高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚

姜志遠(yuǎn) 馬可佳 王緣 王曉婧 趙嵐

摘 要：目的：建立同時(shí)測(cè)定小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚含量的方法，以此提高非食品原料的檢測(cè)效率。方法：采用乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）提取樣品中的乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚這3種化合物，40 ℃水浴下氮吹至近干，使用50%乙腈溶液復(fù)溶后過(guò)濾檢測(cè)。以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，通過(guò)高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚在0.50～10.00 μg·mL-1，線性關(guān)系良好（r≥0.999），檢出限分別為0.006 μg·kg-1、0.005 μg·kg-1、0.003 μg·kg-1。以空白樣品為基體，在1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1、4.0 mg·kg-1這3個(gè)濃度下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率均為97.2%～99.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤1.79%（n=6）。結(jié)論：該方法成功用于市售48種小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的含量測(cè)定，可為小麥粉中非食品原料的日常檢測(cè)提供參考。

關(guān)鍵詞：小麥粉；乙二胺四乙酸二鈉；曲酸；間苯二酚；高效液相色譜法

Simultaneous Determination of Disodium Ethylenediaminetetraacetic Acid， Kojic Acid， and Resorcinol in Wheat Flour by HPLC

JIANG Zhiyuan， MA Kejia， WANG Yuan， WANG Xiaojing， ZHAO Lan

（Heilongjiang Provincial Center for Disease Control and Prevention， Harbin 150030， China）

Abstract： Objective： To establish a method for simultaneous determination of disodium EDTA， kojic acid and resorcinol in wheat flour， so as to improve the detection efficiency of non-food raw materials. Method： Acetonitrile-methanol-aqueous solution （5∶4∶1） was used to extract disodium ethylenediamine tetraacetate， kojic acid and resorcinol from the samples. Nitrogen was blown to near-dry in a water bath at 40 ℃， and then filtered by 50% acetonitrile solution. Using acetonitrile-0.1% formic acid solution as mobile phase， the method was determined by high performance liquid chromatography. Result： The linear relationship between disodium-EDTA， kojic acid and resorcinol was good （r≥0.999） in 0.50～10.00 μg·mL-1， and the detection limits were 0.006 μg·kg-1， 0.005 μg·kg-1 and 0.003 μg·kg-1， respectively. Using blank samples as matrix， the standard recovery experiments were carried out at the concentrations of 1.0 mg·kg-1， 2.0 mg·kg-1 and 4.0 mg·kg-1. The average recoveries were 97.2%～99.7%， and the relative standard deviations were less than 1.79%（n=6）. Conclusion： The method was successfully used for the determination of disodium EDTA， kojic acid and resorcinol in 48 kinds of wheat flour， which can provide reference for the daily detection of non-food raw materials in wheat flour.

Keywords： wheat flour; disodium ethylenediamine tetraacetic acid; kojic acid; resorcinol; high performance liquid chromatography

小麥粉中含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪及膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，是北方居民餐桌上重要的主食來(lái)源，因此市售小麥粉的品質(zhì)受到食品監(jiān)管部門(mén)的高度重視。但有些不法商販通過(guò)向劣質(zhì)小麥粉中添加防腐劑、抗生素和增白劑等非食品原料，掩蓋小麥粉質(zhì)量低劣的事實(shí)，使市售小麥粉的感官性狀達(dá)到出廠標(biāo)準(zhǔn)，這種行為存在很大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重危害了廣大消費(fèi)者的身體健康。在這些添加劑中，乙二胺四乙酸二鈉屬于超范圍使用的食品添加劑[1-2]，曲酸、間苯二酚是國(guó)家食藥總局明令禁止使用的化學(xué)成分[3-4]。市售小麥粉中是否添加乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚等非法添加劑，是評(píng)價(jià)小麥粉安全性的主要依據(jù)，因此研究市售小麥粉中多種非食品原料檢測(cè)方法非常重要。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)對(duì)市售小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚這3種化合物進(jìn)行檢測(cè)分析，探索同時(shí)測(cè)定小麥粉中多種非法添加劑的方法，為小麥粉的安全性評(píng)價(jià)及質(zhì)量監(jiān)督提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉樣品48批次，購(gòu)自哈爾濱市、齊齊哈爾市、綏化市等地的糧油市場(chǎng)。

