Ferrostatin-1抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠BMSC鐵死亡并防治糖尿病骨質(zhì)疏松

涂來勇 夏力 田峰 胡銅 吳昊天 祖力卡爾·阿地力 趙疆*

1.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830099

2.新疆醫(yī)科大學(xué),新疆 烏魯木齊 830000

3.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院,新疆 烏魯木齊 830000

4.武警新疆總隊醫(yī)院外二科,新疆 烏魯木齊 830000

糖尿病骨質(zhì)疏松癥(DOP)是持續(xù)威脅糖尿病患者骨骼健康的疾病。最近越來越多的證據(jù)證實糖脂代謝與鐵代謝之間存在著密切的聯(lián)系[1-2],DOP的進展常伴有糖脂穩(wěn)態(tài)受損和血漿糖脂代謝產(chǎn)物升高[3]。鐵死亡是一種由不受控制的鐵依賴性脂質(zhì)過氧化引起的細胞程序性死亡的新形式,與其他形式的細胞死亡不同,鐵死亡具有獨特的生物學(xué)特征,如鐵積累、脂質(zhì)過氧化物生成增加以及谷胱甘肽過氧化物酶4 (GPX4)表達下調(diào)。因此,鐵死亡可能在DOP的發(fā)病機制中起重要作用。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)的成骨分化潛能與骨骼健康密切相關(guān)。然而,關(guān)于糖尿病微環(huán)境中BMSC與鐵死亡的關(guān)系尚不清楚。

Ferrostatin-1,一種小分子藥物,是一種有效的鐵蛋白酶抑制劑,也是一種廣泛使用的鐵死亡抑制劑,具有清除脂質(zhì)過氧化物的能力。在本研究中,我們建立了DOP小鼠模型,在體內(nèi)和體外實驗中,我們都證實了高糖環(huán)境誘導(dǎo)的BMSC鐵死亡在DOP中起著至關(guān)重要的作用。這些結(jié)果為DOP的潛在機制提供了見解,并為未來DOP治療策略提出了一個潛在的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物:SPF級雄性C57BL/6小鼠30只。實驗在SPF級實驗室進行。飼養(yǎng)條件:每天光照時間12 h,溫度控制在22～26 ℃,濕度控制在45 %～75 %,每日更換清潔、干燥的墊料,小鼠維持飼料及無菌水喂養(yǎng)。倫理編號為TCMF1-20210521。

1.1.2試劑:Ferrostatin-1 (Sigma,Sm0583),Cell Counting Kit-8 (CCK-8試劑盒)、ALP染色試劑盒、ARS染色試劑盒均購自碧云天,STZ(鏈脲菌素,S0130,Sigma),血糖儀(580,魚躍),血糖試紙(580,魚躍),引物訂購自上海生工生物,引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建動物模型:選取30只8周齡健康雄性SPF級C57BL/6小鼠,體重23±2 g,小鼠隨機分籠后適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周。所有小鼠均自由飲用無菌水,均給與足量高脂飼料喂養(yǎng),飼養(yǎng)間保持清潔干燥,溫度控制在22～25 ℃,濕度控制在40 %～60 %,造模前每周更換小鼠墊料1次,糖尿病模型成模后每天更換1次墊料,并更換清潔干燥的飼養(yǎng)籠。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為3組,對照組6只,模型組(糖尿病模型鼠)與治療組(糖尿病模型+Ferrostatin-1)均為12只。前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)提示,結(jié)合小鼠造模過程中的死亡率及最終模型成功率,最終綜合成模率約為60 %。造模前1 d晚8點開始,所有小鼠禁食,給予足夠飲水,次日晨8點開始構(gòu)建模型,模型組及治療組一次性左下腹腔注射STZ 100 mg/kg( STZ凍干粉完全解凍后,溶解于預(yù)冷的1 %檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液),建立胰島功能損傷模型,對照組給予體重劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。腹腔注射完成后,消毒局部皮膚,轉(zhuǎn)移至清潔干燥的鼠籠,給予足量的水、高脂飼料。1周后測量空腹血糖。當小鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重下降,空腹血糖≥16. 7 mmol /L表現(xiàn)時,判斷為糖尿病模型構(gòu)建成功。最終選取模型構(gòu)建成功的12只小鼠分為模型組與治療組。

