PEG-6000模擬干旱脅迫和溫度對巖柿種子發(fā)芽的影響

羅孔, 張春華, 歐朝蓉, 阮長明, 孫永玉*, 王猛*

1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 云南 昆明 650233；

2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所, 云南 昆明 650233；

3. 云南元謀干熱河谷生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站, 云南 昆明 650233

干旱作為植物逆境脅迫影響眾多環(huán)境因子中的最普遍、最主要形式，是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素[1]。種子萌發(fā)對干旱脅迫的響應(yīng)機理如避旱或適旱萌發(fā)，從側(cè)面反映了其適應(yīng)某一類環(huán)境的生態(tài)機制。用PEG-6 000溶液滲透方法探討植物種子對干旱脅迫萌發(fā)特性的響應(yīng)，具有簡單易行、周期短、重復(fù)性好等特點，近年來被廣泛地用于植物種子萌發(fā)期的耐旱性研究[2-5]。巖柿（Diospyros dumetorum）是柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros)常綠小喬木，又名烏木果（文山），烏木（麗江、寧蒗、祿勸），烏木樹（武定），紫藿香、澀藿香（玉溪）廣泛分布于金沙江、元江、怒江流域等干旱少雨、土壤貧瘠的干熱河谷區(qū)域[6-7]。巖柿受樵采等人為因素影響矮化，因其發(fā)達根系具較強的萌生和根孽作用而廣泛分布，為區(qū)域植被再生重建保存了有限的繁殖體[8-9]。巖柿，葉和果實可入藥食用，如新鮮或干燥葉，可用于治＂咳嗽吐血、止渴生津＂，具有藥用價值[10]。關(guān)于巖柿育種育苗方面，目前還未見其報道。本試驗從種子萌發(fā)條件、萌發(fā)情況入手，探討其種子萌發(fā)期對抗旱能力及環(huán)境溫度對種子萌發(fā)的影響，為其種苗規(guī)?；a(chǎn)及在干熱河谷生態(tài)恢復(fù)和重建過程中應(yīng)用的可能性提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用巖柿果實2021年12月采自于云南省大理州永勝縣熱河鄉(xiāng)的野生植株，母樹生長健壯、長勢良好，種子剝離后用水選法去除空粒和夾雜物，經(jīng)表面陰干，選取飽滿、大小均勻的種子4℃低溫保存[11]。測定種子大小、重量及活力[11]，種子千粒重測定采用百粒法（167.49±0.34 g）；用游標(biāo)卡尺測量120粒種子的長軸和短軸，平均值分別為10.36±0.10 mm、6.06±0.05 mm；種子烘干后測得平均含水量為18.18±0.29 %；TTC法種子活力測定其平均活力為83.33±3.30 %。

1.2 方法

1.2.1 PEG-6 000模擬干旱脅迫種子萌發(fā)實驗

2022年1-3月在中國林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所國家林草局重點實驗室進行萌發(fā)實驗，首先進行消毒處理，用3 %的高錳酸鉀溶液浸泡巖柿種子30 min消毒，然后再用流水沖洗2小時[11]。參考陳釧等人[12-15]配置不同濃度(0%、5%、10%、15%、20%、25%)PEG-6 000溶液，對照CK為蒸餾水（0%），分別對應(yīng)不同的水勢（0 MPa、-0.58 MPa、-1.66 MPa、-3.256 MPa、-5.346 MPa、-7.490 MPa）[16-17]，以此來模擬干旱脅迫，6個處理每個處理3個重復(fù)，每重復(fù)30粒種子。試驗時將種子均勻鋪放在墊設(shè) 2 層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，溫度設(shè)置為0℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃[18～22]，光照條件為12 h光/12 h暗，光強為3 000 lx[12-15]，在光照恒溫箱中進行培養(yǎng)。每天稱量培養(yǎng)皿的質(zhì)量，并用蒸餾水補足其損失水量以保證PEG的滲透勢不變[13-16.25]。觀察并記錄種子萌發(fā)情況，將每處理中有1粒種子萌發(fā)作為該處理發(fā)芽的開始，統(tǒng)計種子的發(fā)芽數(shù)，連續(xù)7 d不再有種子發(fā)芽作為發(fā)芽的結(jié)束。

