利用線(xiàn)粒體序列比較分析梭鱸鴨綠江和烏倫古湖群體的遺傳結(jié)構(gòu)

孫志鵬，魯翠云，那榮濱，鄭先虎

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淡水魚(yú)類(lèi)育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

梭鱸（Sander lucioperca）體肥肉厚、營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，素有“淡水魚(yú)王”之稱(chēng)，俗稱(chēng)十道黑、牙魚(yú)，屬鱸形目（Perciformes）、鱸科（Percidae）、梭鱸屬。梭鱸肌肉粗蛋白水平（20.99%）和總氨基酸含量顯著高于加州鱸（Micropterus salmoides）（18.63%）和鱖（Siniperca chuatsi）（18.90%）[1-4]，粗脂肪水平（0.63%）顯著低于加州鱸（4.58%）和鱖（2.56%），是具有廣闊發(fā)展前景的淡水養(yǎng)殖對(duì)象。梭鱸在我國(guó)主要分布于新疆額爾齊斯河水系、伊犁河水系和黑龍江水系[5]。1992 年，新疆福?？h水產(chǎn)技術(shù)推廣站成功地人工繁殖出梭鱸，隨后推廣到全國(guó)十幾個(gè)省區(qū)[6]。目前，許多天然水體，如黑龍江、興凱湖和烏蘇里江在漁業(yè)調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)了梭鱸[5,7,8]。本研究團(tuán)隊(duì)在鴨綠江發(fā)現(xiàn)有梭鱸群體存在，且具有較大的資源量，其來(lái)源不詳。烏倫古湖作為最早開(kāi)展梭鱸繁殖的水體，是我國(guó)梭鱸資源的主要產(chǎn)地和供給地。本研究比較分析了梭鱸鴨綠江群體與烏倫古湖群體的遺傳差異。

線(xiàn)粒體DNA（Mitochondria DNA,mtDNA）具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、突變速度快、單倍型隨機(jī)缺失、較穩(wěn)定的母系遺傳等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于研究群體遺傳結(jié)構(gòu)和物種進(jìn)化等[9，10]。線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b（Mitochondria cytochrome b，Cyt b）基因和線(xiàn)粒體DNA 控制區(qū)（又稱(chēng)D-環(huán)區(qū)，control region displacement loop，DLoop）是常用的線(xiàn)粒體標(biāo)記基因[11-13]。Cyt b 基因進(jìn)化速度適中，其變異主要為轉(zhuǎn)換和顛換，能較好地顯示不同科、屬、種間的進(jìn)化關(guān)系，常用于構(gòu)建物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[14,15]。D-loop 區(qū)處于非編碼區(qū)，構(gòu)特殊，富含A-T 堿基，是線(xiàn)粒體基因組中進(jìn)化速度最快的區(qū)域和研究魚(yú)類(lèi)近緣種間進(jìn)化關(guān)系和種群多樣性的重要分子標(biāo)記[16-18]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)梭鱸主要分布群體的遺傳多樣性研究較少，本研究結(jié)合這2種標(biāo)記的特點(diǎn)，比較分析了資源記錄最早的烏倫古湖梭鱸群體及本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)的鴨綠江梭鱸群體的遺傳結(jié)構(gòu)，有助于了解其資源狀況，為梭鱸種質(zhì)資源保護(hù)及繁育利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

梭鱸樣品分別于2021 年6—8 月取自新疆烏倫古湖（XJ，48 尾）和鴨綠江丹東段（YL，62 尾），剪取部分鰭條用無(wú)水乙醇固定后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 提取

參照基因組提取試劑盒（天根生物）使用說(shuō)明，從梭鱸鰭條組織中提取基因組DNA，用NanoDropTM8000 分光光度計(jì)檢測(cè)所提取DNA 的濃度及純度，稀釋至50 ng/μL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 擴(kuò)增與測(cè)序

