槐定堿肟醚衍生物的合成、抗菌活性及分子對接研究

魏世洋, 李金坪, 伍亞晴, 李清文, 王立升

(1.廣西大學化學化工學院, 廣西南寧530004;2.浙江京新藥業(yè)股份有限公司, 浙江新昌312500;3.廣西大學醫(yī)學院, 廣西南寧530004)

0 引言

隨著抗生素的濫用,耐藥性的問題給醫(yī)療領(lǐng)域帶來了巨大的危害,增加了患者的二次感染概率同時容易感染其他疾病[1-3],已成為全球醫(yī)療工作者面對的巨大挑戰(zhàn),因此,尋找新結(jié)構(gòu)類型的抗菌藥物應對不斷變化的細菌感染疾病具有重要意義。

槐定堿是從苦參、山豆子等植物中提取的一種天然四環(huán)喹啉生物堿,分子式為C15H24N2O,相對分子質(zhì)量為248.36,白色粗針狀結(jié)晶?；倍▔A不僅擁有良好溶解性和生物安全性的特性,還具有廣泛的生物活性如抗菌[4]、抗腫瘤[5-6]、抗炎[7]和殺蟲[8]等活性,因此,常作為藥物的先導化合物。一方面,由于槐定堿特殊的內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu),14位C上的H位于羰基α位,性質(zhì)活潑,能在強堿條件下形成碳負離子,發(fā)生取代反應和親核取代-消去反應[9-11];另一方面,肟醚具有良好的抗腫瘤[12]、抗菌[13]和殺蟲[14]等生物活性,因此,科研人員常將基團引入到其他化學結(jié)構(gòu)中,從而達到增強抗菌活性的目的。Ramalingan等[15]合成了一系列取代哌啶-4-酮肟醚,并測試了其抗菌活性,抗菌實驗結(jié)果表明,當芐基單元的苯環(huán)上引入了吸電子基,可以使化合物的抗菌活性提高。李倩等[16]設(shè)計合成了一系列新型含肟醚結(jié)構(gòu)的丁烯內(nèi)酯類化合物,并測試了這些化合物的體內(nèi)抗菌活性,實驗結(jié)果表明,當芐基的苯環(huán)上存在鹵素取代和硝基等吸電子基取代時,抗菌活性要強于給電子基甲氧基取代的化合物。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

核磁共振儀(AVANCE Ⅲ HD600型,德國Bruker公司);超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(ImpactⅡ型,德國Bruker公司);酶標儀(Infinite E Plex型,帝肯奧地利有限公司)。槐定堿 (純度為98%,陜西昂盛生物科技有限公司);亞硝酸叔丁酯、雙(三甲基硅基)氨基鈉(NaHMDS)、氫化鈉(NaH)、溴芐及溴芐取代物均在上海安耐吉化學有限公司購買;所有試劑均為分析純或化學純。氟康唑(批號： 93MNRN8R)-白色假絲酵母;硫酸卡那霉素(批號： 9VEX2REK)-大腸桿菌;青霉素G鈉(批號： 97YRRM7D)-金黃色葡萄球菌;頭孢他啶(批號： 9DDADRLX)-銅綠假單胞菌#5336;鹽酸多西環(huán)素(批號： EH0RRQ4R)-痤瘡丙酸桿菌;以上標準品均購于上海安耐吉化學有限公司。

