紫花苜蓿葉面積和葉解剖結(jié)構(gòu)對鹽脅迫的響應(yīng)

趙 欣, 盧海峰, 錢 程, 胡雅飛, 劉大林, 王 琳, 李新娥

[1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚州 225009;2.揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院(國際聯(lián)合實驗室),江蘇揚州 225009]

紫花苜蓿 (Medicagosativa) 屬于多年生豆科牧草,是我國調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、發(fā)展畜牧產(chǎn)業(yè)的主要牧草之一,也是目前保留種植面積最廣的多年生牧草;其粗蛋白含量高,氨基酸種類齊全,總氨基酸含量較高,富含礦物質(zhì)、碳水化合物、維生素等營養(yǎng)物質(zhì),適口性好,家畜喜食[1-2],有“牧草之王”的美譽[3-4]。此外,紫花苜蓿較強的固氮功能,可以有效改善土壤肥力[5-6],因此還可作綠肥。目前,土壤鹽漬化是影響并限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個重要因素,我國鹽堿地總面積達9 913萬hm2,約占我國國土面積的10%,并且還在逐年增長[2,7-8]。而紫花苜蓿顯現(xiàn)出較強的耐鹽性,揭示紫花苜蓿的耐鹽策略對進一步發(fā)展鹽堿土地的飼草種植業(yè)具有積極作用。

植物葉片是連接植物和環(huán)境的重要器官[9]。環(huán)境變化常導(dǎo)致植物葉片基本形態(tài)及葉片解剖特征的響應(yīng)與適應(yīng)[10]。鹽脅迫會導(dǎo)致植物的葉片擴展速率降低甚至停止生長,葉面積降低,比如烏拉爾甘草(Glycyrrhizauralensis)[11]、空心蓮子草 (Alternantheraphiloxeroides)[12]、深紫糙蘇 (Phlomispurpurea)[13]等。比葉面積是葉單面單位面積與干質(zhì)量之比,是一個涉及植物生態(tài)學(xué)的多功能方面的變量[14]。在有利的條件下,植物優(yōu)化葉面積和比葉面積以獲取光和養(yǎng)分;而在較高的鹽濃度下,植物更傾向于將碳分配給葉質(zhì)量和根,而不傾向于其表面[15]。

有關(guān)葉片解剖特征的研究顯示,葉厚度最易受鹽脅迫影響而產(chǎn)生差異,但研究結(jié)果并不一致。有研究指出鹽脅迫會導(dǎo)致葉厚度增加,例如NaCl溶液處理下,空心蓮子草[12]、三色堇(Violatricolor)[16]、木欖 (Bruguieragymnorhiza)[17]的葉片表皮厚度、葉肉厚度以及葉片總厚度都顯著增加[18]。然而,鹽脅迫處理的萵苣 (Lactucasativa) 葉厚度沒有顯著變化[19]。還有研究顯示,紫花苜蓿[8]、辣椒(Capsicumannuum)[20]、草莓(Fragariaananassa)[21]在鹽脅迫下葉厚度顯著降低。還有一部分植物可以通過改善葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)的策略以適應(yīng)鹽脅迫的環(huán)境。柵欄組織和海綿組織厚度的比值 (柵海比) 是評價植物抗逆性的重要指標(biāo)之一,葉片的柵海比越高,越有利于提高葉片內(nèi)的氣體交換和貯存,植物適應(yīng)逆境的能力就越強[22-24]。例如,三色堇[16]、苦檻藍 (Myoporumbontioides)[25]、木本苜蓿 (Medicagoarborea)[26]的柵海比在鹽脅迫下顯著增高。此外,葉片其他解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo),如暴露在單位細胞間隙中細胞壁的表面積 (Sm)、細胞壁的厚度、細胞間隙分數(shù) (細胞間隙占葉肉總面積的分數(shù),fias),這些指標(biāo)均與葉肉導(dǎo)度有緊密的相關(guān)性,葉肉導(dǎo)度是胞間CO2到達葉片內(nèi)羧化位點阻力的倒數(shù)。細胞壁越厚,細胞間隙的空間較小時,擴散的阻力就越大,葉肉導(dǎo)度就越小,這些指標(biāo)在一定程度上影響著光合作用的效率[27-29]。有研究指出,鹽脅迫會降低棉花 (Gossypiumspp.) 葉片的葉肉導(dǎo)度,這可能是葉片葉綠體面積降低、細胞壁厚度增加導(dǎo)致的結(jié)果,但是與葉肉導(dǎo)度相關(guān)的解剖結(jié)構(gòu)如何變化并不清楚[30]。因此,需要進一步探討鹽脅迫對植物葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響。

