黎藥膽木內生細菌群落結構多樣性研究及其基因功能預測分析

卜宣尹 楊衛(wèi)麗

黎藥膽木內生細菌群落結構多樣性研究及其基因功能預測分析

卜宣尹1,2楊衛(wèi)麗1

（1. 海南醫(yī)學院 海南?？?571199；2. 三明醫(yī)學科技職業(yè)學院 福建三明 365000）

以海南省5個產區(qū)采集的膽木為材料，采用高通量16S rRNA測序技術分析了膽木的根、莖、葉和表皮4個組織的內生細菌群落多樣性，并通過PICRUSt分析其內生細菌的潛在功能。結果表明，膽木在16S rRNA V3-V4區(qū)高質量序列片段共得到3759378條有效序列，劃分為3475個OUTs，內生細菌分為30門、82綱、183目、326科、764屬，具有豐富的菌群多樣性，組間差異顯著。對內生細菌群落結構分析可知，共有優(yōu)勢菌屬為d（25.11%）、芽孢桿菌屬（15.16%）、伯克霍爾德氏菌屬（7.06%）、羅爾斯通菌屬（5.03%）、馬賽菌屬（4.60%）。其中，根優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬）、伯克霍爾德氏菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、固氮根瘤菌（）、根瘤菌屬（Rhizobium）；莖優(yōu)勢菌屬為、羅爾斯通菌屬（）、馬賽菌屬（）、Mitochondria_unclassified；葉優(yōu)勢菌屬為短小桿菌屬（）；表皮優(yōu)勢菌屬為賴氨酸芽胞桿菌屬（）、類芽孢桿菌屬（）。PICRUSt分析顯示，膽木不同組織內生細菌主要涉及6個生物代謝通路及36個子功能。不同組織的內生細菌基因二級功能層預測基因種基本無差異，但基因豐度具有顯著差異，代謝為影響膽木植株內生細菌多樣性和豐富度的重要因素。通過全面揭示膽木不同組織內生細菌多樣性的變化趨勢和規(guī)律，能為其內生細菌的進一步應用、充分挖掘其蘊含的豐富微生物資源奠定理論基礎。

膽木；內生細菌；群落結構；多樣性；基因功能

內生細菌為定居在植物組織中不對宿主植物有負面影響的微生物。內生細菌可以從無菌的根、莖和葉等植物組織中分離出來[1]，與植物宿主形成互利共生關系。有益的內生細菌有維持植物生長健康、影響及調控植物代謝、產生次生代謝產物等作用[2]。同時，宿主植物能為內生細菌提供生長所必需的能量和營養(yǎng)，這種有益效果是通過產生具有重要生物活性（如抗真菌和抗病毒）的植物激素和次級代謝產物，并通過促進礦物質吸收或固氮的增加來實現[3-4]。

膽木[（Pierre ex Pitard）Merr. & Chun]為茜草科（Rubiaceae）烏檀屬（）的多年生喬木，是我國特有的源生烏檀屬植物，也是海南黎藥資源重點研究保護物種[5]，是海南省重點研究傳統(tǒng)黎族藥用植物之一。目前有關膽木的研究主要集中在化學成分、藥理作用、抗炎作用等方面[6]，鮮有對膽木內生菌的探究。對膽木內生細菌進行探究有利于豐富和完善膽木內生細菌種質資源，對解決膽木因在自然條件下生長緩慢、人工種植產量不高、品質不佳等問題提供方向，對開拓膽木輔助育種新方向具有重要意義。本研究基于Illumina MiSeq第二代高通量測序技術，以海南省5個不同產區(qū)的膽木為材料，對其不同組織的內生細菌進行全面解析，并進行相關的基因功能預測，為進一步闡明內生細菌與膽木的相互作用機制奠定基礎，為不同組織內生細菌功能菌株的挖掘和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品均采集自海南省，包括鸚哥嶺自然保護區(qū)、瓊中黎族苗族自治縣、興隆植物園、尖峰嶺、儋州市。詳見表1。

