超聲輔助蒸餾提取肉桂油的成分與抗氧化活性

凌霄宇, 蘇通明, 羅軒, 謝新玲, 紀(jì)紅兵,2, 秦祖贈(zèng)*

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 廣西南寧530004;2.中山大學(xué)精細(xì)化工研究院, 廣東廣州510275)

0 引言

肉桂(CinnamomumCassiaPresl)屬樟科樟屬植物,主要產(chǎn)自我國(guó)廣西、廣東等地[1],在世界五大洲40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有出產(chǎn)。肉桂油可從肉桂的枝、葉、樹皮中提取,其最主要的成分為肉桂醛,在食品、香料、催化等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[2]。肉桂油中還含有具有殺菌與抗癌功效的鄰甲氧基肉桂醛[3],極具醫(yī)用價(jià)值。傳統(tǒng)提取方法水蒸氣蒸餾[4]提取率低,為了提高產(chǎn)量,近年來有研究者使用了超聲波[5]、微波[6]、超臨界CO2[7]等外場(chǎng)強(qiáng)化技術(shù)提取精油[8]。如Jeyaratnam等[9]通過微波加熱法提取肉桂油,發(fā)現(xiàn)肉桂油中含氧化合物的含量比水蒸氣蒸餾法的高出9%,具有更強(qiáng)的殺菌能力。類似地,Modi等[10]使用超聲輔助蒸餾提取肉桂油,研究發(fā)現(xiàn)超聲技術(shù)能使肉桂的表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化,使其提取效率更高,相較水蒸氣蒸餾在相同提取率下CO2排放量更低,更符合當(dāng)下綠色可持續(xù)發(fā)展的理念。

人體在自然代謝過程中會(huì)產(chǎn)生自由基,堆積量過多會(huì)導(dǎo)致氧化損傷[11],人們需要通過攝取抗氧化劑對(duì)體內(nèi)的自由基進(jìn)行清除以保持身體健康[12]。目前合成抗氧化劑在市場(chǎng)上占主導(dǎo)地位,但可能對(duì)人體存在毒副作用。天然抗氧化劑的毒副作用遠(yuǎn)低于合成抗氧化劑,隨著人們的健康意識(shí)不斷提高,天然抗氧化劑在市場(chǎng)上越發(fā)受到歡迎[13]。研究表明,肉桂屬植物具有抗炎鎮(zhèn)痛、殺菌消毒的藥理活性[14],肉桂油對(duì)各種細(xì)菌、真菌菌株顯示出良好的抗菌能力,肉桂油還可作為天然藥物替代合成藥物用于高血糖、高血脂等疾病的治療。植物精油可作為天然抗氧化劑用于替代合成抗氧化劑[15]。

目前對(duì)于肉桂油中各成分含量與抗氧化活性強(qiáng)弱關(guān)系的研究鮮見涉及。本文中使用超聲輔助蒸餾提取肉桂油,考察超聲功率、超聲時(shí)間、脈沖比對(duì)提取率的影響并確定最佳工藝條件,并使用掃描電鏡觀測(cè)超聲前后肉桂葉的微觀形貌差異。通過GC-MS對(duì)肉桂油成分進(jìn)行分析,并通過二苯基苦基苯胼(DPPH)自由基清除測(cè)試,采用鐵離子還原法(FRAP)評(píng)價(jià)肉桂油中成分的抗氧化活性。對(duì)超聲輔助蒸餾的優(yōu)勢(shì),肉桂枝、葉中成分的含量差異,肉桂油中具有抗氧化活性的成分等開展研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

肉桂原料由廣西庚源香料有限責(zé)任公司提供。取其葉片和細(xì)枝為實(shí)驗(yàn)材料,剪切后清洗10 min去除表面的污垢,在25 ℃環(huán)境溫度下避光干燥14 d直至質(zhì)量不再變化。干燥后用粉碎機(jī)粉碎、過孔徑為425 μm的標(biāo)準(zhǔn)篩網(wǎng),密封儲(chǔ)存于陰涼干燥處備用。實(shí)驗(yàn)用色譜甲醇為HPLC級(jí),二氯甲烷、無水乙醇、無水硫酸鈉、DPPH、TPTZ、L-抗壞血酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛、香豆素均為AR級(jí)。

氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC MS-QP2020型,日本島津公司);場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(SEM, Hitachi SU8220型,日本日立公司);雙光束紫外可見光分光光度計(jì)(TU-1901型,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);微波超聲組合萃取儀(XA-300A+型,北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)。

1.2 水蒸氣蒸餾

水蒸氣蒸餾(SD)：準(zhǔn)確稱取50 g粉碎的肉桂以質(zhì)量比1∶5加入去離子水,在常溫下浸潤(rùn)處理30 min后,轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室自制玻璃提取柱中蒸餾30 min至餾出液澄清(提取完全)。收集餾出液并使用二氯甲烷萃取3次,取下層溶液加入足量無水硫酸鈉除去水分,得有特殊氣味的淡黃色肉桂油,按式(1)計(jì)算肉桂油提取率,置于3 ℃以下保存待用;通過有機(jī)濾膜除盡雜質(zhì)后進(jìn)行GC-MS分析。

y=m/M×100%,

(1)

式中：y為肉桂油提取率,%;m為肉桂油產(chǎn)量,g;M為肉桂的質(zhì)量,g。

1.3 超聲輔助蒸餾

超聲輔助蒸餾(USD)：準(zhǔn)確稱取50 g粉碎的肉桂以質(zhì)量比1∶5加入去離子水,分別設(shè)置不同的超聲功率、超聲時(shí)間、脈沖比,超聲處理一段時(shí)間后,轉(zhuǎn)移至玻璃提取柱中,按1.2節(jié)方法蒸餾肉桂油并計(jì)算提取率,置于3 ℃以下保存待用;通過有機(jī)濾膜除盡雜質(zhì)后進(jìn)行GC-MS分析。

1.4 掃描電鏡

使用SEM,對(duì)浸潤(rùn)處理、超聲處理、水蒸氣蒸餾及超聲輔助蒸餾后的肉桂葉樣品圖像進(jìn)行采集。測(cè)試樣品干燥后貼于導(dǎo)電膠上,濺射噴金后進(jìn)行SEM觀察。所有的測(cè)試樣品都是在高真空條件下,在5 kV的加速電壓和20 μm的分析工作距離下觀測(cè)微觀形貌。

1.5 GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱為SH-Rxi-5Sil MS,自動(dòng)進(jìn)樣器,進(jìn)樣量為2 μL,氣體體積流速為1.63 mL/min;進(jìn)樣口、連接口溫度為250 ℃;柱溫初始溫度為50 ℃,保持0.5 min,以20 ℃/min的速率升至100 ℃,保持1 min,再以7 ℃/min的速率升至250 ℃。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源EI;電離能為70 eV;離子源溫度為250 ℃;四級(jí)桿溫度為200 ℃;質(zhì)量掃描范圍為15～500 amu。通過工作站的美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院出版的譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)(NIST)進(jìn)行初步檢索確定化合物成分,歸一化法計(jì)算成分的相對(duì)含量。

1.6 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法,稱取DPPH粉末于500 mL棕色容量瓶中,以無水乙醇定容配置濃度為100 μmol/L的紫色DPPH溶液,置于暗處冷藏備用。用移液槍取多組DPPH溶液2 mL,分別加入不同質(zhì)量濃度的肉桂油溶液2 mL混合搖勻,于避光處充分反應(yīng)60 min后,測(cè)定其在517 nm處的吸光度值,記為A1。以加入無水乙醇2 mL作參照組,測(cè)定其在517 nm處的吸光度值,記為A0。按相同方法測(cè)試鄰甲氧基肉桂醛、肉桂醛、香豆素的吸光度值,以L-抗壞血酸為對(duì)照,按式(2)計(jì)算肉桂油的DPPH自由基清除率。

Y=(A0-A1)/A0×100%,

(2)