目前,關(guān)于紫花苜蓿葉解剖結(jié)構(gòu)所反映的抗鹽性或耐鹽性響應(yīng)研究仍然不足,限制了我們對紫花苜蓿耐鹽機制的了解。因此,本研究依托2個耐鹽性不同的紫花苜蓿品種,采用溫室盆栽試驗,通過葉片掃描和石蠟切片技術(shù),測量并計算紫花苜蓿葉面積、比葉面積、葉片橫切解剖結(jié)構(gòu)特征,擬探討以下幾個主要問題：(1)不同耐鹽性品種紫花苜蓿葉面積和比葉面積對鹽脅迫的響應(yīng);(2)不同耐鹽性品種紫花苜蓿的葉片橫切解剖特征對鹽脅迫的響應(yīng);(3)不同耐鹽性紫花苜蓿品種響應(yīng)鹽脅迫的主要特征指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究地點及材料

試驗選用2個紫花苜蓿品種,WL363HQ品種秋眠級為5,為抗寒高產(chǎn)多葉品種;WL712品種秋眠級為10,為南方高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種,冬季生長活躍。試驗初篩顯示,WL363HQ耐鹽性較強,而WL712耐鹽性較差。試驗采用盆栽方式 (花盆口徑約17.5 cm,高度約16 cm,底徑約14 cm),于2020年10月在揚州大學(xué)智能溫室內(nèi)(日均最高溫度27 ℃,最低溫度 15 ℃)播種。每盆均勻點播15 粒種子 (種子購買于北京正道種業(yè)有限公司),3葉期時進行間苗,留下 10株長勢一致的健康幼苗,每7 d澆500 mL霍格蘭營養(yǎng)液,每個品種各栽12盆。幼苗生長期,設(shè)置4個NaCl濃度梯度 (0、50、150、250 mmol/L),3組重復(fù),每隔3 d澆100 mL NaCl溶液和對照蒸餾水。幼苗進行脅迫處理60 d后,于2021年1月中旬進行取樣測量。

1.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)特征測定

每盆摘取5張成熟、健康的葉片,置于密封袋保鮮帶回實驗室,使用葉面積測定儀 (YT-YMJ02,山東云唐智能科技有限公司) 掃描葉面積后,稱葉片鮮質(zhì)量,稱質(zhì)量后將葉片用信封包好在105 ℃烘箱中殺青0.5 h,隨后72 ℃烘干48 h直至葉片質(zhì)量不再改變后,稱取葉片干質(zhì)量,用于計算比葉面積 (葉面積與葉干質(zhì)量的比值,m2/g)。

另取相同位置的成熟健康葉片固定于FAA固定液中,4 ℃保存。將固定好的葉片用乙醇 (濃度梯度為50%、70%、85%、95%、100%) 脫水,每個梯度脫水30 ～ 60 min。二甲苯透明2次各30 min,浸蠟過夜,再用純蠟置換2～3次,每次1 h左右,采用科迪KD-BMIII包埋機包埋,科迪KD-2260切片機切片,切片厚度為8 μm,番紅-固綠雙重染色,中性樹膠封片后烘干。在Leica DM500-TR型顯微鏡及LIOO成像系統(tǒng)下觀察、拍照。