表1 樣品采集信息表

注：PR～P3R、PJ～P3J、PL～P3L、PK～P3K分別表示在鸚哥嶺自然保護區(qū)坡告嶺采集的根、莖、葉、皮；WR、WJ、WL、WK分別表示在鸚哥嶺自然保護區(qū)青蛙嶺采集的植物根、莖、葉、皮；YR、YJ、YL、YK分別表示在鸚哥嶺自然保護區(qū)牙師村采集的植物根、莖、葉、皮；ZR、ZJ、ZL、ZK分別表示在鸚哥嶺自然保護區(qū)壯賀村采集的植物根、莖、葉、皮；JR、JJ、JL、JK分別表示在鸚哥嶺自然保護區(qū)青介村采集的植物根、莖、葉、皮。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集前處理 樣品采集：在每個樣品采集地分別挑選間距8 m以上的5株健康的野生膽木作為采樣對象。使用鐵鍬小心挖至根末級，用剪刀剪下新鮮的莖、葉組織，用小刀剝取新鮮干皮。分別做好標記后將膽木組織樣品裝入塑封袋內并做好標記后放入便攜式保溫箱干冰冰凍保存。具體分組見表1。

1.2.2 樣品表面消毒 參照Inuwa等[7]預處理方法，將5個采集地的各組織進行細菌的分離實驗。先用自來水沖洗至表面無明顯雜質，無菌濾紙吸干表面水分。于超凈臺內取出樣品后，75%的酒精溶液浸泡5 min，無菌水沖洗3次，再用5%次氯酸鈉溶液浸泡3～5 min，無菌水沖洗3次，保證其無菌，取最后1次沖洗的無菌水200 μL涂布于LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d，檢驗滅菌效果，確保表面滅菌徹底，分離出的為內生細菌。最后挑取形態(tài)、顏色及大小有明顯差異的菌株，與40%甘油進行1∶1混合，保存于–80℃冰箱中，并進行后續(xù)實驗。

1.2.3 微生物總DNA提取 根據制造商的說明，使用Magnetic Soil And Stool DNA Kit試劑盒（中國北京天根生物技術有限公司）從植物樣品中提取總DNA。對于具體的提取過程，參考Liu等[8]的CTAB方法。最后加入40 μL無菌水溶解DNA，于–20℃冰箱內保存。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。

1.2.4 目的片段PCR擴增及測序 以16sRNA反映菌群組成和多樣性的目標序列為靶點，使用Phusion酶進行一步PCR，細菌PCR所用引物[9]：V3-V4通用引物，341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。使用NovaSeq 6000測序儀進行2×250 bp的雙端測序。所得樣品DNA委托杭州聯川生物技術股份有限公司完成測序。

1.2.5 數據處理 使用QIIME2（2019.4）平臺DADA2方法進行序列處理。通過qiime dada2 denoise-paired調用DADA2進行質控、去噪、拼接和去嵌合體，得到ASVs（amplicon sequence variants）?；诩毦鷶祿靤ilva 132，采用OIIME2的classify-sklearn算法進行物種分類學注釋。使用R軟件（VennDiagram）進行細菌分類OTU（操作單元）劃分，UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）方法對樣品進行聚類。使用Mothur軟件計算細菌物種豐度和多樣性?；贙EGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數據庫，利用PICRUSt（Phylogenetic Investigationof Communities by Reconstruction of Unobserved States）對微生物群落進行功能預測。

2 結果與分析

2.1 有效數據分析

對原始下機數據進行高質量數據統(tǒng)計，結果顯示：所采集膽木根、莖、皮、葉樣品中分別得到1 006 154、997 701、1 005 124、1 092 532條 Raw Tags；經過濾掉低質量或短長度tags后,分別獲得898 836、930 230、905 957、1 024 355條有效序列。隨著測序數量的增加，各個樣品中所包含的序列均被檢測到，表明各樣品測序深度范圍大，文庫覆蓋率高，數據合格且可靠。

2.2 物種注釋及OUTs分布Venn圖

圈和圈重疊部數目代表樣本間共有的ASV數目，沒有重疊的部分代表每個組特有的ASV數目。綠色代表膽木葉樣品；黃色代表膽木皮樣品；藍色代表膽木根樣品；紅色代表膽木莖樣品。

