基于TLR4/NF-κB信號(hào)通路探討葛根黃連黃芩湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

許瑤瑤，蔡巧燕，2，趙春雨，賈沛芝，王美玲，林 煒，2，張 鈴，2*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種原因不明的以直腸、結(jié)腸黏膜非特異性炎癥、潰瘍形成為主的病變。臨床主要癥狀有腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便［1-3］。臨床研究表明，與普通人相比潰瘍性結(jié)腸炎患者患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)是普通人的6～8 倍［4］，因此早期干預(yù)對(duì)減緩結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的發(fā)生至關(guān)重要。潰瘍性結(jié)腸炎在古代文獻(xiàn)中并無確切的病名，可與中 醫(yī)“泄 瀉”“痢 疾”“腸 風(fēng)”“便 血”“休 息 痢”等 對(duì)應(yīng)［5］。張仲景在《傷寒論·太陽病脈證并治》中提：“太陽病，桂枝證，醫(yī)反下之，利遂不止，脈促者，表未解也。喘而汗出者，葛根黃連黃芩湯主之。”［6］表明葛根黃連黃芩湯主治下利。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道葛根黃連黃芩湯在臨床上被廣泛地用于腸道疾病的治療，例如潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、結(jié)直腸癌等［7-10］。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一種在腸道固有免疫中起重要作用的模式識(shí)別受體，通常在潰瘍性結(jié)腸炎的結(jié)腸組織中高表達(dá)［11］；當(dāng)TLR4受到外源刺激時(shí)，可激活NF-κB 的磷酸化，促使其入核，而NF-κB 作為免疫調(diào)節(jié)過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，其活化可增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，最終加劇潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展［12］。本研究擬從TLR4/NF-κB 信號(hào)通路探討葛根黃連黃芩湯對(duì)葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 雄性小鼠20 只，體質(zhì)量（22±1）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007，飼養(yǎng)條件為溫度濕度恒定，每天給予光照12 h。本研究方案經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：2W202201 1 2022197）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 葛根黃連黃芩湯，組方：葛根24 g，黃連9 g，黃芩9 g，炙甘草6 g。4 味藥物飲片均購自河北安嘉藥業(yè)有限公司，藥材均已按國家中藥飲片炮制規(guī)范進(jìn)行炮制。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DSS（美國MPMatenals 公司，批號(hào)：216011 090）；Phospho-NF-κB p-P65 抗體（批號(hào)：3033S）、NF-κB P65 抗體（批號(hào)：8242S）均購自美國CST 公司；TLR4 抗體（批號(hào)：66350-1-Ig）、GAPDH抗體（批號(hào)：60004-1-Ig）、Vinculin 抗體（批號(hào)：66305-1-Ig）、Goat Anti-Mouse IgG（H+L）-HRP conjugate 抗體（批號(hào)：SA00001-1）、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）-HRP conjugate 抗體（批號(hào)：SA00001-2）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；蘇木素染色液（批號(hào)：G1140）、伊紅染色液（批號(hào)：G1100）均購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：Kit-0017）；便隱血（OB）試劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BA-2020B）；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)：R211-02）；SYBR?Select Master Mix kit（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號(hào)：4472908）；ELISA 試劑盒小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（批號(hào)：MM-0040M1）、小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）（批號(hào)：MM-0163M1）、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（批號(hào)：MM-0132Ml）均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 低溫高速離心機(jī)（美國Sigma-Aldrich 公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜裝置、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)（德國徠卡儀器公司）；生物組織石蠟包埋機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；光學(xué)顯微鏡（德國徠卡儀器公司）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像采集與分析系統(tǒng)（廈門市麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備 按照8∶3∶3∶2 的比例取4 種中藥飲片葛根、黃芩、黃連、炙甘草。先將藥物浸泡于8 倍量超純水中30 min，再回流提取，提取時(shí)間為1 h。等提取結(jié)束后，用紗布過濾藥液，再次加入等體積量的超純水，煎煮時(shí)間為1 h。結(jié)束后，再次加入等量的超純水量，煎煮1 h。等待3 次提取結(jié)束后，將藥液旋蒸濃縮為1 g/mL 葛根黃連黃芩湯藥液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 造模和分組 將20 只C57BL/6 小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、中藥組、模型組、模型＋中藥組，每組5 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開始造模。模型組和模型＋中藥組連續(xù)7 d 給予2.5% DSS 水自由飲用（注：每隔1 d 配制新鮮的2.5% DSS 水），7 d 后換蒸餾水飲用4 d。造模11 d，中藥組及模型＋中藥組給予葛根黃連黃芩湯，灌胃劑量為2 g/（kg·d）?？瞻捉M及模型組給予生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 4組小鼠體質(zhì)量及疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分計(jì)算 實(shí)驗(yàn)期間每天記錄小鼠體質(zhì)量，同時(shí)采用疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分法觀察4 組小鼠體質(zhì)量、糞便黏稠度、糞便潛血的變化。① 質(zhì)量減輕評(píng)分：0≤體質(zhì)量下降百分比＜1%，評(píng)0 分；1%≤體質(zhì)量下降百分比＜5%，評(píng)1 分；5%≤體質(zhì)量下降百分比＜10%，評(píng)2 分；10%≤體質(zhì)量下降百分比＜15%，評(píng)3 分；體質(zhì)量下降百分比≥15%，評(píng)4 分。② 糞便黏稠度評(píng)分：正常大便成形，評(píng)0 分；大便松散，評(píng)2 分；腹瀉，評(píng)4 分。③ 糞便潛血評(píng)分：肉眼可見無血便，評(píng)0 分；隱血陽性，評(píng)2 分；顯性出血，評(píng)4 分。