用Image-J軟件測量葉片的總厚度,上角質(zhì)層、下角質(zhì)層厚度,角質(zhì)層總厚度,上表皮細胞、下表皮細胞厚度,表皮總厚度,柵欄組織、海綿組織、葉肉組織厚度,并分別計算柵欄組織、海綿組織、葉肉組織厚度占葉片總厚度的百分比。測量細胞間隙面積、細胞壁厚度、細胞間隙中細胞壁的總長度、切片橫截面總面積(圖1)。細胞間隙分數(shù)的計算方法[27]如下：

Sm的計算方法如下：

式中：fias是細胞間隙百分數(shù);Sias是細胞間隙的面積,μm2;S為所計算切片的橫截面積,μm2;Sm為暴露在單位細胞間隙中的細胞壁的表面積,μm2/μm2;lm為單位細胞間隙中的細胞壁總長度,μm;F是曲率修正因子,根據(jù)之前的研究取值為F=1.42[31]。

每個切片選3個視野測量,除細胞壁厚度以外,每個指標(biāo)重復(fù)測量3次;細胞壁厚度隨機選取顯示在細胞間隙中的多個細胞,重復(fù)測量5次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在Excel 2019對數(shù)據(jù)進行錄入和整理,用統(tǒng)計軟件IBM SPSS Statistics 21對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,進行單因素方差分析和鄧肯氏多重比較。在分析中,上、下表皮厚度,表皮總厚度,柵欄組織、海綿組織、葉肉組織厚度,葉片總厚度進行了log轉(zhuǎn)換以符合正態(tài)分布。本研究以α=0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準。

此外,本研究對所有測量指標(biāo)進行主成分分析(PCA)。主成分分析可以把多個互相關(guān)聯(lián)的指標(biāo)通過降維轉(zhuǎn)換為較少的指標(biāo)來綜合反映其變化的信息,這些綜合指標(biāo)即為原來多個指標(biāo)的主要成分,每個主成分的貢獻率反映了從原始單一指標(biāo)中提取的信息量。貢獻率越大表明主成分中包含的原始信息越多[32]。很多研究應(yīng)用主成分分析法將大量的性狀特征轉(zhuǎn)化為少量的綜合特征,在產(chǎn)量、品質(zhì)以及耐逆性狀的篩選方面發(fā)揮了重要的作用[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl濃度對不同品種紫花苜蓿葉面積、比葉面積和葉厚度的影響

表1顯示,WL363HQ品種的葉面積在對照組(0 mmol/L NaCl)最大,平均(2.5±0.3) cm2,隨著NaCl濃度的升高,分別顯著降低了12%、32%、36% (P<0.05);比葉面積無顯著變化。而WL712品種的葉面積在鹽脅迫后沒有顯著變化,比葉面積隨NaCl濃度升高而升高 (P=0.073),最高在NaCl濃度為250 mmol/L時提高了21%。2個品種的葉片總厚度在對照組分別為(118.5±6.6)、(127.6±7.1) μm,在NaCl濃度為150 mmol/L時均顯著提高 (P≤0.086),WL363HQ品種的葉片總厚度增加了32.2 μm,WL712品種增加了23.9 μm。從圖1也可觀察到在NaCl濃度為150 mmol/L時,2種紫花苜蓿的葉片總厚度最大。

表1 不同鹽濃度對兩種紫花苜蓿葉面積、比葉面積和葉厚度的影響

2.2 NaCl濃度對不同品種紫花苜蓿角質(zhì)層和表皮厚度的影響

紫花苜蓿葉片為典型的異面葉,其解剖結(jié)構(gòu)主要分為上下角質(zhì)層、上下表皮細胞和葉肉組織,細胞間隙為葉肉組織中的間隙部分(圖1)。由表2可知,各處理下WL363HQ、WL712的上角質(zhì)層厚度分別介于4.2～5.1、3.2～5.0 μm,下角質(zhì)層厚度分別介于4.9～5.5、3.1～5.9 μm,上表皮厚度分別介于12.9～14.2、11.7～15.6 μm,下表皮厚度分別介于12.4～13.7、12.0～15.3 μm。NaCl濃度升高對WL363HQ的上下角質(zhì)層厚度沒有產(chǎn)生顯著影響,對表皮厚度的影響也不顯著,但總體都是減小的趨勢。然而,WL712品種的下角質(zhì)層、總角質(zhì)層的厚度都隨著NaCl濃度的升高而顯著降低 (P<0.05),下角質(zhì)層、角質(zhì)層總厚度在NaCl 濃度為250 mmol/L時分別顯著降低了47%、39%;上角質(zhì)層沒有顯著的變化,但也呈現(xiàn)下降的趨勢;對其表皮而言,除上表皮厚度在NaCl濃度為150 mmol/L時顯著上升了33%外 (P<0.05),下表皮和總表皮厚度均無顯著變化。