式中：Y為DPPH自由基清除率,%;A1為精油溶液吸光度值;A0為乙醇溶液吸光度值。

1.7 總抗氧化能力FRAP測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法略作調(diào)整,稱取三吡啶基三嗪(TPTZ)粉末于500 mL棕色容量瓶中,加入0.15 mol冰醋酸提供酸性環(huán)境,以無水乙醇定容配置濃度為10 mmol/L的TPTZ溶液。稱取FeCl3·6H2O粉末以去離子水定容配置濃度為20 mmol/L的Fe3+溶液,并與TPTZ溶液等體積混合為FRAP工作液。用移液槍取多組FRAP工作液3.8 mL,分別加入不同質(zhì)量濃度的FeSO4溶液0.2 mL混合搖勻,于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min,測(cè)量其在597 nm處的吸光度并繪制FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線,如式(3)所示：

B=0.001 11cFeSO4+0.005 66,R2=0.999 9,

(3)

式中：B為溶液吸光度值;cFeSO4為FeSO4濃度,μmol/L。

以精油的總抗氧化能力達(dá)到同樣吸光度所需FeSO4濃度(FRAP值)表示：1FRAP=1 mmol/L FeSO4,按相同方法測(cè)試肉桂油、鄰甲氧基肉桂醛、肉桂醛、香豆素的FRAP值,以L-抗壞血酸為對(duì)照,對(duì)吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合得到L-抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,如式(4)所示。

C=0.003 23cL+0.049 29,R2=0.999 3,

(4)

式中：C為溶液吸光度值;cL為L(zhǎng)-抗壞血酸濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助蒸餾單因素分析

超聲輔助蒸餾單因素實(shí)驗(yàn)使用肉桂葉為原料,分別研究了超聲功率、超聲時(shí)間、脈沖比對(duì)肉桂油提取率的影響,結(jié)果如圖1至圖3所示。根據(jù)圖1可知,肉桂油提取率隨著超聲功率的增大呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率較小時(shí),肉桂的細(xì)胞沒有被完全破壁,增大超聲功率能有效提高超聲波的空化作用,使得肉桂細(xì)胞被破壁,使精油成分更容易滲出。而當(dāng)超聲功率過大時(shí),超聲探針發(fā)熱可能會(huì)使得肉桂油中的熱敏成分被降解,導(dǎo)致提取率的降低,因此選擇超聲功率為275 W較為適宜。

圖1 超聲功率對(duì)肉桂油提取率的影響Fig.1 Effect of the ultrasound power on oil yield

根據(jù)圖2可知,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),肉桂油的提取率逐漸升高,并在30 min時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),肉桂的破壁程度逐漸提高,有利于肉桂油的滲出。30 min之后提取率呈下降趨勢(shì),原因是長(zhǎng)時(shí)間超聲環(huán)境下產(chǎn)生的熱量會(huì)導(dǎo)致熱敏性成分的損失。超聲時(shí)間過長(zhǎng)不僅增加成本,還可能影響肉桂油中有效成分的含量,因此選取30 min超聲時(shí)間較為適宜。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)肉桂油提取率的影響Fig.2 Effect of the ultrasound time on oil yield

根據(jù)圖3可知,隨著脈沖比(開∶關(guān))在5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的條件下變化,肉桂油提取率在脈沖比7∶3時(shí)達(dá)到峰值,隨后逐漸下降。連續(xù)和脈沖是超聲處理的2種模式,連續(xù)的超聲振動(dòng)可能使體系處于一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),而適時(shí)地停止振動(dòng)能打破這種穩(wěn)定,從而更均勻地對(duì)肉桂進(jìn)行破壁。脈沖比較小時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致破壁效果的減弱,提取率也較小;但在更大的脈沖比下,空化與發(fā)熱可能會(huì)導(dǎo)致提取化學(xué)成分的分解,因此選取7∶3的脈沖比作提取條件更加適宜。

