中波紫外線通過抑制Hippo 通路促進(jìn)AKT 磷酸化致日光性角化病發(fā)病機(jī)制研究

雷皓雪，鐘雨環(huán)，李紅賓，楊智，楊正慧

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，云南 昆明 650000）

日光性角化病（actinic keratosis，AK）與患處長期反復(fù)日光暴露有關(guān)，是云南地區(qū)常見的皮膚癌前病變，皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）可能與患處長期反復(fù)日光暴露有關(guān)。以往研究認(rèn)為，PI3K/Akt /mTOR 通路參與并誘發(fā)AK及cSCC［1-2］。YAP 是Hippo 通路的核心效應(yīng)因子，抑制Hippo 通路可活化YAP，而YAP 通過活化AKT通路發(fā)揮促進(jìn)cSCC 生長及惡性生物學(xué)行為的癌基因作用［3］。因此本實(shí)驗(yàn)通過UVB 照射HaCaT 細(xì)胞、A431 細(xì)胞，抑制YAP 表達(dá)，觀察Hippo 通路、AKT通路的變化，闡述UVB 對AK 發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而明確UVB 照射對AK 的影響。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 本研究選取2019 年3 月至2022 年3 月就診于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)病理學(xué)確診為AK（AK 組）患者9 例和cSCC（cSCC 組）患者10 例。參加研究的所有患者及其家屬均知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：組織病理HE 檢查確診AK 及cSCC 診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：有心血管疾病、糖尿病、腎功能不全等基礎(chǔ)疾病者；合并其他皮膚腫瘤患者；有腫瘤、免疫抑制性疾病患者；有家族遺傳性疾病患者。

1.3 主要試劑和儀器 TaKaRa Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（D6210A） 試 劑 盒；TaKaRa SYBRPremix Ex TaqTMII（Perfect Real Time）試劑盒。細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清（Hyclone，Cat. No. SH30087.01）；DMEM-高糖培養(yǎng)基（Hyclone，Cat. No. SH30022.01B）；MEM α（Gibco，Cat.No. 12571063 ）； 青 鏈 霉 素（Hyclone，Cat. No.SH30010）；PBS 磷 酸 鉀 緩 沖 液（Gibco，Cat. No.10010023）；Trypsin-EDTA（0.25%）phenol red（Gibco，Cat. No. 25200056）。蘇州安泰潔凈工作臺（SW-CJIFD）；低速離心機(jī)（中佳，SC3614）；倒置光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司）；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 公司）；倒置熒光顯微鏡（Leica 公司）。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化染色法 石蠟包埋組織，將皮膚組織制作成3~5μm 厚的組織切片，將組織切片在60℃烤箱烤片30~60min，后將組織切片脫蠟水化，將組織切片置于盛滿檸檬酸（pH 6.0）抗原修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，在血清封閉后，于切片上分別滴加一抗YAP、AKT 抗體室溫孵育3h。在二抗山羊抗兔抗體室溫孵育50min，以DAB 顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，后封片、鏡檢，以Image J 檢測切片吸光度，并用Graph pad 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析制圖。

1.4.2 UVB 照射 將細(xì)胞以適當(dāng)濃度（1×105-6/孔）接種至6 孔板中，37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁，密度70%～75%。用移液槍將培養(yǎng)液吸出，加入PBS 洗滌3 次后，每孔加入500μL PBS 覆蓋細(xì)胞，防止細(xì)胞干燥。每孔分別用不同能量照射，照射能量=單位照射能量×?xí)r間，根據(jù)能量計(jì)算照射時(shí)間。1孔予相同處理，不照射UVB 作為空白對照。

1.4.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天對細(xì)胞株進(jìn)行傳代，使其匯合度為30%～50%，siRNA 工作濃度為50nM，使 用24 孔 板，吸 取siRNA 母 液（20μM）1.25μL溶解 到100μL Opti-MEM 培 養(yǎng) 基 為A 液，取1μL LipofectamineTMRNAiMAX 溶解于Opti-MEM 培養(yǎng)基為B液，B 液混合5min 后，A 液和B 液混合，靜置20min后加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育4h 后換為細(xì)胞生長培養(yǎng)基。細(xì)胞共分為3 組：Cell 組（不加任何處理），NC 組（加入空白siRNA），YAPsiRNA 組（加入YAPsiRNA ）。

通過PCR 試驗(yàn)方法對6 組細(xì)胞的YAPmRNA 表達(dá)水平進(jìn)行檢測，通過Western blot 方法、細(xì)胞免疫熒光法檢測細(xì)胞中的YAP 表達(dá)。

1.4.4 RT-PCR 檢測 用Trizol 法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，PCR 擴(kuò)增yap 基因片段，分別為：YAP-F，5’TGTCTTACACCGTGCTGCCA 3’，YAP-R：5’AGGTCAGTACAGAGGGCATCGT 3’；18S-F：5’CCTGGATACCGCAGCTAGGA 3’，18S-R：5’GCGGCGCAATACGAATGCCCC 3’。內(nèi)參片段：18S-112bp。反應(yīng)條件：94℃變性 4 min；94℃變性 30 s、60℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)； 最后一次循環(huán)后 72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物凝膠成像，電泳圖像采用Dec 2000 凝膠成像系統(tǒng)（ Bio-Rad 公司）分析。

