HPLC 法測定參蒲益智緩釋膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rd 含量*

謝海龍，孟怡彤，董晏含，常英杰，朱艷華

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 虎林 158400）

人參中含有多種化學(xué)成分，包括皂苷類、多糖類、黃酮類等成分，其中主要活性成分且研究最多的是人參皂苷類成分[1]。人參具有安精神，定魂魄，止驚悸，開心益智[2]之功效，現(xiàn)代研究表明，人參皂苷類成分對中樞神經(jīng)、心腦血管和免疫系統(tǒng)均有顯著的保護(hù)作用[3-5]。本實(shí)驗(yàn)室選用人參配伍石菖蒲制備了參蒲益智緩釋膠囊，用于改善認(rèn)知能力，尤其對血管性認(rèn)知障礙（VCI）[6]的預(yù)防及治療效果尤佳。

本文應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）對參蒲益智緩釋膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rd 的含量進(jìn)行測定，為參蒲益智緩釋膠囊的質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與藥品

人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品（B21057 源葉生物）；人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品（B21055 源葉生物）；人參皂苷Rd標(biāo)準(zhǔn)品（B21054 源葉生物）；參蒲益智緩釋膠囊（實(shí)驗(yàn)室自制）；甲醇、乙腈，色譜純，DIKMA 公司；H3PO4（色譜純 科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

BT25S 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（永泰超聲儀器有限公司）；A2010 型島津液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 3 種人參皂苷分析方法的建立

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD（C18柱，250×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～30min，19% B；30~35min，19%～24% B；35~66min，24%～40% B）；檢測波長203nm；流速1.0mL·min-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rd 對照品2.00、3.00、5.00mg，先用適量的0.1mol·L-1HCl 溶液使其充分溶解，再用0.1mol·L-1HCl 溶液將其定容至10mL 容量瓶內(nèi)，搖勻，分別配制成人參皂苷Rg1200.00μg·mL-1、人參皂苷Re 300.00μg·mL-1、人參皂苷Rd 500.00μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。分別精密吸取1mL 上述人參皂苷Rg1、Re、Rd 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用0.1mol·L-1HCl 溶液定容至10mL 容量瓶內(nèi)，搖勻，作為混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取5 粒緩釋膠囊內(nèi)容物，每粒膠囊約0.50g，混勻，取適量顆粒并精密稱定1.50g（約含400mg 人參總皂苷），加入適量0.1mol·L-1HCl 溶液使其溶解，再用0.1mol·L-1HCl 溶液定容于100mL 容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.4 空白溶液的制備 按照比例稱取輔料，用0.1mol·L-1HCl 溶液溶解后，定容至10mL 容量瓶內(nèi)，搖勻，作為空白溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性考察

使用0.22μm 濾膜過濾空白溶液、對照品溶液和供試品溶液。按照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。

圖1 人參總皂苷高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of total ginsenosides

由圖1 可見，人參皂苷Rg1、Re、Rd 的保留時(shí)間分別約為36.6、37.1、63.3 min，且對照品、供試品的峰形較好，輔料峰未產(chǎn)生干擾，證明此方法的專屬性好。

2.2 線性關(guān)系考察

取“1.2.2”項(xiàng)下對照品儲備液，分別精密吸取人參皂苷Rg1、Re、Rd 對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 置于10mL 容量瓶中，分別得到2.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00μg·mL-1的人參皂苷Rg1對 照 品 溶 液，3.00、6.00、12.00、18.00、24.00、30.00μg·mL-1的人參皂苷Re 對照品溶液和5.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00μg·mL-1的人參皂苷Rd 對照品溶液，用0.22μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液按照“1.2.1”的色譜方法進(jìn)樣分析，記錄峰面積。分別以人參皂苷Rg1、Re、Rd 濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別得到人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=487777X-261994（R2=0.9998）、人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=274628X-146458（R2=0.9995）、人參皂苷Rd 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=248940X-66784（R2=0.9995）。標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖2、3、4。

圖2 HPLC 法測定人參皂苷Rg1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for the determination of ginsenoside Rg1 by HPLC

由圖2～4 可知，人參皂苷Rg1、Re、Rd 分別在2.00~20.00、3.00~30.00、5.00~50.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度考察

2.3.1 日內(nèi)精密度 分別配制濃度為2.00、8.00、16.00μg·mL-1的人參皂苷Rg1對照品溶液，3.00、12.00、24.00μg·mL-1的人參皂苷Re 對照品溶液，5.00、20.00、40.00μg·mL-1的人參皂苷Rd 對照品溶液，平行配制6 份，按照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re 和Rd 日內(nèi)精密度，結(jié)果均小于2%，符合方法學(xué)考察。

2.3.2 日間精密度 分別配制濃度為2.00、8.00、16.00μg·mL-1的人參皂苷Rg1對照品溶液，3.00、12.00、24.00μg·mL-1的人參皂苷Re 對照品溶液，5.00、20.00、40.00 μg·mL-1人參皂苷Rd 對照品溶液，平行配制6 份，按照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)3d，記錄峰面積，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re 和Rd 日間精密度，結(jié)果均小于2%，符合方法學(xué)考察。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按照“1.2.3”項(xiàng)下的供試品溶液配制方法平行配制6 份溶液，按照“1.2.1”的色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 和24h 進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re 和Rd 的RSD 值，結(jié)果分別為0.45%、0.19%、0.20%，均小于2%。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、Re 和Rd 在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收率

取樣品6 份，每份約0.75g（約含人參皂苷Rg1、Re、Rd 分別為0.5、0.25、1.0mg），精密稱定，置于10mL 容量瓶中，加0.1mol·L-1HCl 溶液超聲溶解并稀釋至刻度，精密吸取1mL 置于5mL 容量瓶中，分別依次加入人參皂苷Rg14.00μg·mL-1、人參皂苷Re 6.00μg·mL-1和人參皂苷Rd 10.00μg·mL-1對照品溶液1mL，加0.1mol·L-1HCl 溶液超聲稀釋至刻度，搖勻，照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，按式（1）計(jì)算加樣回收率。

加樣回收率=（人參皂苷測得量-樣品中人參皂苷的含量）/人參皂苷對照品加入量×100% （1）

結(jié)果表明，平均回收率在80%~120%之間，且RSD 值小于2%，符合方法學(xué)考察要求。

2.6 含量測定

按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備3 批供試品溶液，按照“1.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，通過峰面積值計(jì)算每粒緩釋膠囊中3 種人參皂苷的含量，結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1含量分別為0.51、0.57、0.54mg·粒-1，其平均含量為0.54mg·粒-1；人參皂苷Re 含量分別為1.35、1.31、1.34mg·粒-1，其平均含量為1.33mg·粒-1；人參皂苷Rd 含量分別為2.15、2.17、2.11mg·粒-1，其平均含量為2.14mg·粒-1。

3 結(jié)論

本文采用HPLC 法建立了參蒲益智緩釋膠囊中3 種人參皂苷含量的測定方法，并進(jìn)行了相應(yīng)的方法學(xué)考察。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、Re 和Rd 在其濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法學(xué)考察結(jié)果也均符合要求，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。本實(shí)驗(yàn)為參蒲益智緩釋膠囊的后續(xù)研究提供了參考。