UPLC-MS/MS 法同時測定補(bǔ)中益氣丸（水丸）中6 種化合物含量

田小權(quán)，張加穩(wěn)，王 葳

（1.昆明市藥品不良反應(yīng)與藥物濫用監(jiān)測中心，云南 昆明 650000；2.昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650000；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500）

補(bǔ)中益氣丸是由李東垣精心鉆研的《脾胃論》中的名方補(bǔ)中益氣湯制成的丸劑，由炙黃芪、炙甘草、炒白術(shù)、黨參、當(dāng)歸、陳皮、柴胡和升麻等組成，主要功效為補(bǔ)中益氣、升陽舉陷[1-3]。研究表明，補(bǔ)中益氣丸中有效成分很多，主要包含黃酮類、皂苷類、揮發(fā)油、氨基酸及多糖類等[4]，具有抗氧化、抗炎、心血管和神經(jīng)保護(hù)等生理活性[5-6]。中藥的藥理作用是多個組分在藥效上的協(xié)同作用，強(qiáng)調(diào)藥物之間的整體作用，故中藥質(zhì)量評價應(yīng)對處方中多個有效組分的含量進(jìn)行定量分析考察。目前，2020 版《中國藥典》第一部收載了補(bǔ)中益氣丸（水丸）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對制劑中的甘草、當(dāng)歸、陳皮進(jìn)行薄層色譜定性分析，對黃芪甲苷單組分含量測定做了質(zhì)量控制以及對炙黃芪、炙甘草、炒白術(shù)、陳皮、黨參、升麻和柴胡進(jìn)行顯微鑒別，對其藥效質(zhì)量的分析評價存在局限性[7-8]。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報道多是采用高效液相色譜（highperformance liquid chromatography-tandem，HPLC）法測定補(bǔ)中益氣丸中的活性成分含量[9]，該法同時測定多種化合物時常遇到基質(zhì)干擾大、易出現(xiàn)假陽性、分離效果差，以及耗時較長等問題。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra-high-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS） 法已發(fā)展成為測定藥物中多組分有機(jī)物微量分析的重要方法[10]。鑒于對補(bǔ)中益氣丸（水丸）中多種活性成分含量同時測定的文獻(xiàn)報道較少，本文建立UPLC-MS/MS 法同時測定黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷等6 種化合物組分含量，旨在為該制劑的藥效質(zhì)量分析評價提供理論指導(dǎo)。

1 儀器與材料

超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（EXION-QTRAP 4500，美國AB 公司），超聲提取儀（SK8210HP，上?？茖?dǎo)公司），十萬分之一電子天平（MS205DU 型，梅特勒-托利多Mettler Toledo 公司），Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 色譜柱（填料:十八烷基硅烷鍵合硅膠2.1 × 100 mm，1.8 μm，美國Agilent 公司）；PES濾膜（0.22 μm，天津津騰有限公司）。黃芪甲苷（批號:110781-202118）、毛蕊異黃酮苷（111920-201606）、橙皮苷（批號:110721-202019）、阿魏酸（批號:110773-201915）、甘草酸（100551-202003）、甘草苷（批號:111610-201908）對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。補(bǔ)中益氣丸（水丸）由同藥集團(tuán)大同制藥有限公司制作，批號:171002。甲酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙腈（色譜純，默克股份兩合公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件

2.1.1 液相色譜條件 流速:0.35 mL/min；柱溫:40 ℃；進(jìn)樣量:10 μL；流動相A 為5 mmol/L 乙酸銨水溶液，流動相B 為甲醇（含0.1%甲酸）。洗脫梯度見表1。

表1 洗脫梯度

2.1.2 質(zhì)譜條件 正、負(fù)離子掃描；MRM 多反應(yīng)監(jiān)測；氣簾氣、離子源霧化氣、離子源輔助加熱氣分別設(shè)定為38 psi、55 psi 及55 psi，噴霧電壓為5 500 V，加熱器溫度為550℃；優(yōu)化后的監(jiān)測離子對（m/z）、去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）等結(jié)果參數(shù)見表2。

表2 6 種化合物的MRM 質(zhì)譜參數(shù)[11]