1.2 目標產(chǎn)物的合成

1.2.1 中間產(chǎn)物A的合成

稱取槐定堿10 g加入三頸燒瓶中,氮氣保護下分別加入無水四氫呋喃20 mL和雙(三甲基硅基)氨基鈉70 mL,常溫攪拌30 min。在冰浴條件下緩慢加入亞硝酸叔丁酯30 mL,加料完畢,在常溫下攪拌4～5 h。薄層色譜法(TLC)檢測產(chǎn)物,反應完畢后濃縮除去溶劑,反應體系用乙酸乙酯和水進行萃取,合并有機相,干燥,濃縮,將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層分析分離提純,使用乙酸乙酯與石油醚的體積比為3∶1的混合液洗脫,得到淡黃色固體A6.73 g,收率為68%,熔點為96 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 15.30 (s, 1H), 3.52 (dd,J=14.0, 4.7 Hz, 1H), 3.50～3.46 (m, 1H), 3.19 (dd,J=14.0, 11.6 Hz, 1H), 2.89 (ddt,J=11.9, 4.0, 1.9 Hz, 1H), 2.81～2.76 (m, 1H), 2.70 (ddd,J=15.6, 7.0, 3.7 Hz, 1H), 2.50 (ddd,J=15.4, 11.2, 3.9 Hz, 1H), 2.24 (ddt,J=13.9, 7.0, 4.2 Hz, 1H), 2.21～2.09 (m, 2H), 2.02 ～1.90 (m, 3H), 1.89～1.82 (m, 2H), 1.75～1.61 (m, 3H), 1.53 (dd,J=7.5, 2.3 Hz, 3H), 1.10 (tdd,J=12.8, 10.8, 4.4 Hz, 1H).13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 161.65, 142.17, 63.30, 55.94, 55.39, 50.63, 46.80, 39.83, 31.69, 29.76, 26.44, 26.39, 23.97, 21.47, 21.33。 HR-MS (ESI )： C15H23N3O2計算的質(zhì)荷比為278.179, 測試質(zhì)荷比為278.189[M + H]+。

1.2.2 目標化合物B1,B2,…,B12的合成

稱取A(0.01mol)2.78 g加入100 mL雙頸燒瓶中,加入氫化鈉,氮氣保護下加入無水四氫呋喃20 mL和溴芐(0.011 mol)1.88 g,反應4～6 h。TLC檢測產(chǎn)物,反應完畢后濃縮除去溶劑,調(diào)節(jié)pH為中性,用二氯甲烷和水進行萃取,合并有機相,干燥,濃縮,將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析分離提純,使用二氯甲烷與甲醇的體積比為50∶1的混合溶劑洗脫分離純化得到目標化合物B1,B2,…,B12?；倍▔A肟醚合成路線如圖1所示。

圖1 槐定堿肟醚合成路線Fig.1 Synthesis of sophoridine oxime ether

B1：14-(3,5-二甲氧基芐基)肟醚基槐定堿,淡黃色固體,收率為65%,熔點為106.3～106.5 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 6.54 (d,J=2.3 Hz, 2H), 6.42 (t,J=2.3 Hz, 1H), 5.27 (d, 2H), 4.46 (dd,J=12.8, 4.5 Hz, 1H), 4.01～3.95 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.21 (t,J=12.7 Hz, 1H), 2.91 (ddd,J=17.0, 8.1, 4.6 Hz, 1H), 2.83 (ddt,J=28.6, 11.2, 2.4 Hz, 2H), 2.51 (ddd,J=17.0, 9.8, 4.8 Hz, 1H), 2.19～2.10 (m, 2H), 1.98 (qd,J=12.5, 2.8 Hz, 2H), 1.86 (dt,J=13.7, 2.3 Hz, 1H), 1.81～1.77 (m, 1H), 1.77～1.69 (m, 2H), 1.65 (dddd,J=13.8, 11.6, 6.8, 3.2 Hz, 2H), 1.59～1.52 (m, 2H), 1.49～1.42 (m, 3H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 160.79, 159.55, 149.93, 139.16, 106.17, 100.06, 63.52, 57.17, 55.37, 52.62, 42.83, 41.90, 35.58, 27.62, 26.51, 23.09, 21.09, 20.71。 HR-MS (ESI )： C24H33N3O4計算的質(zhì)荷比為 428.247;測試質(zhì)荷比為428.243[M + H]+。

