雷公藤組織培養(yǎng)外植體可溶性糖含量研究

黃淑燕, 江龍

福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 南平 353000

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.），衛(wèi)矛科（Celastraceae）雷公藤屬（Tripterygium），又稱黃藤根、黃臘藤、水莽草、紅藥、斷腸草、菜蟲藥等，多年生落葉蔓性灌木[1]。植物體內(nèi)的碳素營養(yǎng)狀況常以糖含量作為重要的指標(biāo)，可溶性糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，在植物細(xì)胞內(nèi)作為一種能源消耗及儲藏物質(zhì)，屬于非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，參與著多種代謝活動(dòng)，為代謝活躍的胚性細(xì)胞提供充足的能源[2,3]?？扇苄蕴侵械恼崽鞘侵参镉袡C(jī)物運(yùn)輸、貯藏及積累的主要形式[4]，其代謝含量的變化反映了植物細(xì)胞對碳源及能源的吸收和利用情況。組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中可溶性糖的消耗與植物種類、培養(yǎng)體系及所處生長狀態(tài)狀況密切相關(guān)，含量因生長階段的不同而有所差異[5]。相關(guān)研究表明，碳水化合物中的可溶性糖類，可為大量植物不定根的形成提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)[6]，是生根過程不可或缺的。目前，研究證明糖在細(xì)胞內(nèi)是以一種信號分子存在的，其在植物的生長發(fā)育等許多過程中均發(fā)揮著調(diào)控的作用，其還可以作為細(xì)胞內(nèi)許多基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。因此，對植物組織培養(yǎng)各階段的可溶性糖含量的測定，可為今后的研究工作提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雷公藤組織培養(yǎng)無菌外植體:即雷公藤外植體置于事先配制好的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至0、7、14、21、28、35 d時(shí)，取不同培養(yǎng)時(shí)期的外植體進(jìn)行重復(fù)3次的可溶性糖含量測定。

1.2 試驗(yàn)方法

2011年8月，采用蒽酮法作為可溶性糖含量測定的方法[10]，樣品溶液測定方法見表1。

表1 樣品溶液制定方法Tab. 1 Methods for preparing sample solution

表2 組織培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基配方Tab. 2 Culture medium formula in different stages of tissue culture

表3 不同碳源對可溶性糖含量影響培養(yǎng)基配方Tab. 3 Effects of different carbon sources on soluble sugar content in culture medium formula

說明：1. 溫度控制在100℃；2. 從100℃開始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)20 min，然后迅速冷卻，于室溫中平衡10 min；3. 蒽酮注意避光保存，當(dāng)天配制當(dāng)天使用；4. 試管干燥清潔；5. 在冰浴條件下加入蒽酮，生成的顏色較穩(wěn)定，在4 h內(nèi)無明顯變化；6. 每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次[10]。

1.3 試驗(yàn)方案

以雷公藤組織培養(yǎng)各過程最佳配方對無菌外植體進(jìn)行培養(yǎng)，每培養(yǎng)7 d，測定各處理可溶性糖含量變化，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)公式計(jì)算出可溶性糖含量值。經(jīng)過35 d的6次測定后，對結(jié)果進(jìn)行分析對比，探討可溶性糖含量的變化。

1.3.1 組織培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基配方

基本培養(yǎng)基為：MS+蔗糖∶30 g·L-1+瓊脂∶8 g·L-1；pH=5.8；處理號Hy、Hyy、Hyz、Hld、Hzc、Hbd對應(yīng)組織培養(yǎng)階段中芽體誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)芽、芽體增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、1號生根培養(yǎng)和2號生根培養(yǎng)的培養(yǎng)階段。

1.3.2 生根培養(yǎng)階段不同碳源配方

基本培養(yǎng)基為：1/2 MS+瓊脂8 g·L-1；碳源：蔗糖、葡萄糖；pH值5.8；激素：NAA、KT。根據(jù)試驗(yàn)需要，建立6種培養(yǎng)基組合方式，對比可溶性糖含量變化，以處理號Z1、Z2、Z3、P1、P2、P3表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織培養(yǎng)階段外植體可溶性糖含量變化