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別精密量取適量儲備液混合置容量瓶中，以70%甲醇溶液稀釋，制得標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，避光4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)至粉末狀，精密稱取0.5 g，將其置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，緊密封塞，搖勻，稱定重量，將超聲儀溫度調(diào)至30 ℃，超聲45 min，待錐形瓶冷卻至室溫后，補(bǔ)足重量，搖勻，過濾，精密量取25 mL，置100 mL 容量瓶中，70%甲醇定容至刻度線，即得供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 所測成分的定量下限（LLOQ）要求信噪比S/N＞10，6 次進(jìn)樣，計算平均峰面積精密度RSD≤10%。根據(jù)樣品含量預(yù)實驗測定，選擇6 個濃度的混合對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣（n=2），以目標(biāo)物定量離子對的平均峰面積計算進(jìn)樣質(zhì)量濃度（ng/mL）得線性回歸方程。6 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)混合液和樣品液的MRM 離子圖分別見圖1 和圖2，回歸方程線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r2）及LLOQ 見表3。結(jié)果顯示，在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)各化合物線性關(guān)系良好（r2為0.994～0.999）。

圖1 6 種化合物標(biāo)準(zhǔn)液的MRM 質(zhì)譜圖

圖2 樣品液中6 種化合物的MRM 質(zhì)譜圖

表3 6 種化合物的線性范圍、r2 和定量下限

2.4 精密度試驗 取質(zhì)量濃度為50 ng/mL（中濃度）的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷6 種化合物的平均峰面積，依次為2 189、5 616、3 471、3 187、3 288、7 364，計算得6 種化合物平均峰面積的RSD 分別為1.7%、2.3%、4.1%、5.6%、4.7%、3.8%。

2.5 重復(fù)性試驗 按照“2.2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，分別測定得到樣品中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷6 種化合物含量的RSD 分別為5.3%、7.5%、6.7%、8.3%、6.0%、4.2%，結(jié)果呈現(xiàn)良好的方法重復(fù)性。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取濃度為100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次進(jìn)樣測定存放第0、2、4、8、12、24、48 h的溶液中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.2%、2.5%、1.8%、3.2%、1.5%、0.9%，表明總體穩(wěn)定性良好，但阿魏酸穩(wěn)定性略偏低，可能是試樣前處理時被氧化。

2.7 加樣回收試驗 稱取已測定的補(bǔ)中益氣丸約0.5 g，精密加入低、中、高3 種質(zhì)量濃度的儲備混合液適量，每組平行6 份，按照“2.2.2”項下方法制備，依次測定各組分含量，計算回收率。結(jié)果顯示黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷的平均回收率分別為98.4%、101.7%、101.4%、86.7%、103.5%、93.7%，對應(yīng)的RSD 在3.8%～7.6%之間。

2.8 樣品含量測定 稱取補(bǔ)中益氣丸（水丸）供試品約0.5 g，按“2.2.2”項方法制備6 份供試液，分別分析供試品中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷的平均含量。結(jié)果見表4。

表4 供試品中6 種組分的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液制備 根據(jù)補(bǔ)中益氣丸（水丸）中6 種化合物組分的提取效率，對提取方法作了優(yōu)化研究：比較了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、純甲醇對供試液中6 種化合物提取效率的高低，結(jié)果表明70%甲醇更高，且峰形更好，原因可能是各化合物極性與該比例提取溶劑相近，流動相洗脫效率更高；比較了對供試液超聲10 min、20 min、30 min、45 min、60 min，結(jié)果表明超聲45 min 和60 min 提取效率明顯更高，但兩者無明顯差異，故選擇超聲時間為45 min。

3.2 色譜條件優(yōu)化 依據(jù)化合物性質(zhì)和色譜條件，研究對比了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸銨-水、甲醇-甲酸-水、含0.1%甲酸的甲醇-乙酸銨-水組成的流動相體系的洗脫效果。結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化后含0.1%甲酸的甲醇-乙酸銨-水混合體系對6 種化合物的洗脫效果更好，峰形對稱、分離度高。對超高效液相色譜柱Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18、MAbPac SCX-10 和ProPac Elite WCX 進(jìn)行分析，比較色譜峰形和分離度，結(jié)果顯示經(jīng)Agilent Zorbax Eclipse XDBC18 洗脫峰形更好，且出峰時間最短。

4 結(jié)論

本文建立了同時測定補(bǔ)中益氣丸（水丸）中6 種生物活性成分的UPLC-MS/MS 定量分析方法，其操作簡單、快速，6 種化合物的平均回收率均在86.7%～103.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。本實驗為補(bǔ)中益氣丸（水丸）中多組分定量檢測的質(zhì)量分析評價提供了參考。