圖3 脈沖比對(duì)肉桂油提取率的影響 Fig.3 Effect of the pulseratio on oil yield

通過單因素分析,選擇超聲功率275 W、超聲時(shí)間30 min、脈沖比7∶3為最佳提取條件。按1.2、1.3節(jié)的方法,分別以肉桂葉、肉桂枝為原料進(jìn)行超聲輔助蒸餾和水蒸氣蒸餾提取肉桂油,經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得超聲桂葉油提取率為2.32%,桂葉油提取率為1.79%,超聲桂枝油提取率為1.49%,桂枝油提取率為1.33%。4種肉桂油的提取率對(duì)比如圖4所示。從圖4可見,超聲輔助蒸餾相較水蒸氣蒸餾肉桂油的提取率顯著提高。

圖4 4種肉桂油的提取率對(duì)比Fig.4 Comparison of the yield of 4 types of cinnamon oil

2.2 掃描電鏡分析

肉桂葉掃描電鏡圖像如圖5所示。圖5(a)的肉桂葉表面較為平整,而圖5(b)經(jīng)超聲處理的肉桂葉因超聲過程中產(chǎn)生的空化氣泡使得其表面被剝落、侵蝕,微射流在表面作用產(chǎn)生了許多氣孔。圖5(c)中經(jīng)水蒸氣蒸餾后肉桂葉表面破裂,使得揮發(fā)油能被滲出提取,而圖5(d)中經(jīng)超聲破壁和水蒸氣蒸餾協(xié)同作用使得肉桂葉表面破裂的更加完全。這是因?yàn)槌暫螽a(chǎn)生的氣孔使肉桂油腺內(nèi)的高壓在局部積聚,從而使油腺細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生劇烈爆破。超聲輔助蒸餾通過內(nèi)部氣孔爆破使得肉桂顆粒破裂的更加完全,從而減小了蒸汽通過顆粒表面的阻力,提高了蒸餾過程的傳熱、傳質(zhì)效率,促進(jìn)了高沸點(diǎn)成分從顆粒內(nèi)部的逸出,使鄰甲氧基肉桂醛等成分被更多的富集在提取油中。

(a) 浸潤(rùn)處理

2.3 肉桂油成分分析

按1.2、1.3節(jié)的方法,分別使用超聲輔助蒸餾與水蒸氣蒸餾,從肉桂的枝、葉部位共提取了4種肉桂油。對(duì)提取的肉桂油成分進(jìn)行GC-MS分析,得到4種肉桂油的總離子色譜圖如圖6所示。并利用NIST圖譜庫(kù)共檢測(cè)出了16種化合物,包含有醇(2種)、酚(1種)、醛(8種)、酮(1種)、酸(1種)、酯(3種)。根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對(duì)含量,其中醛類成分的含量最高,其次為酯類和醇類,4種肉桂油成分的GC-MS分析結(jié)果見表1。

表1 4種肉桂油成分的GC-MS分析結(jié)果Tab.1 GC-MS components analysis of cinnamon oils

(a) 超聲桂葉油

4種肉桂油的提取率由大到小的順序?yàn)槌暪鹑~油、桂葉油、超聲桂枝油、桂枝油,其中揮發(fā)性成分的種類較為相似,但各成分的相對(duì)含量有較大的差異。

肉桂油主要成分為肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛、香豆素,該結(jié)果與王學(xué)娟等[18]的研究結(jié)果相似,但本研究使用超聲輔助蒸餾提取的鄰甲氧基肉桂醛含量更高達(dá)29.62%。

相比而言,超聲提取油中鄰甲氧基肉桂醛的含量要高于水蒸氣蒸餾,可能是因?yàn)槌暡梢源┩讣?xì)胞壁使油腺破裂,從而提高了蒸餾過程的傳質(zhì)效率,使沸點(diǎn)更高的鄰甲氧基肉桂醛等成分被更好的提取。

未獲得完全緩解（complete resolution，CR）或者研究期間復(fù)發(fā)的AL患者；急性早幼粒細(xì)胞白血病患者（該類患者長(zhǎng)期無病生存率較高、生存質(zhì)量亦明顯高于其他類型的白血病，故剔除）；近期準(zhǔn)備行骨髓移植的患者；不能按要求配合治療和復(fù)查的患者；伴有嚴(yán)重心腦肝肺腎等其他臟器功能損害者。