1.2.2 萌發(fā)指標(biāo)的測定

發(fā)芽率/GE (%)=x/X×100%[25-28]；

發(fā)芽勢/GR (%)=Y/X×100%[27-28]；

發(fā)芽指數(shù) GI = ∑( Gt /Dt )[27-28];

活力指數(shù) VI = GI × S[27];

抗旱指數(shù) PI= ( PIS ) / ( PIC )[29]。

式中:x表供試種子發(fā)芽的數(shù)量，X表示供試種子的數(shù)量；Y為發(fā)芽達最高峰時的發(fā)芽數(shù)量，Gt 表示在第 t d的發(fā)芽數(shù)；Dt 表示與 Gt 相對應(yīng)種子出芽經(jīng)歷時間；S 表示規(guī)定時間( 60 d) 內(nèi)單株幼苗的平均根長。PIS表示干旱脅迫下種子萌發(fā)指數(shù)，PIC表示對照種子萌發(fā)指數(shù)，式中PIS =1.00 nd2 + 0.75 nd4 +0.5 nd6 + 0.25 nd8 ( nd2、nd4、nd6、nd8分別是每個處理萌發(fā)開始后2、4、6、8 d的種子萌發(fā)率)

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016、SPSS22.0 等系統(tǒng)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析繪圖，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，多重比較采用 Duncan 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG模擬干旱脅迫和不同溫度處理對巖柿種子萌發(fā)特性的影響

由表1可知，10℃和25% PEG條件下所有處理都不萌發(fā)，隨著PEG濃度的增加，四種溫度處理下的發(fā)芽率都呈明顯的先升高后下降明顯。溫度過高和過低對發(fā)芽率均存在不同程度影響。15℃、20℃、25℃、30℃各干旱處理間發(fā)芽率平均值分別為20.74%、55.56%、82.89%、68.45%。其中，30℃和25℃的輕度干旱處理PEG濃度為5%時發(fā)芽率最大，88.89、94.44% ，其平均值為91.66%。15℃時0%、10% PEG脅迫處理下發(fā)芽率值相對較小，分別為22.22%、12.22%，其平均值為17.22%。PEG脅迫強度最大時，15℃、20℃、25℃、30℃相比處理前發(fā)芽率分別降低了10.00%、42.48%、25.56%、47.77%。15℃在0%、5% PEG濃度時，處理間差異不著，超過5%PEG處理發(fā)芽率顯著下降。20℃在0%～10%PEG處理時差異顯著，而在10% PEG濃度時，發(fā)芽率就已經(jīng)顯著下降。25℃在0 %、10%PEG處理時發(fā)芽率差異顯著，而5%PEG與其他處理存在顯著差異，發(fā)芽率最大，超過10%PEG處理發(fā)芽率顯著下降。30℃在0 %～5%PEG處理時發(fā)芽率差異不顯著，超過5%發(fā)芽率顯著下降。發(fā)芽率對溫度和PEG干旱脅迫的變化響應(yīng)較為明顯。

表1 PEG干旱脅迫和不同溫度處理對巖柿種子萌發(fā)特性的影響Tab. 1 Effects of PEG drought stress and different temperature treatments on seed germination characteristics of Diospyros dumetorum

由表1 可以看出，隨著PEG濃度的逐漸增大，四種溫度下的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、明顯的先升高后下降，PEG濃度為0%～10%時，四種溫度發(fā)芽勢下降趨勢皆較平緩，但當(dāng)PEG濃度增至15%時發(fā)芽勢明顯下降，尤其是15% PEG與20% PEG發(fā)芽勢迅速下降。說明PEG濃度＞10%時，對種子萌發(fā)造成的影響顯著增強。種子的發(fā)芽勢隨著PEG濃度的增加，下降較為明顯，且當(dāng)PEG濃度為10%時，種子的發(fā)芽勢顯著高于15% PEG和20% PEG。15℃下的整體發(fā)芽勢要低于20℃、25℃和30℃。排序:15% ＜25%＜ 20%＜ 30%。說明在PEG濃度干旱脅迫強度較大時，對四種溫度下的發(fā)芽勢影響都有著較大的影響。

