顯示健脾益腎化濁方治療PCOS主要靶點的生物過程（BP）主要富集在激素、脂質(zhì)細(xì)胞、無機(jī)物質(zhì)、外來刺激、類固醇激素脂多糖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞群體增殖、代謝和分解過程等的調(diào)控；細(xì)胞組成（CC）主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、膜蛋白、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)等；分子功能（MF）主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、生長因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、MAP 激酶活性、腫瘤壞死因子等。再借助微生信在線網(wǎng)站作GO 富集BP、CC、MF 三合一圖，見圖6。

圖6 GO 富集BP、CC、MF

4 交集靶基因的KEGG 富集分析

通過Meta scape 數(shù)據(jù)庫：對健脾益腎化濁方治療PCOS 的交集靶點進(jìn)行KEGG 富集分析，將下載的KEGG.csv 文件通過excel 進(jìn)行處理，選取前20 位為主要信號通路如癌癥通路、AGE-RAGE 信號通路、雌激素信號通路、IL-18、IL-13、IL-4 信號通路、PI3KAkt 信號通路、細(xì)胞因子信號通路等，見表1。再借助微生信在線網(wǎng)站作KEGG 富集氣泡圖，見圖7。

表1 KEGG 通路富集分析結(jié)果

圖7 KEGG 富集氣泡

討 論

PCOS 作為一種高度異質(zhì)性疾病，發(fā)病率正在呈逐年增長的趨勢，西醫(yī)具體病理機(jī)制至今仍不十分清楚。但目前臨床公認(rèn)其發(fā)病與胰島素抵抗、糖脂代謝異常、高雄激素有關(guān)，且高糖高脂-胰島素抵抗-高雄激素之間是一個惡性循環(huán)的過程。長期高糖高脂可導(dǎo)致胰島素抵抗，當(dāng)發(fā)生胰島素抵抗時，卵巢分泌雄激素增多，導(dǎo)致血液中雄激素增加，生成高雄激素血癥，而升高的雄激素反過來又能導(dǎo)致高胰島素血癥[8]。有文獻(xiàn)表明，PCOS 婦女中發(fā)生糖代謝異常率為24.5%[9]，血脂異常發(fā)生率為24.7%[9]，高雄激素占PCOS 患者的75%[10]，胰島素抵抗發(fā)生率占肥胖PCOS的75%[11]。臨床西醫(yī)治療主要為改善生活方式、調(diào)節(jié)飲食結(jié)構(gòu)、降雄、改善胰島素抵抗、降糖降脂等對癥治療[12]。中醫(yī)對其治療主要包括分型論治、中成藥、周期療法、針灸治療等[13]。

本研究通過對健脾益腎化濁方治療PCOS 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，主要從組方的活性成分、作用靶點、信號通路等方面進(jìn)行探討，得到健脾益腎化濁方的潛在活性成分有槲皮素、山奈酚、植物甾醇、木犀草素、異鼠李素等，可能通過絲裂原活化蛋白激酶受體（MAPK1、MAPK3、MAPK14）、蛋白激酶（AKT1）、白介素受體（IL-6）、腫瘤抑制因子（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、雌激素受體（ESR1）等多靶點，可以作用于AGE-RAGE 信號通路、雌激素信號通路、炎癥信號通路、PI3K-Akt 信號通路、癌癥通路、細(xì)胞因子信號通路等多通路發(fā)揮治療PCOS 的作用。

首先，從TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選后，健脾益腎化濁方的潛在活性成分主要有槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、植物甾醇（MOL000359）等，組方共同活性成分結(jié)果，見表2。