表2 不同NaCl濃度對兩種紫花苜蓿葉片角質(zhì)層和表皮厚度的影響

2.3 NaCl濃度對不同品種紫花苜蓿葉肉組織厚度和葉肉導(dǎo)度相關(guān)指標(biāo)的影響

葉肉組織由柵欄組織和海綿組織構(gòu)成。由表3可知,WL363HQ品種的柵欄組織厚度在對照處理中的厚度為(43.5±2.8) μm,NaCl濃度為150、250 mmol/L 時分別顯著增加了35%、46%(P<0.05),葉肉組織厚度也從對照組的(86.3±5.6) μm顯著增加了31%、25% (P<0.05),而海綿組織厚度無顯著變化,由此造成了柵欄組織厚度百分比、柵海比、葉肉組織厚度百分比均顯著增加(P<0.05),而海綿組織厚度百分比則顯著下降 (P<0.05)。然而,對于WL712品種而言,除了柵欄組織厚度在NaCl濃度為250 mmol/L時比對照組顯著降低了16% (P<0.05),海綿組織、葉肉組織厚度無顯著變化,3個百分比指標(biāo)以及柵海比也均無顯著性差異。

表3 不同NaCl濃度對兩種紫花苜蓿葉肉組織厚度和葉肉導(dǎo)度相關(guān)解剖指標(biāo)的影響

Sm、fias、細胞壁厚度都是影響葉肉導(dǎo)度的重要因素之一。鹽脅迫處理以后,WL363HQ品種的Sm、fias變化均不顯著,總體上在NaCl濃度為50、150 mmol/L時較高于對照和最高濃度;細胞壁厚度在對照處理時最大,為(0.9±0.1) μm,在NaCl濃度為150、250 mmol/L時顯著降低,分別降低了22%、33% (P<0.05)。WL712品種的Sm隨濃度升高逐漸降低,在NaCl濃度為250 mmol/L 時較對照降低了26%(P<0.05);細胞間隙分數(shù)在NaCl濃度為 50 mmol/L 時較對照顯著提高了48%,在 150 mmol/L 時較對照提高了12%,但在高濃度 250 mmol/L 時與對照無顯著性差異(P≥0.05);WL712的細胞壁厚度在各濃度鹽脅迫處理下的變化均不顯著。

2.4 紫花苜蓿葉解剖指標(biāo)的主成分分析 (PCA)

將2個品種的所有測量特征指標(biāo)分別進行主成分分析 (圖2),各指標(biāo)與前4個PCA主軸的特征值、貢獻率、累計貢獻率如表4所示。品種WL363HQ的前4個主成分軸的累計貢獻率達到81.21%, 即能解釋所測定指標(biāo)的81.21%的變異。

表4 2個紫花苜蓿品種葉解剖指標(biāo)的前4個主成分的特征向量、特征值、貢獻率及累計貢獻率

第1主成分軸的貢獻率最大,達到了30.00%,主要與葉肉厚度 (MT)、葉厚度 (LT) 、柵欄組織厚度 (PT) 具有較強的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.40、0.37、0.40;第2主成分軸的貢獻率為22.86%,主要由上表皮厚度 (UET)、表皮厚度 (TET) 和柵欄組織厚度百分比 (MT%) 決定,相關(guān)系數(shù)分別為0.33、0.39、0.35。