DAI＝（體質(zhì)量減輕評(píng)分＋糞便黏稠度評(píng)分＋糞便潛血評(píng)分）/3

2.3.2 4 組小鼠結(jié)腸組織整體性狀觀察及長度測(cè)量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，隔天取材。采用脫頸法處死小鼠，取4 組小鼠結(jié)腸組織，平鋪于一次性濾紙上，觀察4 組小鼠結(jié)腸組織性狀的差異，同時(shí)做好標(biāo)記并測(cè)量4 組小鼠結(jié)腸組織的長度，取材過程中將小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行拍照，測(cè)量從盲腸到肛門這一段結(jié)腸的長度，隨后將其收集保存。

2.3.3 4 組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài)觀察 結(jié)腸組織從肛門位置起剪為3 段，所有結(jié)腸取靠近肛門端一段約0.5～0.8 cm 長度組織放于4%多聚甲醛溶液中固定，其余2 段組織將放入離心管中并立即放入液氮，隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱用于Western blot 和qPCR 實(shí)驗(yàn)。采用梯度脫水法包埋組織，將結(jié)腸組織石蠟包埋塊切成厚度為4 μm 的切片，進(jìn)行HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照。

2.3.4 Western blot 檢測(cè)4 組小鼠結(jié)腸組織中TLR4、p-P65、P65 蛋白表達(dá)量 結(jié)腸組織裂解后離心收集蛋白，并使用BCA 法進(jìn)行濃度測(cè)量。經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入相應(yīng)抗體TLR4、p-P65、P65（1∶1 000），搖床上4 ℃孵育過夜。一抗回收，將條帶置于二抗GAPDH、Vinculin（1∶5 000）中室溫孵育1.5 h。洗滌后，加入ECL 顯影液，用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS System）進(jìn)行顯影，最后使用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.3.5 免疫組化法分析4 組小鼠結(jié)腸組織中p-P65的蛋白定位及陽性表達(dá)率 將結(jié)腸石蠟塊切成厚度為4 μm 的切片，脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，然后按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。DAB 染色，蘇木素染核，樹脂封片并拍照，采用Image J 軟件分析系統(tǒng)對(duì)棕色顆粒（陽性表達(dá)）進(jìn)行半定量分析。