雷公藤芽誘導(dǎo)分化階段，對培養(yǎng)0、7、14、21、28、35 d的外植體進(jìn)行可溶性糖含量測定。據(jù)圖1顯示，當(dāng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7 d時(shí)，可溶性糖含量上升，表明此時(shí)外植體正儲備營養(yǎng)物質(zhì)來滿足芽體誘導(dǎo)；第14 d時(shí)，含量最低，表明在7～14 d時(shí)間段內(nèi)，已完成芽體誘導(dǎo)過程；在第21 d出現(xiàn)第二次峰值表明此時(shí)外植體的分化增值需要大量營養(yǎng)物質(zhì)。在14～21 d期間，外植體通過光合作用及培養(yǎng)基中的糖含量為可溶性糖合成提供一定基礎(chǔ)，因而，第21 d出現(xiàn)峰值要高于第7d含量。第21～35 d期間，可溶性糖含量呈下降的趨勢，表明此期間芽體營養(yǎng)和增粗生長同步進(jìn)行。

圖1 不同組織培養(yǎng)階段可溶性糖含量變化曲線圖Fig. 1 Variation curve of soluble sugar content at different tissue culture stages

愈傷組織誘導(dǎo)芽階段，可溶性糖含量出現(xiàn)三次高峰值，當(dāng)外植體培養(yǎng)至7 d過程中，愈傷組織逐漸吸收營養(yǎng)物質(zhì)，表明愈傷組織誘導(dǎo)芽初期需要大量可溶性糖；當(dāng)?shù)降?4 d時(shí)愈傷組織逐漸變大且愈傷組織表面有許多小芽分化，因而這兩個(gè)時(shí)間段可溶性糖先上升后下降。由于芽體縱向生長需大量營養(yǎng)物質(zhì)，因此14 d～21 d期間，外植體處于營養(yǎng)物資積累準(zhǔn)備階段而出現(xiàn)第二個(gè)峰值。

Hy、Hyz及Hld階段可溶性糖含量比較發(fā)現(xiàn)，與芽體培養(yǎng)相關(guān)的這三個(gè)階段，可溶性糖含量變化趨勢基本是一致的，其峰值及低谷出現(xiàn)時(shí)間是一樣的，所不同的是在第21～28 d培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)，芽誘導(dǎo)可溶性糖含量下降幅度大于增殖及壯苗培養(yǎng)，而壯苗下降幅度大于增殖培養(yǎng)?？芍?，芽體處于營養(yǎng)生長時(shí)期的芽誘導(dǎo)階段需要的糖含量大于增殖及壯苗培養(yǎng)階段，壯苗培養(yǎng)對糖含量的需求大于增殖培養(yǎng)。圖1所示，培養(yǎng)35 d后，壯苗培養(yǎng)的可溶性糖含量最低，其次為增殖培養(yǎng)，最后為芽誘導(dǎo)，因而在營養(yǎng)生長后期，應(yīng)及時(shí)適度地增加營養(yǎng)物質(zhì)以保證芽體的快速良好生長。

圖1 Hzc和Hbd曲線所示，生根初期，可溶性糖是外植體進(jìn)行正常的新陳代謝及保證根原基分化必不可少的營養(yǎng)及能量物質(zhì)來源，該階段，植物體內(nèi)將淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖，引起第一次上升即培養(yǎng)的第7 d；根系誘導(dǎo)過程，對可溶性糖含量的吸收導(dǎo)致其下降，培養(yǎng)的第7 d-14 d；當(dāng)根系誘導(dǎo)完成后，其需要吸收培養(yǎng)基內(nèi)的碳源即將蔗糖轉(zhuǎn)化為可溶性糖，同時(shí)植株本身進(jìn)行正常的新陳代謝，隨著光合作用增強(qiáng)，體內(nèi)的可溶性糖的含量逐漸上升，且比第一次的峰值高。隨著不定根的迅速伸長及增粗，促進(jìn)了呼吸作用，加快外植體內(nèi)可溶性糖轉(zhuǎn)化利用，此時(shí)可溶性糖應(yīng)處下降趨勢，但1號生根培養(yǎng)在培養(yǎng)第21 d后，可溶性糖含量繼續(xù)上升，比較兩個(gè)生根方案發(fā)現(xiàn)，較高濃度外源激素對根系增殖分化起到促進(jìn)作用，促使兩種生根方案可溶性糖變化趨勢不同。這也表明在21～28 d期間，1號生根培養(yǎng)外植體繼續(xù)進(jìn)行根系誘導(dǎo)過程。