使用引物L(fēng)14724 和H15149 擴(kuò)增梭鱸Cyt b基因部分序列[19]。根據(jù)梭鱸線(xiàn)粒體基因組全序列（GenBank 收錄號(hào)：KP125333）[20]設(shè)計(jì)D-loop 引物、S-Dloop1F 和S-Dloop1R。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成（表1）。Cyt b 基因序列和D-loop控制區(qū)的PCR 反應(yīng)體系均為25 μL，其中模板DNA 2 μL（50 ng/μL）、混合PCR 緩沖液buffer 18 μL（10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP）、上下游引物（10 μm/L）各0.6 μL、Taq DNA 聚合酶1.5 U，其余體積用去離子水補(bǔ)充。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 9700 型PCR 儀上完成，反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取少量產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)合格后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化后正向測(cè)序。

表1 擴(kuò)增梭鱸Cyt b 和D-loop 區(qū)序列所使用的引物Tab.1 Primers used to amplify Cyt b gene and D-loop sequences of mtDNA in pikeperch Sander lucioperca

1.4 序列數(shù)據(jù)分析

測(cè)序后，將序列輸入Clustal X 軟件[21]進(jìn)行序列的對(duì)位排列，加以人工校對(duì)，截取相同長(zhǎng)度的序列用于群體遺傳分析。用DnaSP v 5 軟件[22]統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)類(lèi)型和數(shù)目及簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型多樣性（haplotype diversity,Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π），識(shí)別每個(gè)群體的單倍型組成;進(jìn)行Tajima's D 和Fu's Fs 的中性檢驗(yàn)。用MEGA 7.0 軟件[23]分析序列的堿基組成和轉(zhuǎn)換/顛換值，用Kimura 2-Parameters 方法計(jì)算群體內(nèi)和群體間的遺傳距離，以梭鱸（KP125333）作為參考序列，以加拿大梭鱸（S.canadensis）（MH301082）作為外群繪制基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）[24]的單倍型發(fā)生關(guān)系圖，采用Bootstrap（1 000）檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度。用PopART 軟件基于TCS 算法，繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。用Arlequin 3.11 軟件[25]中的分子方差分析（AMOVA）計(jì)算群體間及群體內(nèi)的遺傳變異組成，以及群體間的遺傳分化系數(shù)（Fst）。

2 結(jié)果與分析

2.1 梭鱸Cyt b 基因序列和D-loop 區(qū)序列特征

將所測(cè)得的序列與梭鱸參考線(xiàn)粒體基因組序列（KP125333）進(jìn)行比對(duì)，去除引物序列及低質(zhì)量序列，截取425 bp 的Cyt b 基因序列和479 bp 的Dloop 區(qū)序列用于分析群體遺傳多樣性。Cyt b 基因共檢測(cè)到保守位點(diǎn)423 個(gè)，變異位點(diǎn)2 個(gè)，其中單變異位點(diǎn)1 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)1 個(gè)，定義了3 種單倍型（HapA～HapC，表2）。測(cè)得的序列中A、T、C、G 的堿基組成分別為26.55%、30.82%、27.30% 和15.33%，其中A+T 含量（57.37%）高于C+G 含量（42.63%），堿基明顯偏向A+T，轉(zhuǎn)換/ 顛換值R=14.625。D-loop 區(qū)共檢測(cè)到保守位點(diǎn)453 個(gè)，變異位點(diǎn)26 個(gè)，其中單變異位點(diǎn)19 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)7 個(gè)，定義了17 種單倍型（Hap1～Hap17，表3）。測(cè)得的序列中A、T、C、G 的堿基組成分別為32.40%、34.24%、18.38%和14.98%，其中A+T 含量（66.64%）明顯高于C+G 含量（33.36%），堿基組成具有明顯的偏倚性，轉(zhuǎn)換/顛換值R=0.988。

表2 梭鱸群體Cyt b 基因序列變異位點(diǎn)Tab.2 Variable loci of Cyt b gene sequence in Sander lucioperca

表3 梭鱸群體D-loop 基因序列變異位點(diǎn)Tab.3 Variable loci of D-loop sequence in pikeperch Sander lucioperca