1.4.5 QRT-PCR 檢測 反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 進(jìn)行 QRTPCR。反應(yīng)體系為20μL：SYBRPremix Ex TaqTM（2×）10 μL，PCR Forward Primer（10μM）0.8μL，PCR Reverse Primer（10μM）0.8μL，cDNA 模 板2μL，dH2O 6.4μL。反應(yīng)參數(shù)按TaKaRa SYBRPremix Ex TaqTMII（Perfect real time）試劑盒說明進(jìn)行，置于Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀擴(kuò)增，運(yùn)用Bio-Rad CFX Manager Software1.6 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，且采用2^-（ΔΔCt）法來計(jì)算。

1.4.6 蛋白免疫印跡法 裂解細(xì)胞，收集裂解液并離心收集到上清液。用BCA 法測量蛋白濃度，行SDSPAGE 電泳分離，結(jié)束后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1h。1 ∶1000 稀釋的一抗4℃孵育過夜，TBST 溶液洗膜3 次后加入 1 ∶1000 稀釋的二抗37℃孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次，發(fā)光液發(fā)光，顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，用Image Pro 分析軟件分析條帶積分光密度值。

1.4.7 細(xì)胞免疫熒光 PBS 洗去培養(yǎng)液的細(xì)胞4%多聚甲醛固定30min； PBS 洗 3 次，每次5min，0.2%Triton X-100 透化細(xì)胞膜 5 min，PBS 洗 3 次，每次5min，10%正常山羊血清封閉30min，一抗4℃孵育過夜，PBS 洗3 次，每次5min。熒光標(biāo)記二抗（1：200）室溫濕盒避光孵育1 小時(shí)，PBS 洗3 次，每次5min；DAPI 室溫濕盒避光孵育5min；PBS 洗1 次，5min，水洗2 次，每次5min；熒光抗淬滅劑封片，顯微鏡下觀察和圖像采集。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 27.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用兩兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對AK 組和cSCC 組AKT 及YAP 的表達(dá)量進(jìn)行差異性分析，采用單因素方差分析，對不同細(xì)胞組（臨床參數(shù)的分類在3 類以上）中不同蛋白表達(dá)量進(jìn)行差異性分析，后用圖基檢驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行多重比較。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 AK 組9 例，cSCC 組10 例。AKT在AK 表皮的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間隙中均呈陽性表達(dá)，基底層較為明顯。AKT 在cSCC 表皮全層及突破基底層的表皮的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間隙中均有陽性表達(dá)，且AKT在cSCC 中表達(dá)量明顯高于AK（P＜0.05）。YAP 在AK、cSCC 表皮的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均呈陽性表達(dá)，在基底層中最為明顯，在cSCC 突破基底層的表皮中也更為明顯，見圖3。YAP 在cSCC 中表達(dá)量明顯高于AK（P＜0.01）。在AK 及cSCC 表皮中，YAP 表達(dá)量與AKT 在AK、cSCC 中均呈正相關(guān)（rAK2=0.6858，rAK=0.8297，PAK＜0.01，rcSCC2=0.3398，rcSCC=0.6661，PcSCC＜0.05），見圖1、圖2。

圖1 免疫組化檢測AkT、YAP 在cSCC 中的表達(dá)

圖2 免疫組化檢測在AK 及cSCC 中YAP 與AKT 的相關(guān)性

圖3 免疫組化檢測AKT、YAP 在AK、cSCC 中的表達(dá)

2.2 UVB 照射促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞中YAP 表達(dá) 相同照射時(shí)間，HaCaT 細(xì)胞中YAP 的表達(dá)隨光照劑量增加（P＜0.01）。相同照射時(shí)間，隨光照劑量增加，HaCaT細(xì)胞中YAP 磷酸化受抑制增強(qiáng)（P＜0.01），見圖4。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染降低HaCaT 細(xì)胞、A431 細(xì)胞yap 基因相對表達(dá)、YAP 表達(dá)量 Cell 組為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞，NC 組為轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的細(xì)胞，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染使HaCaT 細(xì)胞、A431 細(xì)胞中YAP siRNA 組yap 基因、YAP 表達(dá)量較cell 組、NC 組均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHaCaT＜0.01，PA431＜0.01）。通過細(xì)胞免疫熒光法觀察到細(xì)胞轉(zhuǎn)染使HaCaT 細(xì)胞、A431 細(xì)胞中YAP 表達(dá)量較cell 組、NC 組均明顯降低，見圖5、圖6。