2.2 不同碳源及濃度對生根培養(yǎng)階段外植體可溶性糖含量影響

雷公藤生根培養(yǎng)階段不同碳源及濃度處理，外植體生長結(jié)果如表4所示，可溶性糖含量趨勢變化如圖2所示。

圖2 不同碳源及濃度處理可溶性糖含量變化曲線圖Fig. 2 Variation curve of soluble sugar content under different carbon sources and concentrations

表4 各處理組織培養(yǎng)觀察結(jié)果Tab. 4 Observation results of tissue culture treatment

據(jù)表4數(shù)據(jù)可得，生根培養(yǎng)周期內(nèi)，葡萄糖的添加雷公藤生根效果（生根率、最早生根時(shí)間）不佳且外植體長勢差、根量低。且生根培養(yǎng)的最佳碳源是蔗糖，濃度以30 g·L-1最佳。

圖2所示，除P2（20 g·L-1葡萄糖）處理外，其余處理均在0-35 d培養(yǎng)期間出現(xiàn)可溶性糖含量的雙峰值，但峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同。除Z3（30 g·L-1蔗糖）處理外，其余四個(gè)處理雙峰值出現(xiàn)時(shí)間為培養(yǎng)的第14 d及第28 d，而Z3處理峰值出現(xiàn)于培養(yǎng)第7 d以及培養(yǎng)第28 d。第一個(gè)峰值出現(xiàn)時(shí)間意味著第一次根系誘導(dǎo)的開始。如表4所示，Z3處理的生根時(shí)間最早（培養(yǎng)第11 d）。培養(yǎng)第28 d峰值的出現(xiàn)是為了提供根系的增殖及營養(yǎng)生長，因而其可溶性糖含量高。同時(shí)，由圖2可得，葡萄糖添加處理的在0-14 d培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)，可溶性糖含量明顯高于蔗糖處理，因而，葡萄糖是雷公藤組織培養(yǎng)前期的優(yōu)質(zhì)碳源來源，其利用轉(zhuǎn)化率高。

可溶性糖雖能為外植體提供大量營養(yǎng)物質(zhì)，但應(yīng)處于最佳含量，過高或過低均不利于生根。P2（20 g·L-1葡萄糖）處理可溶性糖一直呈上升趨勢，原因在于過高含糖量，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境滲透壓失調(diào)，抑制了植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致了外植體因營養(yǎng)缺失而生長發(fā)育不良。同時(shí)從以上圖2及表4可知，可溶性糖含量的變化7 d為一個(gè)周期，因而，對于雷公藤組織培養(yǎng)來說，7 d為其植物體生長發(fā)育的小周期，應(yīng)適時(shí)根據(jù)實(shí)際情況更換培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