當(dāng)溫度處理為15℃ 時PEG干旱脅迫對種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)影響總體較小，對20℃、25℃和30℃種子萌發(fā)影響較大。15℃、20℃、25℃和30℃種子發(fā)芽指數(shù)在5%～20% PEG濃度區(qū)間內(nèi)，發(fā)芽指數(shù)下降幅度較大。說明10%～20% PEG濃度區(qū)間內(nèi)，PEG干旱脅迫對種子的萌發(fā)具有明顯抑制作用。從PEG和溫度處理對巖柿種子的影響中可以看出，隨著PEG濃度的升高，四種溫度下的發(fā)芽指數(shù)均呈明顯的先升高后下降趨勢，種子在15℃、20℃、25℃、30℃時5% PEG的處理下發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)達到最大值，除在15℃超過10% PEG的處理下達到最小值為外，其余三種溫度在25% PEG濃度處理下發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)達到最小值。在PEG濃度為5%、10%、20%時，種間差異顯著，并發(fā)現(xiàn)在0%～20% PEG濃度時，溫度在25 ℃時組間內(nèi)的各發(fā)芽指數(shù)活力指數(shù)皆高溫度在20℃和30 ℃的發(fā)芽指數(shù)，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)在15 ℃時最低，在0%～5% PEG濃度時，活力指數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢，增加趨勢較為平緩，當(dāng)PEG濃度增大至10%及20%時，其活力指數(shù)顯著下降。0%～5% PEG濃度區(qū)間內(nèi)，溫度在15℃時在0%～10% PEG濃度區(qū)間內(nèi)其活力指數(shù)變化幅度較小，溫度20℃、25℃、30℃時在10%～20%PEG濃度區(qū)間內(nèi)，隨著PEG濃度的增加，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)總體都呈下降趨勢。

從表1 PEG中可以得出，在15% PEG脅迫時,溫度為15℃、20℃、25℃和30℃的抗旱指數(shù)均高于對照，溫度為25℃時的抗旱指數(shù)與對照相差較小，其余三種溫度下種子的抗旱指數(shù)表現(xiàn)顯著降低?？购抵笖?shù)達到最大值時為1℃、20℃、25℃和30℃時5% PEG干旱脅迫處理組，其中15℃最小值10%PEG處理組，抗旱指數(shù)變化幅度較小。其他溫度下達到最小值為20% PEG的處理組。30℃抗旱指數(shù)整體上要高于15℃、20℃和25℃。巖柿的抗旱指數(shù)隨著PEG濃度逐漸增大，在5%～20% PEG濃度區(qū)間內(nèi)種間變化顯著，總體都呈下降趨勢。但在PEG濃度為15%時，0%、5%、10%、20% PEG濃度時的活力指數(shù)，在0%～5% PEG濃度區(qū)間內(nèi)，活力指數(shù)變化幅度較小，在PEG濃度增大至10%及20%時，其抗旱指數(shù)顯著下降。溫度在20℃、25℃、30℃時0%～25% PEG濃度區(qū)間內(nèi)，變化較大。隨著PEG濃度的提高，各溫度處理的抗旱指數(shù)均表現(xiàn)顯著下降趨勢。在25% PEG濃度脅迫下，平均抗早指數(shù)達到最低值，這表明萌發(fā)期抗旱指數(shù)對PEG模擬的干旱脅迫較為敏感。

2.2 溫度對巖柿種子發(fā)芽率的影響曲線回歸分析

對不同溫度下，對照組(CK)蒸餾水處理組發(fā)芽率均值進行線性回歸分析，得出的擬合曲線圖1，二次曲線模型達到顯著水平P＜0.05，決定系數(shù)R2=0.9371，其模型曲線可靠度最大且適宜，二次曲線模型y = -0.6778x2+ 34.211x—335.72為描述溫度與巖柿種子發(fā)芽率關(guān)系的最優(yōu)模型。b1的系數(shù)34.211＞1，說明隨著溫度的增加，種子發(fā)芽率也逐漸增加，溫度的升高對發(fā)芽率起促進作用，但隨著溫度的增加，b2的系數(shù)為 -0.6778＜ 0，說明當(dāng)溫度超過一定值時，發(fā)芽率就會出現(xiàn)下降的趨勢，求解得到這個轉(zhuǎn)折點為34.211/(2* 0.6778)=25.24，此時的值為最適宜的溫度。從圖1擬合的模型曲線中，接近峰值適宜萌發(fā)的溫度處理為20℃～30℃范圍內(nèi)，可以看出四種溫度處理下，25℃更接近峰值，種子萌發(fā)率最高。