B2：14-(對叔丁基芐基)肟醚基槐定堿,淡黃色固體,收率為62%,熔點為124.3～124.6 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.39 (d,J=8.3 Hz, 2H), 7.34 (d,J=8.3 Hz, 2H), 5.31 (d,J=3.6 Hz, 2H), 4.46 (dd,J=12.8, 4.5 Hz, 1H), 3.97 (ddd,J=11.6, 7.3, 4.9 Hz, 1H), 3.21 (t,J=12.7 Hz, 1H), 2.89 (ddd,J=17.1, 8.2, 4.7 Hz, 1H), 2.86～2.78 (m, 2H), 2.50 (ddd,J=17.0, 9.7, 4.8 Hz, 1H), 2.13 (dt,J=13.7, 6.1 Hz, 2H), 1.98 (qd,J=12.1, 2.8 Hz, 2H), 1.86 (dt,J=13.7, 2.3 Hz, 1H), 1.82～1.77 (m, 1H), 1.76～1.70 (m, 2H), 1.64 (dddd,J=14.2, 9.7, 4.8, 2.4 Hz, 2H), 1.59～1.52 (m, 3H), 1.50～1.42 (m, 1H), 1.33 (s,9H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.62, 151.07, 149.68, 133.81, 128.33, 125.34, 77.32, 63.53, 57.20, 57.18, 52.61, 42.82, 41.88, 35.59, 34.58, 31.34, 27.64, 26.52, 23.07, 21.11, 20.76, 20.67。HR-MS (ESI )： C26H37N3O2計算的質(zhì)荷比為424.289;測試的質(zhì)荷比為： 424.292[M + H]+。

近年來，隨著“精益”被國內(nèi)醫(yī)療機構(gòu)逐漸認知，如何快速習得一套便實可用的精益醫(yī)療管理體系，為醫(yī)院精益管理的院內(nèi)實踐落地作戰(zhàn)略指導，并引領(lǐng)管理不斷推進，是每位精益學習院長期待的。

B3：14-(2-溴-5-甲氧基芐基)肟醚基槐定堿,白色固體,收率為59%,熔點為131.2～131.4 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.41 (d,J=8.7 Hz, 1H), 6.94 (d,J=3.1 Hz, 1H), 6.70 (dd,J=8.7, 3.1 Hz, 1H), 5.35 (s, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.63 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.54～3.41 (m, 1H), 3.25 (dd,J=13.8, 12.0 Hz, 1H), 3.01 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.85 (ddt,J=12.0, 3.9, 1.8 Hz, 1H), 2.76 (ddd,J=11.8, 8.5, 3.6 Hz, 1H), 2.49 (ddd,J=17.5, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.18～2.06 (m, 3H), 1.96 (dd,J=10.8, 9.0 Hz, 1H), 1.92～1.78 (m, 4H), 1.66 (ddt,J=12.8, 8.6, 4.1 Hz, 1H), 1.59 (ddd,J=15.3, 5.3, 3.6 Hz, 1H), 1.56～1.47 (m, 4H), 1.13～1.03 (m, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.70, 158.88, 150.14, 137.31, 133.20, 115.72, 114.73, 113.35, 76.62, 63.45, 56.04, 55.48, 54.97, 50.74, 47.60, 39.66, 32.38, 29.78, 25.16, 24.03, 21.61, 21.47, 21.41。HR-MS (ESI )： C24H34BrN3O3計算的質(zhì)荷比為 476.147;測試質(zhì)荷比為 476.141[M + H]+。

B4：14-(對硝基芐基)肟醚基槐定堿,淡黃色固體,收率為70%,熔點為113.9～114.1 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 8.21 (d,J=8.7 Hz, 2H), 7.52 (d,J=8.6 Hz, 2H), 5.42 (s, 2H), 3.65 (dd,J=13.9, 4.9 Hz, 1H), 3.51 (ddd,J=10.4, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.26 (dd,J=13.9, 12.0 Hz, 1H), 3.01 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.88 (ddt,J=12.0, 4.0, 1.8 Hz, 1H), 2.79 (ddd,J=12.1, 8.6, 3.7 Hz, 1H), 2.50 (ddd,J=17.6, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.20～2.13 (m, 2H), 2.11 (dd,J=12.1, 3.2 Hz, 1H), 2.00 ～1.96 (m, 1H), 1.93 ～1.81 (m, 4H), 1.73～1.65 (m, 1H), 1.64～1.57 (m, 2H), 1.55～1.51 (m, 3H), 1.10 (tdd,J=12.8, 11.3, 4.4 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.49, 150.52, 147.59, 144.56, 128.41, 123.67, 75.77, 63.43, 56.06, 54.98, 50.76, 47.63, 39.68, 32.40, 29.79, 25.12, 24.03, 21.66, 21.51, 21.43。HR-MS (ESI )： C22H28N4O4計算的質(zhì)荷比為 413.211;測試質(zhì)荷比為 413.221[M + H]+。