3.1 可溶性糖含量變化與愈傷組織誘導(dǎo)芽之間關(guān)系

愈傷組織不管是增殖生長還是分化生長，其必須有一個(gè)內(nèi)外糖含量趨于平衡的濃度，因?yàn)橹挥屑?xì)胞內(nèi)外糖濃度處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)方能處于最佳生長狀態(tài)，此時(shí)也正是愈傷組織生長分化最有利時(shí)期[11-12]。觀察發(fā)現(xiàn)，雷公藤外植體中糖濃度一個(gè)時(shí)間段的上升就伴隨著另一時(shí)間段的下降以求平衡。研究表明，隨培養(yǎng)天數(shù)增加，外植體中可溶性糖總體趨勢處于上升而非下降趨勢，因而在后期培養(yǎng)中，外植體需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)來提供其生長發(fā)育。本試驗(yàn)中，利用愈傷組織誘導(dǎo)所得的芽體進(jìn)行光合作用來為其提供更多的養(yǎng)分，因而培養(yǎng)天數(shù)增加，糖含量不僅不減少，反而增加，但若只有愈傷組織而沒有芽體的存在，外植體將會缺失營養(yǎng)，此時(shí)應(yīng)及時(shí)更換培養(yǎng)基。

3.2 可溶性糖含量變化與不定芽分化、增殖及生長發(fā)育之間關(guān)系

當(dāng)外植體接種到芽生長發(fā)育培養(yǎng)基上后，有關(guān)碳水化合物合成的酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)了植物組織細(xì)胞內(nèi)可溶性糖的合成。導(dǎo)致可溶性糖含量在一段時(shí)間內(nèi)，呈迅速增長趨勢。芽體分化及增殖階段的完成伴隨著可溶性糖含量隨著上升—下降—上升?？扇苄蕴呛糠从沉梭w內(nèi)作為有效態(tài)營養(yǎng)物的碳水化合物和能量水平，高濃度的糖可能會抑制芽點(diǎn)的增多，如果芽點(diǎn)數(shù)量過多會消耗大量的可溶性糖，使得分化較好的處理可溶性糖含量降到最低。只有適量的糖含量才能更好地促進(jìn)芽的生成，這與郭維明研究花燭愈傷組織不同繼代培養(yǎng)的再分化差異的結(jié)果是一致的[14]。

3.3 可溶性糖含量變化與生根培養(yǎng)之間關(guān)系

生根前期，莖段根部有愈傷組織生成，因而必須進(jìn)行細(xì)胞分裂，此時(shí)植物體內(nèi)的淀粉溶解，為其提供了大量營養(yǎng)物質(zhì)，因而植物體內(nèi)可溶性糖含量上升；根系誘導(dǎo)過程中，隨著莖段基部對可溶性糖的吸收，體內(nèi)糖含量便不斷下降；隨后植物體對培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)及外植體葉片進(jìn)行光合作用，令外植體內(nèi)可溶性糖含量上升；不定根伸長增粗及增殖生長，令植物體呼吸作用增強(qiáng)，便消耗了大量營養(yǎng)物質(zhì)，因而糖含量再次下降且不再上升。

觀察發(fā)現(xiàn)，1號生根培養(yǎng)中，外植體在培養(yǎng)至第7d時(shí)及28d時(shí)，可溶性糖含量達(dá)峰值，在培養(yǎng)至第14d及35d時(shí)，可溶性糖含量最低，可能由于較高外源激素添加，使得培養(yǎng)基中糖含量在21d時(shí)上升，進(jìn)而呈現(xiàn)的生根效果優(yōu)于2號生根培養(yǎng)。

3.4 不同碳源及濃度添加對雷公藤生根培養(yǎng)可溶性糖含量變化影響

外源糖類的存在與否及使用濃度的大小對生根產(chǎn)生的影響我們解釋為是由于碳源缺乏引起異養(yǎng)無根苗的饑餓和或滲透壓處于亞最適水平或超最適水平。在植物組織培養(yǎng)中，不同植物種類的不同培養(yǎng)階段，需要的糖濃度及種類不同。據(jù)報(bào)道，如果向發(fā)育階段幼苗的外部環(huán)境提供過量的葡萄糖會引起幼苗生長的停滯和分化的中斷，這可能和ABA合成的增多和一些ABA信號基因活化有關(guān)[15]。本文中，最佳碳源的使用濃度及種類為30 g·L-1蔗糖，其次為20 g·L-1蔗糖，再者是10 g·L-1蔗糖。葡萄糖的使用，外植體不僅生根效果差，還令植物體處于營養(yǎng)缺乏狀態(tài)，抑制其生長發(fā)育。