2.2 梭鱸群體單倍型分析

在110 個(gè)梭鱸Cyt b 基因序列中，檢測(cè)到3 個(gè)單倍型。單倍型HapA 為2 群體共享單倍型，出現(xiàn)頻次最高，分布于92 個(gè)樣本中，占總數(shù)83.64%；其次為HapC（17 個(gè)）占總數(shù)15.45%，為XJ 特有單倍型；HapB 為YL 特有單倍型，只有1 個(gè)。NJ 聚類(lèi)圖顯示，HapA、HapB 與梭鱸參考序列KP125333 聚為一支，再與HapC 聚為一大支，加拿大梭鱸作為外群獨(dú)立為一支（圖1）。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，HapB 和HapC以HapA 為中心，各有1 個(gè)變異位點(diǎn)（圖2）。

圖1 梭鱸群體基于Cyt b 基因序列的3 個(gè)單倍型分布及NJ 聚類(lèi)圖Fig.1 Distribution of three haplotypes and NJ dendrogram based on Cyt b gene of mtDNA in Sander lucioperca

圖2 梭鱸基于Cyt b 基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Haplotypes network in pikeperch Sander lucioperca based on Cyt b gene of mtDNA

87 個(gè)梭鱸D-loop 序列中檢測(cè)到17 個(gè)單倍型。單倍型Hap1 數(shù)量最多（65 個(gè)），占總數(shù)74.71%，為2 群體共享單倍型;其他單倍型均為1～3 個(gè)不等，Hap13～17 為XJ 特有單倍型，剩余Hap2～12 為YL特有單倍型。NJ 聚類(lèi)圖顯示，大多數(shù)單倍型（Hap1、Hap10、Hap3、Hap7、Hap6、Hap15、Hap4、Hap8、Hap2、Hap9、Hap11、Hap12 和Hap5）與梭鱸參考序列KP1 25333 聚為一支，再與Hap14、Hap13 和Hap16 聚為一大支，Hap17 獨(dú)立為一支，加拿大梭鱸作為外群獨(dú)立為一支（圖3）。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖以Hap1 為中心呈現(xiàn)放射狀結(jié)構(gòu)，Hap3、Hap4、Hap5、Hap11、Hap15、Hap17 與Hap1 相比只變異1 個(gè)位點(diǎn)，其他單倍型變異位點(diǎn)較多，YL 群體與XJ 群體除Hap1 共享外，單倍型分隔明顯（圖4）。

圖3 梭鱸群體基于D-loop 序列的17 個(gè)單倍型分布及NJ聚類(lèi)圖Fig.3 Distribution and NJ dendrogram of 17 haplotypes in pikeperch Sander lucioperca base d on D-loop sequence of mtDNA

圖4 梭鱸基于D-loop 序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Haplotypes network in Sander lucioperca based on D-loop sequence of mtDNA

2.3 梭鱸群體遺傳多樣性

2 群體Cyt b 基因序列的單倍型數(shù)（nh）均為2個(gè)，總體單倍型多樣性（Hd）為0.279±0.049，核苷酸多樣性（π）為0.000 66±0.000 12，YL 的單倍型多樣性和核苷酸多樣性明顯低于XJ。Tajima's D 和Fu’s Fs 檢驗(yàn)結(jié)果都顯示，2 群體差異均不顯著，符合中性突變，說(shuō)明群體保持穩(wěn)定（表4）。

表4 梭鱸群體基于Cyt b 基因和D-loop 序列的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity estimates in pikeperch Sander lucioperca based on Cyt b gene and D-loop sequence of mtDNA

2 群體D-loop 序列的單倍型數(shù)（nh）為6～12個(gè)，總體單倍型多樣性（Hd）為0.442±0.068，核苷酸多樣性（π）為0.002 25±0.000 52，YL 的單倍型多樣性和核苷酸多樣性略高于XJ。Tajima's D 中性檢驗(yàn)及Fu’s Fs 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，YL 差異不顯著，符合中性突變，群體穩(wěn)定；而XJ 差異顯著且均為負(fù)值，表明群體曾經(jīng)歷過(guò)快速擴(kuò)張；2 群體D-loop 序列總體極顯著偏離中性突變（表4）。