B5：14-(鄰硝基芐基)肟醚基槐定堿,白色固體,收率為72%,熔點為121～121.3 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ：8.05 (dd, J=8.2, 1.3 Hz, 1H), 7.61 (td,J=7.6, 1.3 Hz, 1H), 7.55 (dd,J=7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.48 ～7.42 (m, 1H), 5.73 (s, 2H), 3.63 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.50 (ddd,J=10.4, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.25 (dd,J=13.9, 12.0 Hz, 1H), 3.04 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.87 (ddt,J=12.0, 4.0, 1.8 Hz, 1H), 2.78 (td,J=8.4, 4.2 Hz, 1H), 2.53 (ddd,J=17.6, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.20 ～2.13 (m, 2H), 2.10 (dd,J=12.2, 3.2 Hz, 1H), 2.00 ～1.96 (m, 1H), 1.93 ～1.85 (m, 3H), 1.84 ～1.80 (m, 1H), 1.73 ～1.64 (m, 1H), 1.63 ～1.57 (m, 2H), 1.53 (dd,J=8.8, 6.2 Hz, 3H), 1.09 (tdd,J=12.8, 11.3, 4.3 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ：159.47, 150.74, 147.52, 133.95, 133.53, 129.05, 128.36, 124.76, 73.81, 63.45, 56.06, 54.98, 50.77, 47.60, 39.67, 32.42, 29.78, 25.14, 24.05, 21.65, 21.51, 21.43。HR-MS (ESI )： C22H28N4O4計算的質(zhì)荷比為 413.211;測試質(zhì)荷比為 413.221[M + H]+。

B6：14-(間硝基芐基)肟醚基槐定堿,灰白色固體,收率為63%,熔點為94.5～94.7 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 8.21 (d,J=1.9 Hz, 1H), 8.17 (dt,J=8.2, 1.5 Hz, 1H), 7.70 (dt,J=7.6, 1.4 Hz, 1H), 7.54 (t,J=7.9 Hz, 1H), 5.42 (s, 2H), 3.65 (dd,J=13.9, 4.9 Hz, 1H), 3.51 (ddd,J=10.5, 8.4, 4.1 Hz, 1H), 3.27 (dd,J=13.8, 12.0 Hz, 1H), 3.03 (ddd,J=17.5, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.88 (ddt,J=11.9, 4.0, 1.8 Hz, 1H), 2.79 (ddd,J=11.9, 8.6, 3.7 Hz, 1H), 2.51 (ddd,J=17.6, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.21～2.09 (m, 3H), 1.99 (dd,J=10.7, 9.0 Hz, 1H), 1.94～1.81 (m, 5H), 1.73～1.65 (m, 1H), 1.65～1.50 (m, 4H), 1.15～1.06 (m, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.53, 150.57, 148.34, 139.32, 133.96, 129.44, 122.95, 122.74, 75.74, 63.47, 56.06, 54.98, 50.77, 47.65, 39.69, 32.41, 29.79, 25.12, 24.06, 21.62, 21.53, 21.41。HR-MS (ESI )： C22H28N4O4計算的質(zhì)荷比為 413.211; 測試質(zhì)荷比為 413.221[M + H]+。