通過物種注釋可得到膽木根莖皮葉中共有內生細菌30門、82綱、183目、326科、764屬，具有豐富的菌群多樣性。通過Venn圖（圖1）直觀地呈現各分組共有和特有的ASV數目。結果顯示：膽木根、莖、皮、葉共有的OTUs個數為144，其中根樣品中特有的OTUs個數為418，莖樣品中特有的OTUs個數為810，皮樣品中特有的OTUs個數為506，葉樣品中特有的OTUs個數為931。說明膽木葉中特異性最高，群落結構最為復雜，根中OTUs特異性最低，群落結構較單一。其順序為：葉>莖>皮>根。由此可知，不同生長環(huán)境條件下，膽木各組織內生細菌基于不同分類水平均存在數量上的差異。

圖1 膽木內生細菌物種（OTUs）組成的Venn圖

2.3 Alpha多樣性分析

如圖2，Chao1（圖2-a）指數用來估計物種的總數。物種總數順序為：葉>莖>皮>根。Coverage（圖2-b）指微生物覆蓋率。膽木根、莖、皮、葉的coverage指數均為1，表明測序深度已經覆蓋到樣本中的所有物種。Shannon（圖2-c）微生物多樣性的指數值與群落多樣性呈正相關。膽木內生細菌Shannon多樣性指數最高的是莖，其次是葉；最低是根。其多樣性為莖>葉、皮>根。這表明膽木莖中內生細菌群落多樣性豐富，不確定性大，根中內生細菌群落多樣性相對較低。

藍色.根；黃色.莖；紅色.葉；紫色.皮。

2.4 膽木內生細菌群落組成分析

基于物種注釋統(tǒng)計表，將通過門和屬水平的聚類圖對物種豐度進行展示分析，見圖3。從門的分類水平看。膽木根莖皮葉中共有優(yōu)勢菌門主要由變形桿菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、（Campylobacterota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、綠彎菌門（Chloroflexi）和芽單孢桿菌門（Gemmatimonadota）等組成，其平均相對豐度分別為42.18%、25.19%、24.83%、4.15%、3.09%、0.20%、0.12%、0.05%和0.02%。膽木根、莖和葉3個不同組織中，出現了大量變形桿菌門（Proteobacteria）。菌群豐度分別達到45.40%、42.90%、44.95%，但同時期皮部的豐度較低（35.85%）；皮、莖和葉發(fā)現少量的綠彎菌門（Chloroflexi），豐度為0.02%～0.10%，在根中并未發(fā)現；莖和葉中還發(fā)現了微量芽單孢桿菌門（Gemmatimonadota），豐度為0.01%～0.04%，但在根和皮中均未發(fā)現。

從屬水平分類上看，所有樣本共有18個屬的平均相對豐度大于1.0%，分別是、芽孢桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、羅爾斯通菌屬（）、馬賽菌屬（）、（）、賴氨酸芽胞桿菌屬（）、假單胞菌屬（）、短小桿菌屬（）、類芽孢桿菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、腸桿菌屬（）、固氮根瘤菌（）、羅氏甲基桿菌（）、黏液桿菌屬（）、根瘤菌屬（）、泛菌屬（）及克雷伯氏菌屬（）。其中平均豐度最高的屬為（25.11%），其次是芽孢桿菌屬（15.16%）、伯克霍爾德氏菌屬（7.06%）、羅爾斯通菌屬（5.03%）、馬賽菌屬（4.60%）。

圖中展示相對豐度前30的門類群。

由圖4可知，在膽木莖、皮和葉3個不同組織中，出現了大量。菌群豐度分別達到31.84%、26.89%、31.77%，但同時期根部的豐度較低（9.94%）；在根中存在比其他組織具有較高占比的菌群芽孢桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、固氮根瘤菌（）、根瘤菌屬（）。莖、皮和葉中還發(fā)現少量短小桿菌屬（）（豐度為0.42%～8.30%），而根中沒有。