2.3.6 qPCR 法檢測(cè)4 組小鼠結(jié)腸炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達(dá)水平 提取4 組結(jié)腸組織總RNA，用NanoDrop2000 超微量分析儀測(cè)定RNA 濃度。利用 HiScript 1st Strand cDNA Synthesis kit 將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR?Select Master Mix kit 和IL-1β、IL-6、TNF-α 引物進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算4 組結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3.7 ELISA 法檢測(cè)4 組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量 從-80 ℃冰箱中取出4 組血清，試劑盒置于室溫下平衡30 min。按要求加樣、溫育、洗滌、顯色、終止，利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 下的OD 值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的濃度，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，2 組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 4組小鼠體質(zhì)量及DAI 評(píng)分的比較 空白組和中藥組在實(shí)驗(yàn)期間，體質(zhì)量呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)，且2 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量從第9 天起顯著下降（P＜0.05）；經(jīng)葛根黃連黃芩湯干預(yù)后，在第11 天模型＋中藥組小鼠體質(zhì)量較模型組則有所增加（P＜0.05）。在DAI 評(píng)分方面，空白組和中藥組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組小鼠的評(píng)分從第6 天起則顯著高于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，模型＋中藥組的DAI 評(píng)分從第9 天起顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 4 組小鼠體質(zhì)量及DAI 評(píng)分的比較

3.2 4組小鼠結(jié)腸組織整體性狀及長度比較 空白組及中藥組小鼠結(jié)腸組織黏膜表面光滑，無充血、水腫，無糜爛及潰瘍形成；模型組小鼠結(jié)腸組織的腸壁增厚，黏膜呈彌漫性充血、水腫，廣泛糜爛；而模型＋中藥組小鼠結(jié)腸組織的損傷程度則明顯改善。4 組結(jié)腸組織長度統(tǒng)計(jì)分析顯示：空白組及中藥組小鼠結(jié)腸組織長度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組的結(jié)腸組織長度明顯縮短（P＜0.05）；與模型組比較，模型＋中藥組的結(jié)腸長度則顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 4 組小鼠結(jié)腸組織整體性狀及長度的比較

3.3 4組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài) 空白組和中藥組小鼠結(jié)腸黏膜較為完整，杯狀細(xì)胞排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤；與空白組對(duì)比，模型組黏膜糜爛嚴(yán)重，杯狀細(xì)胞排列紊亂；與模型組對(duì)比，模型＋中藥組黏膜糜爛程度明顯減輕，正常杯狀細(xì)胞也明顯增多，且炎癥浸潤明顯減少。見圖3。

圖3 4 組小鼠結(jié)腸組織HE 染色圖（×200）

3.4 4組小鼠結(jié)腸組織中TLR4、p-P65 及P65 的蛋白表達(dá)量比較 空白組與中藥組間的TLR4 的蛋白表達(dá)量、p-P65/P65 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組中的TLR4、p-P65/P65 的蛋白表達(dá)量則顯著升高（P＜0.05）；經(jīng)葛根黃連黃芩湯干預(yù)后，模型＋中藥組中的TLR4、p-P65/P65 的蛋白表達(dá)量較模型組顯著減少（P＜0.05）。見圖4。

圖4 4 組小鼠結(jié)腸組織中TLR4、p-P65 及P65 蛋白表達(dá)量比較

3.5 4組小鼠結(jié)腸組織中p-P65 的蛋白定位及相對(duì)表達(dá)量比較 當(dāng)TLR4 受到外源刺激時(shí)，P65 被磷酸化后，能入核作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游促炎因子的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證p-P65 的入核，采用免疫組化法檢測(cè)該蛋白定位及蛋白表達(dá)量。空白組與中藥組間小鼠結(jié)腸組織中p-P65 的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中p-P65 的陽性表達(dá)率顯著升高（P＜0.05），且入核數(shù)量增加；與模型組比較，模型＋中藥組小鼠結(jié)腸組織中p-P65 的陽性表達(dá)率顯著降低（P＜0.05），且入核數(shù)量減少。見圖5。