B7：14-(2,5-二氯芐基)肟醚基槐定堿,黃色油狀液體,收率為58%。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.37 (d,J=2.5 Hz, 1H), 7.29 (d,J=5.0 Hz, 1H), 7.22 (dd,J=8.5, 2.5 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 3.67 (dd,J=13.9, 4.9 Hz, 1H), 3.55 ～3.50 (m, 1H), 3.28 (dd,J=13.8, 12.0 Hz, 1H), 3.05 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.89 (ddt,J=11.9, 4.0, 1.8 Hz, 1H), 2.79 (td,J=8.5, 4.3 Hz, 1H), 2.53 (ddd,J=17.5, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.22～2.10 (m, 3H), 2.00 (dd,J=10.7, 9.1 Hz, 1H), 1.94～1.82 (m, 4H), 1.75～1.66 (m, 1H), 1.65～1.51 (m, 5H), 1.16～1.07 (m, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.61, 150.50, 136.69, 132.67, 131.26, 130.47, 129.14, 128.99, 73.85, 63.48, 56.08, 54.98, 50.78, 47.63, 39.69, 32.43, 29.77, 25.14, 24.05, 21.62, 21.51, 21.39。HR-MS (ESI )： C22H27Cl2N3O2計算的質(zhì)荷比為436.148;測試質(zhì)荷比為 436.150[M + H]+。

B8：14-(2,6-二氯芐基)肟醚基槐定堿,淡黃色油狀液體,收率為70%。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.35 (d,J=8.1 Hz, 2H), 7.24 (dd,J=8.5, 7.6 Hz, 1H), 3.67 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.48 (ddd,J=10.3, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.30 (dd,J=13.8, 11.9 Hz, 1H), 2.97～2.86 (m, 2H), 2.79 (td,J=9.0, 4.6 Hz, 1H), 2.43 (ddd,J=17.6, 11.1, 5.0 Hz, 1H), 2.11 (dt,J=13.9, 4.0 Hz, 2H), 1.99 (dd,J=10.7, 9.1 Hz, 1H), 1.88 (ddt,J=23.8, 13.3, 4.0 Hz, 3H), 1.78～1.66 (m, 2H), 1.66～1.59 (m, 1H), 1.58～1.47 (m, 3H), 1.13 (s, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.81, 150.00, 137.38, 131.77, 130.36, 128.36, 71.76, 63.53, 56.08, 54.99, 50.78, 47.63, 39.68, 32.42, 29.82, 25.13, 24.08, 21.62, 21.44, 21.22。HR-MS (ESI )： C22H27Cl2N3O2計算的質(zhì)荷比為436.148;測試質(zhì)荷比為 436.159[M + H]+。

B9：14-(2-甲基萘基)肟醚基槐定堿,白色固體,收率為63%,熔點為112.3～112.5 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 8.11～8.07 (m, 1H), 7.90～7.84 (m, 2H), 7.57～7.50 (m, 3H), 7.46 (dd,J=8.2, 7.0 Hz, 1H), 5.80 (d,J=1.3 Hz, 2H), 3.67 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.46 (ddd,J=10.4, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.30 (dd,J=13.8, 11.9 Hz, 1H), 2.93 (ddd,J=17.6, 6.4, 4.6 Hz, 1H), 2.88 (ddd,J=11.9, 4.1, 2.0 Hz, 1H), 2.78 (ddd,J=11.7, 8.7, 3.2 Hz, 1H), 2.43 (ddd,J=17.6, 11.2, 5.0 Hz, 1H), 2.19～2.05 (m, 4H), 1.99～1.96 (m, 1H), 1.94～1.81 (m, 4H), 1.74～1.65 (m, 1H), 1.64～1.58 (m, 1H), 1.51 (ddt,J=12.7, 10.4, 4.7 Hz, 4H), 1.11 (tdd,J=12.8, 11.2, 4.3 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.93, 149.77, 133.70, 132.29, 131.96, 129.19, 128.56, 127.54, 126.35, 125.81, 125.31, 124.13, 76.07, 63.50, 56.08, 54.98, 50.77, 47.64, 39.66, 32.41, 29.83, 25.12, 24.07, 21.62, 21.44, 21.38。HR-MS (ESI )： C26H31N3O2計算的質(zhì)荷比為418.242, 測試質(zhì)荷比為418.251[M + H]+。

