基于NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路探討益腎降糖飲對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

吳 競(jìng)，李鵬飛，丘余良，許勇鎮(zhèn)

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)廈門醫(yī)院，福建 廈門 361015）

糖尿病腎臟?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病的常見并發(fā)癥，其主要病理改變之一為腎小球系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增生，已成為我國終末期腎臟病構(gòu)成的重要因素［1-3］。我國2 型DKD 患者占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的30%～50%［4］。目前DKD的治療主要以控制血壓、血糖、血脂、蛋白尿?yàn)橹?，但這并不能完全阻止DKD 進(jìn)展，目前仍缺乏能有效防治或逆轉(zhuǎn)DKD 病程的藥物及方案。

細(xì)胞焦亡作為新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式，在DKD 發(fā)病中發(fā)揮著重要作用［5］。DKD 患者高糖、高胰島素、氧化應(yīng)激、微炎癥等因素均可誘導(dǎo)NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NLRP3）炎癥小體的活化，繼而介導(dǎo)半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）的成熟，促進(jìn)IL-1β 及IL-18 等炎性因子的釋放，激發(fā)細(xì)胞炎性反應(yīng)及細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致腎臟纖維化［6］。

益腎降糖飲是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院阮詩瑋教授創(chuàng)立，針對(duì)DKD 氣陰兩虛證有確切療效［7-10］。本研究觀察益腎降糖飲含藥血清對(duì)于高糖高胰島素培養(yǎng)下人腎小球系膜細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而闡明其臨床防治DKD 的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量（200±20 g），購自杭州醫(yī)學(xué)院，生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（浙）2019-00052，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)條件：環(huán)境安靜，自由攝食飲水，溫度為20～25 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，光照明暗循環(huán)各12 h。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（審批號(hào)：FJTCM IACUC 2021156）。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人腎小球系膜細(xì)胞（human mesangial cells，HMC）由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供（貨號(hào)：bncc341777）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 益腎降糖飲為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（批號(hào)：閩藥制字Z06106053）。藥物組成：何首烏40 g，玄參40 g，生地黃40 g，太子參40 g，黃芪40 g，山藥60 g，肉蓯蓉40 g，僵蠶40 g，當(dāng)歸40 g，赤芍40 g，蒼術(shù)20 g，馬齒莧60 g，黃芩20 g，鮮石橄欖60 g。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：11965092）、FBS（批號(hào)：10270-106）、PBS（批號(hào)：10010023）均購自美國Gibco 公司；RIPA 裂解液（批號(hào)：P0013B）、PMSF（批號(hào)：ST505）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0010）、5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（批號(hào)：P0015L）、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（批號(hào)：P0012A）、轉(zhuǎn)印緩沖液（批號(hào)：P0021）、電泳液（批號(hào)：P0014B）、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)：P0018FS）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白marker（美國Invitrogen 公司，批號(hào)：26617）；PVDF 膜（德國Millipore公司，批號(hào)：IEVH00005）、Caspase-1 antibody（批號(hào)：22915-1-AP）；NLRP3 antibody（批號(hào)：19771-1-AP）、GAPDH antibody（批號(hào)：60004-1-Ig）均購自Proteintech 公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；制冰機(jī)（常熟市雪科電器有限公司）；電泳儀、化學(xué)放光儀（上海天能科技有限公司）；純水儀（南京智拓儀器儀表有限公司）；定量PCR 儀、普通PCR 儀（美國ABI 公司）；酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 益腎降糖飲湯藥的制備 本次研究所需益腎降糖飲由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院制劑室自制提供，規(guī)格：250 mL/瓶。

2.2 益腎降糖飲含藥血清和空白血清制備 60 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組和低、中、高劑量組，每組15 只。低、中、高劑量組的給藥量依據(jù)人與大鼠體表面積換算方法，分別為人等效劑量的2.5、5、10 倍。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，空白組給予生理鹽水34 mL/（kg·d）灌胃，低、中、高劑量組分別給予濃度為0.39、0.78、1.56 g/mL益腎降糖飲混懸液34 mL/（kg·d）灌胃，每天2 次，持續(xù)7 d。最后1 次灌胃1 h 后，以20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，4 ℃靜置1 h 后離心機(jī)離心提取含藥血清和空白血清。收集的血清56 ℃下滅活補(bǔ)體30 min，放入-80 ℃冰箱保存。

2.3 模型制備和分組

2.3.1 HMC 復(fù)蘇、傳代 從液氮中取出人腎小球系膜細(xì)胞株，迅速復(fù)蘇接種于含10%胎牛血清的DMEM（10% FBS、1%雙抗）培養(yǎng)基中，以后每1～2 d完全更換培養(yǎng)液1 次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用0.25%胰酶消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，第3～4 代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 建立體外HMC 模型并分組干預(yù) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、密度適中的HMC 分為空白組，模型組，低、中、高劑量組?？瞻捉M采用10%的大鼠空白血清DMEM培養(yǎng)基；模型組在4.5 mg/mL葡萄糖、10 μg/mL胰島素誘導(dǎo)后，加濃度為10%大鼠空白血清干預(yù)；低、中、高劑量組在4.5 mg/mL 葡萄糖、10 μg/mL 胰島素誘導(dǎo)后，分別加濃度為10%的大鼠含濃度為0.39、0.78、1.56 g/mL 的益腎降糖飲含藥血清干預(yù)。5 組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 qPCR 檢測(cè)5組細(xì)胞NLPR3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 提取5 組細(xì)胞中RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再運(yùn)用qPCR 分別檢測(cè)Caspase-1、NLPR3、GAPDH mRNA 相對(duì)表達(dá)水平，引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，再以95 ℃，30 s→55 ℃，60 s→72 ℃，30 s 的條件循環(huán)擴(kuò)增35 次。qPCR 是在美國Applied Biosystems公司的StepOne? Real-Time PCR儀上完成，每個(gè)樣品均作3 個(gè)復(fù)孔，使用EnTurbo? SYBR Green PCR Super-Mix 試劑盒進(jìn)行（ELK Biotechnology，EQ001），實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct的方法進(jìn)行分析。