表2 組方共同成分

健脾益腎化濁方的潛在活性成分可能發(fā)揮的治療作用分析如下：槲皮素是一種黃酮類化合物，它可能具有抗炎和抗氧化特性[14]。王針織通過動物實驗證實[15]，槲皮素可能通過抑制TLR/NF-κB 信號通路，改善多囊卵巢胰島素抵抗微環(huán)境炎癥，從而逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗。有文獻(xiàn)進(jìn)一步表述[16]，槲皮素有上述作用。因此，槲皮素是一個潛在的，對胰島素抵抗有較好治療效果的藥物。山奈酚也是一種廣泛存在于自然界的黃酮類化合物[17]，其生物活性主要為抗炎、抗氧化以及抗癌[18]。植物甾醇及其衍生物具有降血糖、調(diào)血脂、降膽固醇、抗腫瘤、抗炎、抗氧化和預(yù)防心血管疾病等生理活性[19]，而糖脂代謝紊亂是PCOS 重要的病理改變。木犀草素也是黃酮類化合物，具有抗氧化，抗炎，抗糖尿病等作用，可以通過調(diào)控PI3K/Akt 通路抑制IR[20]。綜上所述，健脾益腎化濁方中篩選出來的潛在活性成分可通過調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、卵泡發(fā)育等發(fā)揮治療PCOS 的作用。

另外，PCOS 患者因糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、高雄激素血癥，機(jī)體長期處于慢性炎癥或氧化應(yīng)激狀態(tài)[21]。從關(guān)鍵靶點分析，IL-6 是人體多種細(xì)胞分泌的一種多肽物質(zhì)，作用于機(jī)體免疫、內(nèi)分泌和心血管等多系統(tǒng)，是參與機(jī)體各種調(diào)節(jié)的重要因子。首先，IL-6 作為一種炎癥標(biāo)志物，在PCOS 的發(fā)病過程中有著多方面影響[22]。另外，PCOS 患者的血清IL-6 水平與糖脂代謝有關(guān)[23]，血清IL-6 水平與BMI 呈正相關(guān)，且IL-6 主要與IR 有關(guān)[24]。MAPK 是一類進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，能將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為廣泛的細(xì)胞反應(yīng)從而參與增殖、分化、遷移、凋亡等多種細(xì)胞功能[25]。本研究顯示，MAPK1、MAPK3、MAPK14 都是排在前十位的關(guān)鍵靶點，MAPK3 又叫細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1（ERK1），ERK1 和ERK2 在 功 能 上 相 似[26]；MAPK14 是MAPK家族中最豐富，最具特征的重要成員，在多種腫瘤中高度表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌[27]。

KEGG 富集分析顯示，AGE-RAGE 信號通路、雌激素信號通路和PI3K-Akt 信號通路是健脾益腎化濁方發(fā)揮治療PCOS 的主要通路，其中AGE-RAGE 信號通路和PI3K-Akt 信號通路均與胰島素抵抗有關(guān)。研究表明，大約50%～70%患有PCOS 的女性有一定程度的胰島素抵抗[28]。PI3K-Akt 作為胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路，具有調(diào)節(jié)控制機(jī)體中的葡萄糖吸收、糖原降解和合成的作用，增強(qiáng)PI3K/Akt 信號通路的表達(dá)可減輕胰島素抵抗。AGE-RAGE 信號通路是一個和糖尿?。―M）及其并發(fā)癥聯(lián)系相當(dāng)密切的通路[29]，AGEs 為糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products），RAGE 屬于細(xì)胞表面免疫球蛋白超家族多配體受體成員，若兩者結(jié)合，可以激活并促進(jìn)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致IR 及DM 其他并發(fā)癥的發(fā)生[29]。本研究結(jié)果得出的關(guān)鍵靶點在內(nèi)分泌拮抗通路上顯著富集，表明健脾益腎化濁方可通過多靶點調(diào)節(jié)PCOS 患者內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，推測健脾益腎化濁方的活性成分、關(guān)鍵靶點、信號通路可能以“多成分-多靶點-多通路”調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、卵泡發(fā)育等方面發(fā)揮治療PCOS 的作用。后續(xù)本課題組將對其活性成分及具體機(jī)制進(jìn)行深入探討，以期為健脾益腎化濁方在臨床治療中的辨證用藥提供科學(xué)依據(jù)。