B10：14-(對氰基芐基)肟醚基槐定堿,白色固體,收率為70%,熔點為103.5～103.7 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.65 (d,J=8.2 Hz, 2H), 7.46 (d,J=8.1 Hz, 2H), 5.38 (s, 2H), 3.65 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.50 (ddd,J=10.4, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.27 (dd,J=13.8, 12.0 Hz, 1H), 3.00 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.88 (ddd,J=12.0, 4.1, 2.0 Hz, 1H), 2.79 (ddd,J=12.2, 8.8, 3.7 Hz, 1H), 2.49 (ddd,J=17.5, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.19～2.09 (m, 3H), 1.99 (dd,J=10.7, 9.0 Hz, 1H), 1.95～1.80 (m, 5H), 1.68 (ddt,J=12.7, 8.6, 4.1 Hz, 1H), 1.64～1.59 (m, 1H), 1.59～1.49 (m, 3H), 1.10 (tdd,J=12.8, 11.3, 4.3 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.52, 150.39, 142.53, 132.26, 128.37, 118.73, 111.74, 76.09, 63.44, 56.06, 54.98, 50.76, 47.62, 39.68, 32.40, 29.80, 25.12, 24.04, 21.67, 21.49, 21.45。HR-MS (ESI )： C23H28N4O2計算的質(zhì)荷比為393.211;測試質(zhì)荷比為 393.232[M + H]+。

B11：14-(2-氰基芐基)肟醚基槐定堿,白色固體,收率為72%,熔點為107.4～107.7 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.66 (d,J=7.6 Hz, 1H), 7.57 (d,J=7.5 Hz, 1H), 7.53 (d,J=7.7 Hz, 1H), 7.43 ～7.38 (m, 1H), 5.49 (s, 2H), 3.62 (dd,J=13.9, 4.9 Hz, 1H), 3.47 (ddd,J=10.4, 8.4, 4.1 Hz, 1H), 3.24 (dd,J=13.9, 12.0 Hz, 1H), 3.03 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.5 Hz, 1H), 2.86 (ddd,J=11.6, 4.1, 2.0 Hz, 1H), 2.76 (ddd,J=11.9, 8.7, 3.5 Hz, 1H), 2.50 (ddd,J=17.0, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.18～2.07 (m, 3H), 1.96 (dd,J=10.7, 9.0 Hz, 1H), 1.92～1.78 (m, 4H), 1.72～1.62 (m, 1H), 1.62～1.47 (m, 4H), 1.13～1.02 (m, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.55, 150.76, 140.57, 133.12, 132.85, 129.59, 128.55, 117.27, 111.95, 74.70, 63.46, 56.04, 54.98, 50.76, 47.62, 39.66, 32.37, 29.78, 25.12, 24.05, 21.59, 21.42, 21.40。HR-MS (ESI )： C23H28N4O2計算的質(zhì)荷比為393.211;測試質(zhì)荷比為 393.232[M + H]+。

B12：14-(3-硝基-4氟-芐基)肟醚基槐定堿,白色固體,收率為63%,熔點為117.9～118.1 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 8.06 (dd,J=7.1, 2.2 Hz, 1H), 7.66 (ddd,J=8.5, 4.2, 2.2 Hz, 1H), 7.34～7.26 (m, 1H), 5.35 (s, 2H), 4.44 (dd,J=12.8, 4.5 Hz, 1H), 3.23 (t,J=12.7 Hz, 1H), 2.92 (ddd,J=17.0, 8.0, 4.6 Hz, 1H), 2.83 (ddt,J=29.4, 11.4, 2.3 Hz, 2H), 2.52 (ddd,J=16.9, 9.9, 4.8 Hz, 1H), 2.24～2.12 (m, 2H), 2.05～1.94 (m, 2H), 1.90～1.86 (m, 1H), 1.77～1.62 (m, 5H), 1.56 (ddd,J=13.6, 6.9, 3.7 Hz, 2H), 1.49～1.44 (m, 3H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.11, 156.00, 154.24, 151.02, 135.20, 125.58, 118.51, 75.00, 63.43, 57.16, 52.63, 42.87, 41.94, 35.57, 27.61, 26.50, 23.04, 21.08, 20.79, 20.73。HR-MS (ESI )： C23H27FN4O4計算的質(zhì)荷比為430.202;測試質(zhì)荷比為431.198[M + H]+。