WL712品種的前4個主成分軸的累計貢獻率達到79.44%。第1主成分的貢獻率達到28.00%,主要由葉肉組織 (MT)、角質(zhì)層厚度 (TCT)、葉厚度 (LT) 決定,相關(guān)系數(shù)分別為0.38、0.33、0.33;第2主成分的貢獻率為22.25%,主要由上表皮厚度 (UET)、下表皮厚度 (LET)、表皮總厚度 (TET) 決定,相關(guān)系數(shù)分別為0.35、0.40、0.44。

3 討論

3.1 紫花苜蓿葉面積、比葉面積和葉厚度對鹽脅迫的響應(yīng)

植物葉面積的大小決定著植物光合輻射的有效面積[34],與干物質(zhì)產(chǎn)量具有密切的關(guān)系。WL363HQ的葉面積隨NaCl濃度的升高而降低,這與之前的很多研究[11-12]一致。長期鹽脅迫下植物的能量消耗可能大于能量產(chǎn)生,因此需要減少對葉片擴張的能量投入。較小的葉面積使得植物體的蒸騰面積進一步降低,失水速率減小,故抵御鹽脅迫及防止灼燒的能力也不斷增強,這是一種避鹽機制,這種機制可以限制鹽離子在植物地上部分的積累,并將蒸騰作用造成的水分損失降至最低[18]。與WL363HQ不同的是,WL712的葉面積沒有產(chǎn)生較大的變化,但比葉面積在受到鹽脅迫后顯著增加了,在NaCl濃度為250 mmol/L時增加最明顯。比葉面積增加這種反應(yīng)有利于更大的全植物碳增益,從而有助于這個品種在鹽堿易發(fā)地區(qū)獲得更好的農(nóng)藝性能[35]。

2個品種的葉厚度在鹽脅迫后都顯著地增加了,并在NaCl濃度為150 mmol/L時最明顯,濃度持續(xù)升高、葉厚度下降。葉厚度與葉片的儲水能力有關(guān)[36]。厚葉通常具有較高的葉綠素,且葉厚度也是與植物產(chǎn)量緊密相關(guān)的特征[37]。在高鹽濃度下,更高的葉厚度有助于稀釋細胞液中的鹽濃度,調(diào)節(jié)滲透平衡[19],并且可以平衡葉面積減小對干物質(zhì)產(chǎn)量帶來的消極影響。

3.2 紫花苜蓿角質(zhì)層和表皮厚度對鹽脅迫的響應(yīng)

葉片表皮是位于葉片表面的一層細胞,角質(zhì)層是位于葉片表皮外的一層疏水膜,和表皮細胞共同為葉片器官提供支撐和保護[38]。上表皮是葉片的向光面[39],葉片上表皮厚度對葉片表面光的反射和折射具有密切聯(lián)系,較低的厚度更利于光的透射[40],但較高的表皮厚度對葉片起到了一個很好的支撐作用。角質(zhì)層厚度可以賦予葉片機械強度,較厚的角質(zhì)層更耐撕裂,撕裂力與角質(zhì)層厚度成正比[41]。本研究結(jié)果顯示,WL363HQ品種的角質(zhì)層、表皮特征均沒有顯著的變化;而WL712品種紫花苜蓿的角質(zhì)層厚度在高鹽脅迫中顯著減低,這種變化不利于植物對水分的保護以及維持葉片的正常形態(tài),其上表皮厚度在NaCl濃度為150 mmol/L時增加,說明其葉片的光合有效輻射受到的影響較大,最終可能導(dǎo)致葉片擴張延緩,生物量減少等結(jié)果。

3.3 紫花苜蓿葉肉組織及葉肉導(dǎo)度對鹽脅迫的響應(yīng)