1.2.2干預(yù)措施:對照組及模型組給予生理鹽水腹腔注射,治療組給予腹腔注射Ferrostatin-1,劑量為2.5 μmol/kg,每2天1次,共持續(xù)8周。

1.2.3動態(tài)指標檢測:模型構(gòu)建成功后,每日觀察小鼠的毛發(fā)色澤、活動能力。每周尾靜脈采血測血糖1次,并測體重1次。測血糖前日晚8點禁食,給予足夠飲水,次日晨8點測血糖。測血糖時注意輕柔處理小鼠,避免過度刺激引起血糖波動。

1.2.4收集標本:完成干預(yù)后,過量麻醉處死小鼠。去前正中入路剪開小鼠腹部皮膚,用紗布完整去除小鼠腹腔臟器后,充分暴露脊柱,找到L3椎體后完整取出。4 %多聚甲醛固定24 h,脫鈣14 d后,制作組織切片并按照流程完成HE染色。自然風干后顯微鏡下拍照。Image J定量。

1.2.5小鼠BMSC的獲取:過量麻醉處死小鼠后,完整取出小鼠下肢骨,并剝離軟組織充分暴露長骨干。剪去兩端骨骺端,收集長骨干至離心管,3 000 r/min離心5 min,即可獲得骨髓間充質(zhì)細胞沉淀。含10 %FBS的完全培養(yǎng)基重懸沉淀,并種板,5 d后傳代,即可獲得小鼠BMSC。本研究采用P3～P4代小鼠BMSC。

1.2.6小鼠BMSC的干預(yù)及誘導(dǎo)成骨分化:小鼠BMSC按照每孔5×104的密度種于12孔板,24 h后鏡下觀察到細胞完全貼壁,3組均預(yù)干預(yù)24 h后更換成骨誘導(dǎo)液。預(yù)干預(yù)方法[4]:對照組,葡萄糖(5.5 mmol/L)+BSA(300 μmol/L);模型組與治療組:葡萄糖(25.5 mmol/L)+棕櫚酸(300 μmol/L)。治療組中Ferrostatin-1為全程干預(yù)。

1.2.7qPCR檢測相關(guān)mRNA的表達:按照每孔2×105的密度將BMSC種于6孔板,按照實驗方案完成干預(yù)后,吸去培養(yǎng)基,PBS洗3遍,每孔加入1 mL Trizol,冰上裂解10 min,反復(fù)吹打后收集轉(zhuǎn)移至EP管。嚴格按照說明書提取RNA,采用2-△△Ct法計算目標基因的相對表達量。

1.2.8ALP染色:完成成骨誘導(dǎo)7 d后,倒掉培養(yǎng)基,PBS洗兩遍,每孔加入500 μL 4 %多聚甲醛固定1 h,吸去固定液后PBS洗兩遍。嚴格按照說明書操作,40 μL A液加入1 mL反應(yīng)緩沖液,混勻,加入40 μL B液,配置成染色液(現(xiàn)配現(xiàn)用),每孔加入染色液500 μL,37 ℃孵育30 min后吸去染色液,PBS洗兩遍,自然風干后掃描拍照。

1.2.9骨質(zhì)量相關(guān)指標的檢測:骨小梁面積百分數(shù),骨小梁面積/總骨表面積×100%;骨小梁寬度,(2000/1.199) ×(骨小梁面積/骨小梁周長);骨小梁數(shù)量,(1.199/2) ×(骨小梁周長/總骨表面積)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad 8.0完成統(tǒng)計分析及作圖。兩獨立樣本采用t檢驗,不符合正態(tài)分布或方差不齊時采用非參數(shù)檢驗。多組間比較采用單因素方差分析,多組間比較存在兩變量時采用雙因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。*:P<0.05;***:P<0.001;****:P<0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 Ferrostatin-1促進小鼠BMSC成骨分化能力

CCK8結(jié)果顯示,當Ferrostatin-1在不超過10 μmol/L濃度時對小鼠BMSC的增殖能力沒有影響,當Ferrostatin-1濃度為20 μmol/L時顯著抑制小鼠BMSC的增殖(圖1A)。ALP染色顯示,高糖高脂環(huán)境下,BMSC的成骨分化能力被顯著抑制,Ferrostatin-1(10 μmol/L)能夠挽救高糖高脂抑制的成骨分化(圖1B)。