1.3 目標化合物的抑菌活性測試

首先根據(jù)標準方法分別配置各受試細菌的培養(yǎng)基(肉湯)以及各受試細菌,然后稱取待測化合物32 mg完全溶解于二甲基亞砜10 μL,并用肉湯990 μL將其稀釋?？咕鷮嶒灢捎枚断♂尫y試目標化合物抑菌活性。每孔預先加入肉湯100 μL,用微量移液槍吸取已配制樣品液100 μL加入酶標板孔1中,用移液槍吹打3次后吸取孔1的樣品液100 μL加入孔2中。重復操作至孔8后,從孔8中吸取100 μL棄去,最終樣品液質(zhì)量濃度分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL,同時設(shè)置3個平行組。除空白對照外其余每孔中加入菌液5 μL,然后把96孔板放置培養(yǎng)箱中待培養(yǎng)到對數(shù)期,用酶標儀測其波長為600 nm的吸光度OD600,平行孔中的OD600值之差在標準誤差范圍內(nèi),說明所得數(shù)值可信,依據(jù)所得數(shù)據(jù)再設(shè)定適宜的濃度梯度篩出各待測化合物的最小抑菌濃度(mininal inhibit concentration, MIC),頭孢他啶、青霉素、硫酸卡那霉素、氟康唑、多西環(huán)素分別作為銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色假絲酵母和痤瘡丙酸桿菌的抑菌實驗中的陽性對照藥,肉湯作為陰性對照。

1.4 分子對接

首先根據(jù)體外抗菌實驗的菌種選擇相應的蛋白,通過網(wǎng)站RCSB PDB數(shù)據(jù)庫選擇受體蛋白[17],篩選出受體蛋白(PDB ID：6GVB)。Reichenbach等[18]的研究結(jié)果表明,痤瘡丙酸桿菌相關(guān)蛋白(PDB ID：6GVB)是一種功能性二聚外顯β-1,4-甘露糖苷酶,它能夠催化經(jīng)典真核N-聚糖核心中第2個GlcNAc和第1個甘露糖殘基之間的β-1,4-糖苷鍵的水解。在對接軟件Discovery studio導入合成的槐定堿衍生物3D結(jié)構(gòu)與受體蛋白進行對接,當配體對接到蛋白質(zhì)受體時,對接軟件將小分子放在靶標蛋白的活性位點處,通過不斷的優(yōu)化調(diào)整配體化合物的空間位置、構(gòu)象和受體氨基酸殘基,在所有構(gòu)象中尋找到配體化合物與受體蛋白作用的最佳構(gòu)象,觀察配體化合物與受體蛋白的結(jié)合方式與相互作用。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 合成

中間體A的制備過程,在除去溶劑階段必須把溶劑和未反應完全的亞硝酸叔丁酯除凈,否則在萃取時會導致產(chǎn)物收率下降,該反應條件溫和,后處理容易,收率高可以達到68%。中間體A上的肟雙鍵存在順反異構(gòu),關(guān)鍵中間體A的絕對構(gòu)型如圖2所示。從圖2中可以看到,中間體A為反式構(gòu)型。

圖2 中間體A的絕對構(gòu)型Fig.2 Absolute configuration of intermediate A

化合物B1的1H NMR結(jié)構(gòu)顯示,化學位移分別為6.5、6.42的雙重峰和三重峰為苯環(huán)上H,化學位移為5.27的雙重峰為芐基碳上H,化學位移為3.80的單重峰為苯環(huán)上2個甲氧基上的H,化學位移為3.21的三重峰為槐定堿的特征H,同時化學位移為15.30的羥基單重峰消失。以上實驗結(jié)果說明,溴芐上的溴原子被14-肟基槐定堿取代得到目標化合物。

2.2 抗菌活性

目標化合物的抗菌活性實驗結(jié)果見表1。

表1 目標化合物的抗菌活性實驗結(jié)果Tab.1 Experimental results of antibacterial activity of target compounds