2.4 梭鱸群體間遺傳分化與遺傳距離

梭鱸群體Cyt b 基因的35.44%的遺傳變異來(lái)自群體間，遺傳分化系數(shù)（FST）為0.354 38，表明群體遺傳分化程度極大（FST＞0.25），達(dá)到顯著水平。梭鱸群體D-loop 序列的群體間遺傳分化系數(shù)（FST）為0.025 82，分化程度很大，群體內(nèi)遺傳變異（97.42%）遠(yuǎn)大于群體間（2.58%），遺傳分化也主要來(lái)自群體內(nèi)，與Cyt b 結(jié)果一致（表5）。Cyt b 基因的群體間遺傳分化程度稍大于D-loop 序列。

表5 基于線(xiàn)粒體Cyt b 基因和D-loop 序列的AMOVA 分析結(jié)果Tab.5 The result of AMOVA based on Cyt b gene and D-loop sequence of mtDNA

利用Cyt b 基因序列和Kimura 2-Parameters 方法計(jì)算的2 群體之間的遺傳距離顯示，YL 與XJ 的遺傳距離為0.000 873，YL 和XJ 群體內(nèi)遺傳距離分別為0.000 076 和0.001 102；利用D-loop 序列分析顯示，2 群體間遺傳距離為0.002 269，YL 和XJ 群體內(nèi)遺傳距離分別為0.002 422 和0.001 919（表5）。D-loop 序列分析2 群體間遺傳距離大于Cyt b基因序列。鴨綠江群體內(nèi)遺傳距離大于群體間，也提示這個(gè)群體可能是一個(gè)混合來(lái)源的群體。

3 討論

本研究運(yùn)用序列測(cè)定技術(shù)，分析鴨綠江和烏倫古湖2 個(gè)梭鱸群體的Cyt b 基因和D-loop 區(qū)序列特征，發(fā)現(xiàn)梭鱸這兩個(gè)基因都有高（A+T）含量、低（G+C）值含量的特點(diǎn)，與杜景豪等[26]對(duì)日本囊蝦（Penaeus japonicus）線(xiàn)粒體Cyt b 和D-loop 基因序列的研究結(jié)果相符，也與孔杰等[27]對(duì)施氏鱘（Acipenser schrencki）和西伯利亞鱘（Acipenser baerii）線(xiàn)粒體Cyt b 和D-loop 基因序列的研究結(jié)果相符。Dibattista 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體都具有高A+T值低G+C值特點(diǎn)。胡玉婷及王楨璐等[29,30]發(fā)現(xiàn)堿基中A+T 的含量越高，線(xiàn)粒體DNA 的進(jìn)化優(yōu)勢(shì)越明顯。本研究中，Cyt b 基因和D-loop 區(qū)序列的鴨綠江梭鱸和烏倫古湖梭鱸A+T 含量分別為57.41%、57.30%（Cyt b）和66.69%、66.60%（D-loop），均明顯高于G+C 含量，鴨綠江與烏倫古湖相比，堿基含量沒(méi)有明顯差異，表明鴨綠江與烏倫古湖梭鱸群體進(jìn)化較為同步。本研究中2 群體D-loop 區(qū)的A+T 含量均明顯大于Cyt b 的A+T 含量，表明堿基組成有偏倚性，說(shuō)明本研究梭鱸群體的D-loop 比Cyt b 基因在進(jìn)化中更具優(yōu)勢(shì)。吳靜等[31]發(fā)現(xiàn)。生物體進(jìn)化過(guò)程中顛換是不斷積累的，因此轉(zhuǎn)換/顛換的比值逐漸減小，一般認(rèn)為當(dāng)比值小于2 時(shí)，基因序列突變已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，鴨綠江梭鱸D-loop 的轉(zhuǎn)換/顛換比值為0.504，表示其突變已經(jīng)達(dá)到飽和。