圖6 細(xì)胞免疫熒光法檢測HaCaT 細(xì)胞、A431 細(xì)胞各3 個(gè)組的結(jié)果

2.4 UVB 照射抑制A431 細(xì)胞中Hippo 通路 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染抑制A431 細(xì)胞中YAP 表達(dá)后，UVB 照射可抑制A431 細(xì)胞中Hippo 通路。UVB 照射抑制HaCaT細(xì)胞中Hippo 通路。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染抑制HaCaT 細(xì)胞中YAP 表達(dá)后，UVB 照射可抑制HaCaT 細(xì)胞中抑制Hippo 通路。UVB 照射促進(jìn)A431 細(xì)胞中AKT 磷酸化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法抑制A431 細(xì)胞中YAP 的表達(dá)后，AKT 磷酸化被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），再次照射UVB后，AKT磷化被抑制的情況有所緩解（P＜0.01）。UVB 照射促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞中AKT 磷酸化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法抑制HaCaT 細(xì)胞中YAP 的表達(dá)后，AKT 磷酸化被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），再次照射UVB 后，AKT 磷化被抑制的情況有所緩解（P＜0.01），見圖7、圖8。

圖7 UVB 照射對A431 細(xì)胞中Hippo 通路、AkT 通路的影響

圖8 UVB照射對HaCaT細(xì)胞中Hippo通路、AkT通路的影響

3 討論

AK 是cSCC 的癌前期皮膚損害，然而AK 轉(zhuǎn)化為cSCC 的發(fā)病機(jī)制仍不明確，目前普遍認(rèn)為與紫外線長期照射導(dǎo)致DNA損傷、基因突變、信號通路變化、氧化應(yīng)激等有關(guān)［4-5］。

YAP 是Hippo 信號通路的轉(zhuǎn)錄共激活因子，當(dāng)Hippo 通路活化時(shí)，MST1/2 與接頭蛋白（Salvador，Sav）、RAS 相關(guān)域家族（RASSF）蛋白相結(jié)合，磷酸化激活LASTS1/2，而LASTS1/2 與MOB1 結(jié)合磷酸化YAP，而使YAP 潴留于細(xì)胞質(zhì)并降解失活［6］；相反去磷酸化的YAP 可轉(zhuǎn)入并累積在核內(nèi)，YAP 的N 端與TEAD 家族（TEA domain family）結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)基因。在皮膚鱗癌（cSCC）中表達(dá)量明顯高于光線性角化病（AK），YAP 在AK 中表達(dá)量明顯高于正常皮膚［10］，過表達(dá)的YAP 參與AK 和cSCC 的發(fā)生、發(fā)展。YAP 可能通過促進(jìn)皮膚鱗癌細(xì)胞在G1/S 期增殖并抑制癌凋亡以增強(qiáng)其遷移、侵襲能力，YAP 在轉(zhuǎn)錄過程中可通過誘導(dǎo)AREG 的表達(dá)活化EGFR/RAS 信號通路，進(jìn)而活化其下游的P13K/AKT 通路及ERK 通路［3］。

YAP 在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織及口腔鱗狀癌細(xì)胞中過表達(dá)，且表達(dá)量與口腔鱗狀細(xì)胞癌的惡性程度及癌細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)［7］。過表達(dá)YAP 基因可以通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。

激活皮膚鱗癌細(xì)胞A431 內(nèi)PI3K-AKT 通路，可促進(jìn)其增殖，這可能是皮膚鱗癌的發(fā)病機(jī)制［11］。在轉(zhuǎn)移性鱗癌的治療中，同時(shí)使用Akt 抑制劑和自噬抑制劑能增加化療敏感性［8］。

紫外線作用于EGFR 引起 PI3K/Akt/mTOR 信號通路過度激活，激活程度cSCC 高于AK 高于正常皮膚［9］。成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor ，F(xiàn)GFR）通過活化mTOR 在UVB 照射引起cSCC 中發(fā)揮作用［9］。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測提示cSCC 中YAP 和AKT 表達(dá)量均高于AK，與既往的研究［9-10］相符，且AKT 表達(dá)量與YAP 正相關(guān)。進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在HaCaT 細(xì)胞和A431 細(xì)胞中，UVB 照射促進(jìn)YAP 表達(dá)，抑制YAP 磷酸化，且表達(dá)水平、磷酸化水平與光照劑量正相關(guān)，提示UVB 照射活化YAP信號通路。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法敲減HaCaT 細(xì)胞和A431 細(xì)胞中YAP 表達(dá)水平，觀察到AKT 磷酸化受抑制，而UVB 照射可抑制Hippo 通路進(jìn)而活化YAP并促進(jìn)AKT 磷酸化。因此我們推測，UVB 照射通過抑制Hippo 通路促進(jìn)YAP 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)AKT 磷酸化，提示這可能是AK 和cSCC 的發(fā)生機(jī)制。本研究也存在一定局限性，本研究樣本量小，可能存在一定程度的偏倚，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大及完善樣本量加以驗(yàn)證；本實(shí)驗(yàn)沒有對cSCC 進(jìn)行免疫組化檢測，僅觀察了Hippo 通路、AKT 磷酸化的變化，未能進(jìn)一步研究其對細(xì)胞功能的具體影響。