從表1可見,大部分目標化合物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金色葡萄球菌和白色假絲酵母的抑制效果一般,但在一定程度上提高了槐定堿母體的抗菌活性,其中化合物B4對大腸桿菌的抑制效果最好,MIC為3.127 mg/mL;化合物B5對銅綠假單胞菌、白色假絲酵母的抑制效果最好,MIC分別為4.568、6.372 mg/mL;化合物B12對金色葡萄球菌的抑制效果最好,MIC為1.337 mg/mL。大部分化合物對痤瘡丙酸桿菌的抑制效果較好,其中化合物B5、B12對痤瘡丙酸桿菌的抑制效果最好,MIC分別為0.023、0.014 mg/mL,優(yōu)于陽性對照藥物鹽酸多西環(huán)素。

初步構(gòu)效分析,對于痤瘡丙酸桿菌,含有吸電子基團的化合物一般有優(yōu)良的活性(B4、B5、B6、B7、B8、B12),而給電子的基團一般活性較差(B1、B2、B3、B9);對于大腸桿菌,當苯環(huán)對位上存在強吸電子基(B4)時,抗菌活性最好?？傮w來看,當苯環(huán)上有吸電子基取代時抗菌活性要強于給電子基,同時吸電子基中硝基取代體現(xiàn)出更強的抗菌活性,但是不同細菌對取代基的取代位置要求不同,當硝基位于對位時對大腸桿菌的抑制效果最好,而硝基位于鄰位時對痤瘡丙酸桿菌的抑制效果最好要強于良性對照藥物。

2.3 分子對接

篩選痤瘡丙酸桿菌相關(guān)蛋白(PDB ID：6GVB)與槐定堿和抑制效果優(yōu)于陽性對照藥的化合物B5、B12進行分子對接,進一步研究目標化合物的抑菌機制,對接結(jié)果如圖3所示?；倍▔A、化合物B5和B12與6GVB相互作用見表2

表2 槐定堿、化合物 B5、B12與6GVB相互作用Tab.2 Interaction of sophoridine, compounds B5 and B12 with 6GVB

(a) 2D圖 (b) 分子作用圖 (c) 3D圖

從表2可見,槐定堿與6GVB受體蛋白的氨基酸殘基并沒有氫鍵作用和π-π共軛作用,只是有一些弱的作用力,對痤瘡丙酸桿菌的抑制效果較差,與抗菌實驗結(jié)果相符。從圖3可見,①苯環(huán)上硝基和ASN A：139、SER A：88之間形成氫鍵作用;②肟上的氧原子與SER A：89之間形成氫鍵作用;③B5的苯環(huán)和與受體蛋白上多個氨基酸殘基形成了π-π共軛作用和其他弱作用力。B12與6GVB受體蛋白分子對接如圖3所示：①苯環(huán)上硝基和氟原子與TRP A：217、ASN A：139、SER A：88形成氫鍵作用;②肟上的氧原子與SER A：89之間形成氫鍵作用;③B12的苯環(huán)和與受體蛋白上多個氨基酸殘基形成了π-π共軛作用和其他弱作用。

綜合分析,化合物B5、B12與6GVB受體蛋白的相互作用強于槐定堿。受體蛋白與化合物B5、B12之間具有較強的作用,大大地增強了二者之間的結(jié)合力和穩(wěn)定性,從而增強抑菌活性。

3 結(jié)論

本文中設(shè)計合成了12個槐定堿肟醚類衍生物,所有目標化合物經(jīng)過1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS進行了結(jié)構(gòu)表征,表征結(jié)果與目標化合物結(jié)構(gòu)一致。對目標化合物及槐定堿測試了銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痤瘡丙酸桿菌和白色假絲酵母的抑菌活性。實驗結(jié)果表明槐定堿的抑菌效果并不理想,改造之后的槐定堿衍生物的抑菌活性相比于槐定堿有所提升。值得一提的是,化合物B5、B12對痤瘡丙酸桿菌的抑制效果要優(yōu)于陽性對照藥物多西環(huán)素,MIC為0.023、0.014 mg/mL。分子對接結(jié)果表明,B5、B12與6GVB受體蛋白存在多個氫鍵和π-π共軛作用,增加了化合物與受體蛋白之間的結(jié)合力與穩(wěn)定性。受體蛋白與小分子之間相互作用越強抑菌效果越好,與抗菌實驗結(jié)果相符。該研究結(jié)果為進一步開發(fā)治療痤瘡丙酸桿菌藥物提供了有益參考。