遺傳多樣性可有效反應(yīng)生物適應(yīng)生存能力，遺傳多樣性越高，該生物體的遺傳育種潛力越豐富[32]。單倍型多樣性（Hd）與核苷酸多樣性（π）是衡量一個(gè)群體mtDNA 遺傳多樣性的重要指標(biāo)，核苷酸多樣性能體現(xiàn)各種mtDNA 單倍型在群體中所占的比例，能更準(zhǔn)確地表現(xiàn)一個(gè)群體的多態(tài)程度，π 值越高表明遺傳多樣性越高。Ichikawa-Seki 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個(gè)群體核苷酸多樣性指數(shù)在0.001 5～0.004 7時(shí)，該群體的遺傳多樣性較低。本研究發(fā)現(xiàn)，鴨綠江及烏倫古湖梭鱸群體遺傳多樣性較低。Grant 等[34]根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性之間的關(guān)系將群體的擴(kuò)張事件分為4 種類(lèi)型：第一類(lèi)為低單倍型多樣性和低核苷酸多樣性（Hd<0.5，π<0.5%）；第二類(lèi)為高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性（Hd＞0.5，π<0.5%）；第三類(lèi)為低單倍體多樣性和高核酸多樣性；第四類(lèi)為高單倍體多樣性和高核酸多樣性。鴨綠江及烏倫古湖梭鱸群體遺傳多樣性類(lèi)型應(yīng)屬于第一類(lèi)型。此種類(lèi)型表明群體最近發(fā)生了瓶頸效應(yīng)或由單一、少數(shù)系群發(fā)生了奠基者效應(yīng)[35]。梭鱸鴨綠江群體及烏倫古湖群體均受到奠基者效應(yīng)的影響，群體遺傳多樣性較低。

本研究結(jié)果顯示，Cyt b 基因的種群間變異率35.44%明顯低于種群內(nèi)變異率64.56%，D-loop 基因種群內(nèi)變異率97.42%也明顯高于種群間變異率2.58%。表明變異主要來(lái)自于種群內(nèi)，可能是由不同水系不同批次引入梭鱸造成。一般通過(guò)Tajima's D檢驗(yàn)及Fu’s Fs 檢驗(yàn)來(lái)檢測(cè)種或種群內(nèi)部的自然選擇作用。本研究基于D-loop 基因序列Tajima's D 檢測(cè)及Fu’s Fs 檢驗(yàn)結(jié)果均顯示，烏倫古湖群體為負(fù)值且顯著偏離中性檢驗(yàn)（P＜0.01），說(shuō)明該群體在近期歷史階段出現(xiàn)過(guò)種群快速擴(kuò)張事件。Heather 等[36]根據(jù)群體間遺傳分化系數(shù)（FST）大小劃定了群體的分化程度（高度分化，F(xiàn)ST＞0.25；中度分化，0.05＜FST≤0.25；低度分化，0＜FST≤0.05），作為群體遺傳分化標(biāo)準(zhǔn)被廣泛認(rèn)可。本研究中，Cyt b 基因的群體間遺傳分化系數(shù)（FST）為0.35438，大于0.25，表明兩個(gè)梭鱸群體分化程度較高。魯翠云等[37]利用COI 基因分析了國(guó)內(nèi)外8 個(gè)群體梭鱸的遺傳結(jié)構(gòu)，在FST判定方面發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)群體除黑河群體外，XJ 群體和YL 群體并無(wú)明顯分化，主要是由于參照不同導(dǎo)致，在與國(guó)外群體相對(duì)比時(shí)，F(xiàn)ST相對(duì)減小。

本研究結(jié)果提示，鴨綠江群體部分可能來(lái)源于逃逸、放生或養(yǎng)殖棄養(yǎng)等，不完全來(lái)源于烏倫古湖群體，且鴨綠江及烏倫古湖梭鱸群體分化程度較高，遺傳多樣性較低。本研究所得到的梭鱸種群遺傳結(jié)構(gòu)特征對(duì)于其人工繁育及遺傳多樣性的監(jiān)測(cè)具有重要意義。