圖中展示相對豐度前30的屬進行排序。

2.5 功能預測分析

PICRUSt是基于比對微生物群落的豐富度與數據庫，從而在不可觀測的情況下推測出生物群落的功能信息?；诟咄繙y序技術和KEGG數據庫比對，發(fā)現膽木不同組織內生細菌在一級功能層共包含6類生物代謝通路（表2），即：遺傳信息處理、細胞過程、生物體系統(tǒng)、環(huán)境信息處理、人體疾病、新陳代謝。其中，根在環(huán)境信息處理通路的豐度最高，葉在遺傳信息處理、細胞過程、生物體系統(tǒng)、人類疾病、新陳代謝5個通路中豐度均高，皮在參與調控各種代謝通路的豐度均較低。

同時，針對膽木不同組織的內生細菌基因二級功能層進行預測分析。結果發(fā)現，其內生細菌基因二級功能層由36個子功能組成（圖5）。其中，代謝過程相關的基因數最多，占總基因數的33.3%。主要包括多糖合成與代謝、碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝、脂質代謝、氨基酸代謝等代謝過程；其次為生物體系統(tǒng)過程，占總基因數的20.5%，主要涉及消化系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等過程；人類疾病過程占總基因數的12.8%，主要涉及免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病、代謝性疾病等過程。

表2 膽木不同組織內生細菌KEGG（Leve1）功能豐度分析

3 結論

目前，關于膽木微生態(tài)結構的報道，僅有陳燕艷等[10]對于膽木根際的細菌群落結構和多樣性的研究，其根際土壤細菌共有優(yōu)勢菌門芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planc-tomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria），與本研究結果相似，但豐度均有不同；而優(yōu)勢菌屬中，僅有芽孢桿菌屬（）與本研究結果相似，且豐度差異大。其結果說明，雖為同種植物，但由于分離部位的不同及采集環(huán)境差異的影響導致膽木微生態(tài)菌群結構基于在不同分類水平上均存在菌群種類及豐度上的差別。

Alpha多樣性分析顯示，膽木莖中表示細菌群落豐度和多樣性的相關指數均高于膽木根、葉、皮內生細菌群落對應的相關指數，這可能是由于莖暴露于物理化學條件如溫度、濕度、紫外線照射等劇烈變化的環(huán)境中，而且莖中含有淀粉、糖和木質部的其他植物營養(yǎng)物質，這個營養(yǎng)豐富的生態(tài)系統(tǒng)有利于豐富細菌的種類[11]，因此莖中的內生細菌多樣性較高。

群落組成分析中，4種不同組織中均有相同的內生細菌定殖，但分布存在一定的組織差異性，并發(fā)現了膽木不同組織中的主要門類、核心屬類和一些低豐度的微生物種群。這表明在膽木不同部位發(fā)現的許多分類群可能有著相似的來源。變形桿菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）為膽木根莖葉皮中共有的優(yōu)勢菌門。有研究已證實，變形菌門有助于藥用植物產量及有效物質含量的提高[12-13]，且在促進植物生長，防治病害方面發(fā)揮重要作用。變形菌門是常見的植物內生細菌門[14]，表明膽木內生細菌具有一般植物內生細菌的特點。厚壁菌門可以保護其宿主免受疾病、促進生長、在其他植物上定植[15]，且在生態(tài)中也起著重要作用。魏玉倩等[16]從植物蘇鐵中證實，藍細菌門將空氣中的氮氣（N2）轉化成無機氮，為蘇鐵的生長提供氮源，光能和化能自養(yǎng)藍細菌具有產生吲哚乙酸促進植物生長發(fā)育的能力。