圖5 4 組小鼠結(jié)腸組織中p-P65 的陽性表達(dá)比較（×400）

3.6 4組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較 qPCR 結(jié)果顯示：空白組與中藥組間IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，模型＋中藥組中的IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)水平則顯著降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 4 組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)水平比較

3.7 4組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較見表2。

表2 4 組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較（±s）

表2 4 組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

TNF-α/（ng/L）433.31±42.13 426.43±60.89 630.25±69.361）427.87±40.812）組別空白組中藥組模型組模型＋中藥組n4 4 4 4 IL-1β/（ng/L）79.70±7.85 82.72±3.01 102.37±12.781）81.24±4.112）IL-6/（pg/mL）44.64±3.44 44.65±7.70 67.62±13.041）47.43±4.892）

4 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種以局部組織損傷、腸道菌群失調(diào)、結(jié)腸炎癥為特征的疾病［13-14］。潰瘍性結(jié)腸炎主要表現(xiàn)為結(jié)腸中異常的炎癥反應(yīng)以及免疫微環(huán)境內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失調(diào)［15］。西醫(yī)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎還不能起到完全治愈的效果，且易引起胃腸道反應(yīng)的毒副作用。中醫(yī)藥對(duì)于治療炎癥性疾病具有較大的優(yōu)勢(shì)，通過多個(gè)藥物活性成分和多靶點(diǎn)來進(jìn)行預(yù)防治療，具有協(xié)同作用，且不良反應(yīng)小。本次研究發(fā)現(xiàn)，葛根黃連黃芩湯可以顯著改善DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸充血水腫情況，促進(jìn)結(jié)腸黏膜的修復(fù)，從而減輕小鼠腹瀉、便血等癥狀，證明了葛根黃連黃芩湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有保護(hù)作用。

葛根黃連黃芩湯由葛根、黃芩、黃連、炙甘草4 味藥物組成，具有解熱、抗菌、抗炎、抗病毒、解痙、抑制胃腸運(yùn)動(dòng)、抗缺氧、抗心律失常、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等藥理作用［16］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，葛根黃連黃芩湯主要化學(xué)成分包括葛根素、黃芩苷、小檗堿、甘草酸等，上述成分均能發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用［17-20］。葛根素能顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB 磷酸化和細(xì)胞上清中TNF-α 的分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)的加?。?1］。黃芩苷、甘草酸在炎癥反應(yīng)中也能起到很好的抑制作用［22-23］。小檗堿是一種能從多種植物中分離得到的生物堿，抗炎作用顯著［24］。以上研究均可作為葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎提供理論依據(jù)及物質(zhì)基礎(chǔ)。

在經(jīng)典的DSS 急性和慢性結(jié)腸炎小鼠模型中TLR4 基因表達(dá)增加［25］，而NF-κB 是炎癥性疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［26-27］，異常炎癥導(dǎo)致腸道內(nèi)促炎和抗炎細(xì)胞因子之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，進(jìn)而對(duì)結(jié)腸組織造成不可逆轉(zhuǎn)的病理性損害。本研究結(jié)果表明，DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中p65 被磷酸化后激活，且入核數(shù)量增加，隨之結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平顯著升高，提示經(jīng)DSS誘導(dǎo)后小鼠結(jié)腸組織中發(fā)生了明顯的炎癥反應(yīng)。在葛根黃連黃芩湯干預(yù)后能顯著抑制DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中P65 磷酸化及入核、以及促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平。這些結(jié)果均表明葛根黃連黃芩湯可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn)而降低DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的炎癥反應(yīng)，從而減輕結(jié)腸損傷。但葛根黃連黃芩湯含有多種中藥活性成分，但對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制、通路、具體作用靶點(diǎn)仍未明確。因此，今后需要從這些方面進(jìn)行深入探討，以期為葛根黃連黃芩湯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。