乙二胺四乙酸二鈉（含量：99.0%；批號(hào)：20200701），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；曲酸（含量：100.0%；批號(hào)：CCFD200382），德國(guó)卡特化工有限公司；間苯二酚（含量：99.9%；批號(hào)：21071189），壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），美國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純），DIKMA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695型高效液相色譜儀；Watere 2489型檢測(cè)器；GP324S電子天平，Sartorius公司；DC24H氮吹儀，安譜科學(xué)儀器公司；KQ500VDE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器；3K15型高速冷凍離心機(jī)，SIGMA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取乙二胺四乙酸二鈉、曲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，分別用30%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；稱取間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用80%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用50%乙腈溶液稀釋成濃度為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取市售小麥粉樣品5.0 g，置于聚丙烯離心管中，加入乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）10 mL，振搖混勻后，渦旋混勻10 min，超聲處理15 min，8 000 r·min-1離心10 min，獲取上清液并置于另一離心管中；再次加入乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）10 mL，重復(fù)提取一次，合并兩次小麥粉提取液。移取10 mL提取液，置于帶刻度的離心管中，在40 ℃水浴下氮吹至近干，使用50%乙腈溶液復(fù)溶以后，定容至2 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)樣檢測(cè)[5-9]。

1.3.3 色譜條件

DiamonsiL-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積：20 μL；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.3.4 樣品測(cè)定

小麥粉樣品經(jīng)過(guò)前處理后，注入液相色譜分析并計(jì)算乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立3種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品峰面積代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算小麥粉樣品溶液中的化合物含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

參考文獻(xiàn)[10-12]中的色譜條件，改變流動(dòng)相中乙腈、0.1%甲酸溶液的比例，研究了不同梯度下乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的理論塔板數(shù)和分離度，結(jié)合3種化合物的保留時(shí)間，確定了最佳流動(dòng)相比例。在這種流動(dòng)相條件下，3種化合物的理論塔板數(shù)均不小于5 000，各個(gè)色譜峰的分離度均不小于1.5，具體結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的紫外吸收峰值不同。間苯二酚和曲酸的最大吸收波長(zhǎng)在260～280 nm，乙二胺四乙酸二鈉的最大吸收波長(zhǎng)在250～280 nm，為兼顧各個(gè)成分的靈敏度，并能實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定的目的，選擇275 nm作為3種化合物共有的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 提取溶劑的選擇

根據(jù)3種化合物的溶解性和相關(guān)文獻(xiàn)資料的報(bào)道，選擇常用試劑甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、50%乙腈、乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）作為提取溶劑進(jìn)行比較。結(jié)果表明，選擇甲醇、乙醇提取小麥粉樣品，乙二胺四乙酸二鈉的回收率低于70%；選擇50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈提取小麥粉樣品，進(jìn)樣后獲得的色譜圖中干擾峰較多，專屬性不強(qiáng)；選擇乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）提取小麥粉樣品，離心后上清液清澈透明，色譜圖中沒(méi)有干擾峰，3種化合物均能獲得良好的回收率，可以滿足定量檢測(cè)要求。

2.4 線性范圍分析

準(zhǔn)確移取3種化合物的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液各20 mL，按照由低到高的濃度依次進(jìn)樣檢測(cè)，將峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，將濃度（X）作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3種化合物在0.50～10.00 μg·mL-1時(shí)，線性關(guān)系良好（表2）。

2.5 最低檢出限

在“1.3.3”的色譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)混合使用液用50%乙腈溶液逐級(jí)稀釋進(jìn)樣，以3倍信噪比估算乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的最低檢出限。由表2可知，乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚這3種化合物的檢出限分別為0.006 μg·kg-1、0.005 μg·kg-1、0.003 μg·kg-1，方法的檢出限滿足質(zhì)量分析的要求。

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

為了確定檢測(cè)方法的回收率，選擇清洗后干燥麥粒經(jīng)粉碎獲得的小麥粉作為加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的空白基質(zhì)。分別移取“1.3.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依次加入5.0 g空白基質(zhì)中，按“1.3.2”方法制備濃度為1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1、4.0 mg·kg-1的加標(biāo)樣品溶液，每個(gè)濃度水平設(shè)置6個(gè)平行樣。如表3所示，小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3種化合物的平均回收率在97.2%～99.7%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.06%～1.79%，說(shuō)明回收率良好。

2.7 市售樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)市售48種小麥粉中的乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3種化合物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果未檢出這3種化合物，說(shuō)明檢測(cè)的小麥粉中不存在乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3種非食品原料的問(wèn)題。本方法可用于小麥粉樣品的快速定量檢測(cè)。

3 結(jié)論

本文建立的高效液相色譜方法可以實(shí)現(xiàn)乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3種化合物的有效分離，靈敏度高，線性關(guān)系良好，回收率高，且成功應(yīng)用于市售48種小麥粉中3種化合物的分離測(cè)定。

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