圖1 溫度與發(fā)芽率的曲線擬合Fig. 1 Curve fitting of temperature and germination rate

2.3 PEG干旱脅迫對巖柿種子發(fā)芽率的影響曲線回歸分析

通過，溫度對巖柿種子萌發(fā)影響，得出四種溫度下，巖柿種子萌發(fā)率最高溫度是25 ℃。對此溫度下不同PEG干旱脅迫處理的種子發(fā)芽率進行回歸分析擬合的曲線得如圖2所示。二次曲線模型達到顯著水平P＜0.05，模型決定系數(shù)R2=0.943，可靠度值最大，二次曲線模型y = -0.2841x2+ 4.0238x +83.889為描述PEG處理濃度與巖柿種子發(fā)芽率關(guān)系的最優(yōu)模型。b1的系數(shù)4.0238＞1，說明隨著PEG濃度的增加，種子發(fā)芽率也逐漸增加，PEG濃度的升高對發(fā)芽率有著引發(fā)作用，但隨著PEG濃度的增加，b2的系數(shù)為 -0.2841 ＜ 0，說明當(dāng)PEG波動超過一定值時，發(fā)芽率就會出現(xiàn)下降的趨勢，求解得到這個轉(zhuǎn)折點為4.0238/(2*0.2841）=7.08，超過此PEG濃度處理發(fā)芽率就會受到不同程度的抑制。從圖1擬合的模型曲線中得出，5% PEG處理更接近發(fā)芽率峰值，0%～25% PEG處理下巖柿種子能萌發(fā)。與對照相比，隨著PEG干旱脅迫的增加發(fā)芽率逐漸下降，10%～20% PEG處理萌發(fā)率下降更為明顯。

圖2 PEG干旱脅迫與發(fā)芽率的擬合曲線Fig. 2 Fitting curve of PEG drought stress and germination rate

2.4 PEG干旱脅迫種子萌發(fā)指標(biāo)相關(guān)性分析

PEG干旱脅迫與萌發(fā)指標(biāo)相關(guān)系數(shù)性差異較大（見表2），發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均與PEG濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明隨著干旱脅迫的加深，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)明顯降低。試驗結(jié)果顯示，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、都與PEG濃度呈負(fù)相關(guān)，既當(dāng)PEG濃度增加時上述指標(biāo)值都減小。PEG濃度與發(fā)芽率呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，與抗旱指數(shù)與PEG濃度呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)性不顯著（P＞0.05)。發(fā)芽率與發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)有極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與抗旱指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和抗旱指數(shù)均呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與抗旱指數(shù)相關(guān)性不顯著（P＞0.05)?；盍χ笖?shù)與抗旱指數(shù)相關(guān)性不顯著（P＞0.05)。

表2 PEG干旱脅迫種子萌發(fā)指標(biāo)相關(guān)性分析Tab. 2 Correlation analysis of PEG drought stress seed germination indexes

3 結(jié)論與討論

種子作為植物最重要的繁殖器官，其萌發(fā)階段的耐旱狀況可以在一定程度上反映其抗旱能力。一般情況下，耐旱植物的萌發(fā)在一定范圍的干旱程度內(nèi)是不受影響的，當(dāng)外界干旱程度超過其耐受范圍時其萌發(fā)及生長狀況會受到顯著的影響[29]。巖柿種子在PEG脅迫下其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和抗旱指數(shù)等指標(biāo)都有明顯的變化。不同的溫度處理下減小的幅度不同，不同指標(biāo)的變化也不相同,隨著PEG濃度的增加，這些指標(biāo)都顯著或明顯減小,此實驗結(jié)果與（李慧等，2022；程繼銘等，2020，楊嬌嬌等，2020）研究結(jié)果一致。