表1 引物序列

2.4.2 Western blot 檢測(cè)5 組細(xì)胞NLPR3、Caspase-1蛋白表達(dá)量 收集5 組HMC 蛋白，進(jìn)行4 次SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，然后顯色、拍照。結(jié)果采用ImageJ 軟件分析相對(duì)灰度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD 方法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 5組細(xì)胞Caspase-1、NLRP3 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較 見表2。

表2 5 組細(xì)胞Caspase-1、NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表2 5 組細(xì)胞Caspase-1、NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05。

NLRP3 1.12±0.19 3.28±0.581）2.52±0.332）2.11±0.262）3）1.64±0.302）3）組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組Caspase-1 0.99±0.17 3.07±0.311）2.32±0.282）1.73±0.252）3）1.46±0.222）3）

3.2 5組細(xì)胞Caspase-1、NLRP3蛋白表達(dá)量比較 見圖1、表3。

圖1 5 組細(xì)胞Caspase-1、NLRP3 蛋白條帶圖

表3 5 組細(xì)胞Caspase-1、NLRP3蛋白表達(dá)量比較（±s）

表3 5 組細(xì)胞Caspase-1、NLRP3蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05。

NLRP3 0.56±0.04 1.16±0.051）1.05±0.072）0.59±0.042）3）0.45±0.032）3）組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組Caspase-1 0.51±0.04 0.66±0.041）0.61±0.07 0.50±0.022）3）0.22±0.042）3）

4 討 論

細(xì)胞焦亡是一種促炎程序性細(xì)胞死亡方式，由Caspase-1 依賴性介導(dǎo)，釋放大量炎性因子，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［11］，其主要特點(diǎn)是細(xì)胞質(zhì)膜完整性喪失，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出［12］。細(xì)胞焦亡時(shí)，內(nèi)源性和外源性刺激信號(hào)刺激炎癥小體，介導(dǎo)Caspase-1 的成熟和釋放，切割下游GSDMD 蛋白，在膜內(nèi)側(cè)聚集形成孔道，水分子侵入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，繼而進(jìn)一步放大局部和全身炎癥反應(yīng)［13］。

近年來，糖尿病也被認(rèn)為是一種免疫炎癥性疾?。?4］，而DKD 也被證實(shí)與細(xì)胞焦亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激關(guān)系密切［15］。WANG 等［16］發(fā)現(xiàn)，對(duì)于高糖處理的大鼠系膜細(xì)胞，其NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平均升高，TXNIP/NLRP3 炎癥小體通路活化；沉默TXNIP 可抑制高糖誘導(dǎo)的TXNIP/NLRP3 炎癥小體通路活性，減輕系膜細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積。SAMRA 等［17］發(fā)現(xiàn)，對(duì)于STZ 誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型，其腎組織NLRP3 表達(dá)水平增加，IL-1β 表達(dá)水平升高。FENG 等［18］通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DKD 大鼠腎臟組織中炎癥小體NLRP3 及炎癥因子IL-1β 高表達(dá)，且經(jīng)高糖培養(yǎng)HMC 后發(fā)現(xiàn)NLRP3、Caspase-1 等焦亡相關(guān)蛋白陽性率增加，與劑量與時(shí)間呈正相關(guān)。糖尿病大鼠高血糖、血脂異常、高尿酸等因素協(xié)和作用，導(dǎo)致炎癥小體組分NLRP3、Caspase-1 高表達(dá)，引起細(xì)胞焦亡，產(chǎn)生腎臟損傷及腎臟纖維化［19］。因此，糖尿病腎臟病發(fā)生、發(fā)展中均伴隨著NLRP3 炎癥小體的活化，其活化因素包括了高糖、氧化應(yīng)激、微炎癥等多個(gè)方面。

阮詩瑋教授認(rèn)為DKD 基本病機(jī)為氣陰兩虛證，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)立了DKD 氣陰兩虛證基本方——益腎降糖飲，并開展為本院院內(nèi)制劑。我科通過不同的切入點(diǎn)，設(shè)計(jì)并完成系列臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明該方治療糖尿病腎臟病療效確切，具有抑制炎癥反應(yīng)、減少蛋白尿及延緩腎功能進(jìn)展的臨床療效［7-10］。王寶萍［20］研究發(fā)現(xiàn)DKD 患者血IL-18、尿IL-18 均高于健康組，且益腎降糖飲能顯著降低氣陰兩虛證DKD 患者血IL-18、尿IL-18 水平，療效優(yōu)于單純西藥治療。

本研究結(jié)果表明：糖尿病高糖及高胰島素狀態(tài)可以增加細(xì)胞焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1 的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)促進(jìn)了系膜細(xì)胞焦亡的發(fā)生。益腎降糖飲可以通過調(diào)控NLRP3、Caspase-1以抑制腎小球系膜細(xì)胞焦亡。本研究初步闡明了益腎降糖飲改善DKD 患者蛋白尿及腎功能的可能機(jī)制，為下一步動(dòng)物造模體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供體外初步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，對(duì)于指導(dǎo)糖尿病腎臟病的診療具有重要意義。