在屬水平上，含量最高的為未分類細菌Chloroplast_unclassified，這說明膽木中還蘊含大量未知微生物種類，有關膽木內生細菌在屬水平上的探究還不夠深入，需要采用其他分析手段進一步鑒定確認。此外，分類學地位明確的豐度前10的菌屬主要是芽孢桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、羅爾斯通菌屬（）、馬賽菌屬（）、賴氨酸芽胞桿菌屬（）、假單胞菌屬（s）、短小桿菌屬（）、類芽孢桿菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、腸桿菌屬（），這些在土壤改良[17]、合成次級代謝產物和酶[18-19]、固氮解磷促生[20-23]、抗植物病蟲害等方面[24-25]起到關鍵作用。值得一提的是，在根中存在比其他組織更高占比的菌群，芽孢桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、固氮根瘤菌（、根瘤菌屬（），這些均被證實有固氮、促氮作用，能促進植物次生代謝的積累[26-29]，后續(xù)可依據其優(yōu)勢菌群功能進行深入研究分析，為解決膽木病變及有效物質分子形成機制提供理論支持。

內生菌的生物學功能跟其所擁有的功能基因密切相關。本研究采用PIRCUSt對膽木內生細菌進行功能預測發(fā)現，膽木不同組織的內生細菌含大量關于碳水化合物、脂質、糖類、氨基酸，輔酶及代謝產物合成的基因信息。一方面，碳水化合物是植物生長的基本營養(yǎng)物質，影響植物的品質[30-31]，VC是植物代謝過程不可或缺的產物，參與調控細胞分裂、體內活性氧清除和細胞生長等多種生理過程[32-34]；另一方面，這些代謝過程說明膽木內生細菌可能參與代謝膽木根、莖、葉和表皮中各種營養(yǎng)物質，為膽木植株生長發(fā)育提供重要的激素、營養(yǎng)等，且氨基酸是蛋白質合成的基礎，環(huán)境脅迫下植物體內的游離氨基酸代謝可以對植物的抗逆性起到指示作用[35]。此外，還預測到多糖類化合物和次生代謝產物合成相關的基因，說明膽木內生細菌有合成藥用活性物質的潛力。該研究可為從膽木根、莖、葉和表皮分離出生產有效藥用成分的植物內生細菌提供理論基礎。

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Study on Diversity of Endophytic Bacteria Community Structure and Prediction of Gene Function in Medicinalof Li nationality

BU Xuanyin1,2YANG Weili1

(1. Hainan Medical University, Haikou, Hainan 571199, China; 2. Sanming Medical and Polytechnic Vocational College, Sanming, Fujian 365000, China)

The high-throughput 16S rRNA sequencing technology was used to analyze the community diversity of endophytic bacteria in the root, stem, leaf, and epidermis ofcollected from five regions in Hainan Province, and the potential function of endophytic bacteria was analyzed by PICRUSt. The results showed that 3 759 378 effective sequences were obtained from the high-quality sequence fragments in the 16S rRNA V3-V4 region, divided into 3 475 OUTs. Endophytic bacteria were divided into 30 phyla, 82 classes, 183 orders, 326 families, and 764 genera, with rich flora diversity and significant differences among groups. The community structure of endophytic bacteria was analyzed, and the common dominant bacterial genera were(25.11%),(15.16%),(7.06%),(5.03%), and(4.60%). The root-dominant bacteria were,,,and. The dominant stem fungi were,,and. The dominant genus of leaf bacteria was. The dominant genera of Skin wereand. PICRUSt analysis showed that the endophytic bacteria in different tissues ofwere mainly involved in six biological metabolic pathways and 36 subfunctions. The gene species predicted by the secondary functional layer of endophytic bacteria genes from different tissues are unchanged, but the gene abundance is significantly different, and metabolism is a vital factor affecting the diversity and abundance of endophytic bacteria in. Revealing the changing trends and laws of the various endophytic bacteria in different tissues ofcan lay a theoretical foundation for the further application of its endophytic bacteria and fully exploit its rich microbial resources.

; endophytic bacteria; community structure; diversity; gene function

S567

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2023.09.010

2023-02-06；

2023-02-20

海南省自然科學基金資助項目（No.820RC624）。

卜宣尹（1995—），女，碩士研究生，研究方向為植物內生菌研究，E-mail：1183231729@qq.com。

楊衛(wèi)麗（1979—），女，碩士，教授，主要研究方向為中藥資源研究，E-mail：731338097@qq.com。

（責任編輯 龍婭麗）