從總體上看，隨著PEG濃度的增加，各個溫度處理下巖柿種子的相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)均呈顯著下降趨勢，此實驗結(jié)果與前人研究結(jié)果相似[25-29]。種子的相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)在PEG低濃度時都有輕微上升趨勢，可能因低濃度的PEG處理對種子萌發(fā)起引發(fā)作用所致(汪桂鳳，2019；王小梅，2015；江遠芳，2014）。隨著PEG濃度的增大，四種溫度處理下巖柿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽勢皆呈下降趨勢。PEG濃度為20%時，對比15%PEG濃度處理，四種溫度處理下的發(fā)芽率都顯著下降，20℃、25℃、30℃分別降低了12.97%、22.78%、13.85%，說明當(dāng)PEG濃度處于15%～20%區(qū)間時，PEG干旱脅迫對四種溫度處理下種子的發(fā)芽率抑制作用顯著。實驗中對照組與輕度干旱的5%、10%PEG濃度對巖柿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢影響結(jié)果與張航等（2021）對榆樹種子的研究結(jié)果及孔佳茜等（2020）對大麻種子的研究結(jié)果一致。

結(jié)合巖柿分布區(qū)干熱河谷，氣候條件，年均溫＞20℃, 日均溫＞10℃且年積溫＞7 000 ℃的水平(鐘祥浩, 2000; 金振洲和歐曉昆, 2000)，結(jié)合本試驗結(jié)果15℃～30℃巖柿種子可以萌發(fā)，分布區(qū)溫度情況滿足巖柿種子萌發(fā)所需要求，這與它集中分布于干熱河谷地區(qū)相符。通過張榮祖等(1992)明確提出的干熱河谷氣候指標(biāo)，最冷月平均氣溫＞12℃, 最暖月平均氣溫24℃—28℃, 日均溫≥10 ℃, 年平均積溫＞7 000℃，年平均降雨量600—800 mm, 年平均蒸發(fā)量達2 750—3 850 mm，結(jié)合本試驗結(jié)果低溫10℃巖柿種子不萌發(fā)，20℃～30℃巖柿種子萌發(fā)率較高，其最冷月巖柿種子存在不能正常萌發(fā)的現(xiàn)象，其最暖月的溫度適宜巖柿種子的萌發(fā)。干熱河谷區(qū)內(nèi)主要干流是長江上游的金沙江流域，年徑流量約為5.4×1 010 m3，年降雨量約為680.7 mm，可分為干（旱）濕兩季：干（旱）季為每年 11 月至翌年 4 月，降雨約占全年總降雨量的 18%以下；濕（雨）季為每年5—10月， 降雨約占全年總降雨量的 82—92%，干旱指數(shù)大于2.5，水熱矛盾突出（鐘祥浩, 000; 李昆等, 2011）。結(jié)合本試驗結(jié)果，超過15% PEG干旱脅迫處理對應(yīng)的水勢（-3.256 MPa）時巖柿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、抗旱指數(shù)受到抑制。0%、5%、10% PEG處理分別對應(yīng)的低水勢（0 MPa、-0.58 MPa、-1.66 MPa）種子發(fā)芽率高。干（旱）季的高水勢不宜巖柿種子萌發(fā)，濕（雨）季低水勢則適宜巖柿種子的萌發(fā)。在相應(yīng)的季節(jié)，進行播種育苗能最大限度提高種子的發(fā)芽率。

PEG干旱脅迫處理對巖柿種子萌發(fā)期，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)均有著不同程度的影響。通過PEG干旱脅迫種子萌發(fā)指標(biāo)相關(guān)性分析，得出PEG濃度對不同溫度下的萌發(fā)指標(biāo)均有著不同程度的顯著差異。通過溫度與巖柿種子發(fā)芽率回歸方程擬合曲線分析，發(fā)現(xiàn)20℃～30℃作為巖柿種子萌發(fā)期抗旱性差異的理想溫度。通過不同溫度和PEG濃度處理巖柿種子萌發(fā)特性的比較分析，隨著干旱脅迫程度的增加，15%～25%PEG濃度處理與對照組（CK）、5%、10%PEG處理相比對其萌發(fā)指標(biāo)表現(xiàn)得明顯，差異性較為顯著。從PEG干旱脅迫對巖柿種子萌發(fā)率的影響回歸方程擬合曲線中發(fā)現(xiàn)，0%～25%PEG濃度可作為巖柿種子萌發(fā)期抗旱性差異的理想濃度，區(qū)分巖柿種子萌發(fā)期抗旱性差異的濃度建議選擇為10%～20%PEG干旱脅迫處理。