注:A:Ferrostatin-1對 BMSC的增殖能力的影響;B:高糖高脂環(huán)境對BMSC成骨分化能力的影響及Ferrostatin-1的治療作用。圖1 Ferrostatin-1挽救高糖環(huán)境抑制的小鼠BMSC成骨分化能力Fig.1 Ferrostatin-1 rescues the osteogenic differentiation ability of mouse BMSC inhibited by high glucose environment

2.2 Ferrostatin-1促進小鼠BMSC成骨分化標志基因的表達

qPCR結(jié)果顯示,高糖環(huán)境下,成骨分化標志基因Runx2、ALP的表達量被抑制,Ferrostatin-1促進Runx2、ALP的表達量,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;同時,高糖環(huán)境下,鐵死亡負相關(guān)標志基因Gpx4、Slc7a11的表達量被抑制,Ferrostatin-1促進Gpx4、Slc7a11的表達量,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

注:高糖高脂環(huán)境下檢測Runx2、ALP、Gpx4、Slc7a11基因的表達及Ferrostatin-1的干預(yù)效果。圖2 高糖環(huán)境下小鼠BMSC標志基因的表達及Ferrostatin-1的干預(yù)作用Fig.2 Expression of BMSC marker genes in mice under high glucose environment and intervention effect of Ferrostatin-1

2.3 Ferrostatin-1降低糖尿病模型鼠的空腹血糖并增加體重

開始構(gòu)建小鼠糖尿病模型后,連續(xù)8周,每周檢測1次各組小鼠空腹血糖及體重。發(fā)現(xiàn)糖尿病模型鼠空腹血糖迅速上升,體重下降明顯,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;Ferrostatin-1可以有效降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖,并增加體重,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

注:左圖代表對照組、模型組、治療組小鼠的體重,右圖代表各組小鼠的空腹血糖。圖3 Ferrostatin-1降低糖尿病模型鼠的空腹血糖并增加體重Fig.3 Ferrostatin-1 reduces Glucose test#Fasting blood sugar and gains weight in diabetes model rats

2.4 Ferrostatin-1恢復(fù)糖尿病模型鼠的骨量

小鼠的椎體骨HE染色切片顯示,與對照組相比,糖尿病模型鼠骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁寬度、骨小梁數(shù)量下降,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比,Ferrostatin-1治療組骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁寬度、骨小梁數(shù)量增加,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

3 討論

糖尿病骨質(zhì)疏松是一種繼發(fā)性骨質(zhì)疏松,在1984年首次報道[5]。有意思的是,1型糖尿病可以顯著降低骨密度,而2型糖尿病更多的是表現(xiàn)出嚴重的骨微結(jié)構(gòu)惡化,以皮質(zhì)孔隙度和骨脆性增加為特征。因此,2型DOP的作用機制可能更為復(fù)雜,值得進一步研究。研究顯示,采用高脂飲食和1周內(nèi)多次注射低劑量STZ建立小鼠2型DOP模型。研究表明,2型糖尿病誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松沒有觀察到皮質(zhì)骨相關(guān)參數(shù)的改變[6-7]。糖脂毒性可能首先影響最活躍的細胞骨重建區(qū)域,即松質(zhì)骨骨小梁[8-9]。我們的體內(nèi)實驗表明,糖尿病模型鼠骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁寬度、骨小梁數(shù)量下降,Ferrostatin-1治療后糖尿病模型的骨質(zhì)量相關(guān)指標上升(圖4)。

STZ聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松被認為是由于骨形成受到抑制或者是骨吸收過度激活[10]。高血糖、高脂血癥可直接抑制骨細胞前體細胞的成骨,但具體機制還不清楚。已有文獻報道,糖尿病環(huán)境中細胞的凋亡處于激活狀態(tài)[7,11-12]。因此,維持成骨細胞的活力是穩(wěn)定骨質(zhì)量的有效方式。文獻表明,糖脂代謝與鐵代謝之間存在著密切的聯(lián)系,DOP的進展常伴有糖脂穩(wěn)態(tài)受損和血漿糖脂代謝產(chǎn)物升高[1-2]。谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)具有清除脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的能力,已成為細胞鐵死亡研究的明星分子,可以作為判斷細胞鐵死亡的指標[13]。SLC7A11介導(dǎo)的胱氨酸攝取在抑制氧化反應(yīng),調(diào)控細胞存活生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中體外實驗證實,高糖環(huán)境下,BMSC的成骨分化被抑制,鐵死亡的抑制劑能夠挽救高糖環(huán)境下被抑制的的成骨分化(圖1);BMSC成骨分化過程中鐵死亡負相關(guān)標志物Gpx4、Slc7a11基因表達量顯著下調(diào),Ferrostatin-1治療后能夠促進Gpx4、Slc7a11上調(diào),成骨分化標志物Runx2、ALP基因表達上調(diào)(圖2)。