葉肉柵欄組織越厚,意味著最大單位體積內(nèi)葉綠體數(shù)量越多,葉片可進行光合作用的位點更多;葉肉海綿組織越厚,海綿組織的比率越小,表示葉肉組織越緊密,細胞間隙所占的比率越小,從而減少蒸騰作用的水分散失和保證更高的水分利用效率[42]。因此柵海比越高越有助于縮短CO2到達葉綠體的距離[18],使葉片的光合效率得到顯著的提升[43]。試驗結(jié)果表明,WL363HQ品種的柵欄組織厚度和相對比例隨NaCl濃度增加而顯著增加,而海綿組織厚度百分比降低,柵海比升高,這些變化反映出其對高鹽濃度的適應(yīng),是一種保護光合作用過程的適應(yīng)性反應(yīng),該結(jié)果與在高濃度鹽脅迫下具有更高柵海比的三色堇一致[16]。然而,WL712品種的柵欄組織厚度在NaCl濃度為150 mmol/L時達到最大,但NaCl濃度達到250 mmol/L時柵欄組織厚度降低,這表明WL712品種對高鹽脅迫的適應(yīng)性不如WL363HQ品種。

葉肉導(dǎo)度是CO2在葉肉細胞內(nèi)傳輸阻力的倒數(shù),其大小主要取決于葉片的結(jié)構(gòu)[44],是影響葉片光合速率的關(guān)鍵性狀[29]。研究結(jié)果顯示,WL363HQ品種的細胞壁厚度隨NaCl濃度升高而減小,而更薄的細胞壁表明葉肉細胞具有更大的CO2導(dǎo)度,有助于提高葉片的光合速率。而WL712品種的Sm隨NaCl濃度的升高而降低,fias、Sm與通常葉肉導(dǎo)度呈正相關(guān)關(guān)系[45-46],因此其葉肉導(dǎo)度也可能隨之下降。這個結(jié)果也證明,相較于WL363HQ品種,WL712品種受到鹽脅迫的負面影響可能更嚴重,不適宜在高鹽濃度的環(huán)境下長期生存[44]。

3.4 2個紫花苜蓿品種響應(yīng)鹽脅迫的主要特征指標(biāo)

主成分分析結(jié)果顯示,WL363HQ品種的柵欄組織厚度、葉肉厚度、葉總厚度是葉片在鹽脅迫中響應(yīng)的主導(dǎo)特征,主要反映了葉片能量分配的特征,這是影響紫花苜蓿產(chǎn)量的重要性狀,說明提高WL363HQ品種的耐鹽性主要是提高葉片的葉肉厚度、柵欄組織和葉厚度。以前的研究也顯示,在鹽脅迫條件下,植物提高葉厚度和柵欄組織厚度有利于提高其生物量和存活率,葉片可以通過改變厚度來調(diào)節(jié)單位面積的生物量[47]。

WL712品種的第1主成分中,葉肉組織厚度、柵欄組織厚度、角質(zhì)層厚度的絕對值較大;第2主成分中,上下表皮、表皮總厚度的絕對值較大。因此,角質(zhì)層厚度、表皮厚度是WL712品種響應(yīng)鹽脅迫的主要特征,角質(zhì)層厚度的變化與葉片的機械強度、水分屏障有關(guān),這些特性與植物在逆境中的生存緊密相關(guān)[38,41]。在高鹽濃度下WL712品種的角質(zhì)層厚度減小和表皮厚度增加是影響其生長發(fā)育的主要原因。

4 結(jié)論

綜上所述,耐鹽性較強的品種WL363HQ葉片的主要耐鹽策略包括減小葉面積、提高葉片柵欄組織厚度,從而增大光合器官的投入、減少海綿組織的相對厚度以縮短CO2的擴散距離,通過減少細胞壁厚度提高葉肉導(dǎo)度,從而最終提高光合效率以適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。然而,耐鹽性較差的品種WL712雖然表現(xiàn)出了比葉面積和葉厚度增大的特征以積極響應(yīng)鹽脅迫,但其葉片在高鹽濃度時角質(zhì)層厚度降低,葉厚度、柵欄組織厚度降低,這些變化均不利于對鹽脅迫環(huán)境的適應(yīng),最終不利于其在高鹽濃度下生長發(fā)育。研究結(jié)果揭示了2種不同耐鹽性紫花苜蓿品種在鹽脅迫環(huán)境下的主要葉片策略。