鐵死亡是細胞焦亡、凋亡、自噬、壞死等多種細胞死亡機制之一。鐵是人體必需的微量元素,是生命所必需的物質(zhì),在氧轉(zhuǎn)運、酶促反應(yīng)、免疫反應(yīng)等多種生物化學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。已經(jīng)有研究關(guān)注到骨質(zhì)疏松與鐵死亡之間的聯(lián)系[14],其中糖尿病骨質(zhì)疏松是熱點之一。Song等[15]發(fā)現(xiàn)FANCD2可抑制erastin誘導(dǎo)的BMSC鐵死亡, FANCD2可減少鐵死亡過程中的鐵積累和脂質(zhì)過氧化。研究表明,鐵蛋白抑制BMSC成骨分化,小鼠鐵超載與骨細胞中鐵蛋白升高和RUNX2水平降低有關(guān)[16-17]。進一步的研究發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)的MC3T3細胞中GPX4表達被抑制,氧化應(yīng)激水平升高,線粒體普遍更小,膜染色較深,內(nèi)膜折疊明顯中斷,線粒體碎片化明顯[6]。此外,在高糖環(huán)境下,MC3T3向成骨細胞分化和礦化結(jié)節(jié)形成的能力降低,在小鼠成骨細胞中也觀察到類似的現(xiàn)象[18]。骨質(zhì)疏松是糖尿病患者的常見并發(fā)癥。有研究認為,高血糖引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和膠原蛋白中晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的積累,是導(dǎo)致骨形成減少的主要因素[19-20]。鐵是一種強氧化劑,能夠促進活性氧自由基的產(chǎn)生。鐵代謝指標可直接或間接影響2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[21-22]。鐵死亡過程產(chǎn)生大量氧化應(yīng)激產(chǎn)物,激活ROS,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的積累和細胞損傷[23-24]。有研究觀察到,成骨細胞鐵死亡發(fā)生時,GPX4、骨鈣素(ALP)、堿性磷酸酶(ALP)和骨保護素(OPG)的表達降低,礦化結(jié)節(jié)減少,ROS水平增加,脂質(zhì)過氧化增加[10,18]。當使用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1治療時,能夠挽救鐵死亡。褪黑素,是一種用途廣泛的抗氧化藥物,通過激活Nrf2相關(guān)信號通路,在體內(nèi)實驗和體外實驗中顯著降低了鐵死亡水平,提高了MC3T3-E1的成骨能力[6]。本研究中發(fā)現(xiàn),Ferrostatin-1治療能夠提高糖尿病模型造成的體重下降,同時可以降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖。體內(nèi)實驗顯示,Ferrostatin-1治療后,糖尿病模型小鼠骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁寬度、骨小梁數(shù)量增加。

關(guān)于鐵死亡與糖尿病骨質(zhì)疏松的研究還處于初級階段,關(guān)于糖尿病骨質(zhì)疏松中鐵死亡的具體機制、靶點分子和直接相關(guān)的信號通路尚不清楚。本研究通過構(gòu)建糖尿病骨質(zhì)疏松模小鼠型,在體內(nèi)實驗,提示了鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1在體內(nèi)可以增加體重、降低血糖、增加骨小梁相關(guān)參數(shù);在體外實驗,能夠抑制鐵死亡相關(guān)基因的表達,促進成骨分化相關(guān)基因的表達,促進BMSC的成骨分化。這些新發(fā)現(xiàn)的表型及相關(guān)的分子靶點有待進一步研究,以開發(fā)有效的治療方法。本研究將有助于確定糖尿病骨質(zhì)疏松與鐵死亡之間的關(guān)系,對進一步認識和有效治療糖尿病骨質(zhì)疏松有指導(dǎo)作用。