肉桂枝、葉中揮發(fā)性成分的含量有較大差異,桂枝油中肉桂醛含量達(dá)90%以上,而桂葉油中成分種類則更為豐富。

鄰甲氧基肉桂醛有殺菌與抗癌的功效,極具醫(yī)用價(jià)值,香豆素、內(nèi)龍腦等成分有保護(hù)神經(jīng)、抗痙攣的功效,在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有較多的應(yīng)用。

超聲桂葉油比桂葉油中的鄰甲氧基肉桂醛含量提高了13.36%,香豆素含量提高了6.53%;超聲桂枝油比桂枝油中的鄰甲氧基肉桂醛含量提高了1.77%,香豆素含量提高了1.11%。

2.4 DPPH自由基清除能力

4種肉桂油的DPPH自由基清除能力如圖7所示。從圖7可見,自由基清除能力隨著精油質(zhì)量濃度從1 g/L增加至15 g/L而逐漸增強(qiáng),4種肉桂油清除DPPH自由基能力由大到小的順序?yàn)槌暪鹑~油、桂葉油、超聲桂枝油、桂枝油。其中,超聲桂葉油的DPPH自由基清除能力最強(qiáng),當(dāng)精油質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí),超聲桂葉油的自由基清除率達(dá)到76.30%,該結(jié)果相比紫嬌花油[19]在相同濃度下清除率54.86%更大,較L-抗壞血酸的92.01%略小。原因可能是由于肉桂油中含有鄰甲氧基肉桂醛等極性成分,因此具有良好的自由基清除能力。

圖7 4種肉桂油的DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH radical scavenging of 4 cinnamon oils

以肉桂油中主要成分的純品作對(duì)照實(shí)驗(yàn),3種肉桂油主要成分的DPPH自由基清除能力如圖8所示。從圖8可見,當(dāng)質(zhì)量濃度在1～15 g/L時(shí),3種肉桂油主要成分清除DPPH自由基能力由大到小的順序?yàn)猷徏籽趸夤鹑?、肉桂醛、香豆素?/p>

圖8 3種肉桂油主要成分的DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging of 3 main components of cinnamon oils

2.5 總抗氧化能力FRAP

根據(jù)FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到4種肉桂油的質(zhì)量濃度與總抗氧化能力FRAP的關(guān)系如圖9所示。從圖9可見,4種肉桂油均具有一定的Fe3+還原能力且濃度與吸光度具有良好線性關(guān)系。4種肉桂油中,超聲桂葉油的Fe3+還原能力相對(duì)較強(qiáng)。當(dāng)精油質(zhì)量濃度為15 g/L 時(shí),FRAP值達(dá)到564.86 μmol/L,顯著高于超聲桂枝油的343.55 μmol/L。根據(jù)擬合方程與L-抗壞血酸作對(duì)比,計(jì)算得質(zhì)量濃度為15 g/L超聲桂葉油與175.68 μmol/L的L-抗壞血酸的抗氧化能力相當(dāng)。當(dāng)精油質(zhì)量濃度在1～15 g/L范圍內(nèi)時(shí),總還原能力與濃度關(guān)系呈正相關(guān),4種肉桂油總抗氧化能力由大到小的順序?yàn)槌暪鹑~油、桂葉油、超聲桂枝油、桂枝油。以3種主要成分純品作對(duì)照實(shí)驗(yàn),3種肉桂油主要成分的總抗氧化能力FRAP如圖10所示。由圖10可知,3種主要成分在質(zhì)量濃度為1～15 g/L范圍時(shí)總抗氧化能力由大到小的順序?yàn)猷徏籽趸夤鹑?、肉桂醛、香豆素?/p>

圖9 4種肉桂油的總抗氧化能力FRAPFig.9 FRAP total antioxidant activity of cinnamon oils

圖10 肉桂油主要成分的總抗氧化能力FRAPFig.10 FRAP total antioxidant activity of the main components of cinnamon oils

3 結(jié)論

①單因素實(shí)驗(yàn)確定超聲輔助蒸餾的最佳提取條件為超聲功率為275 W,超聲時(shí)間為30 min,脈沖比為7∶3。實(shí)驗(yàn)測(cè)得超聲桂葉油提取率為2.32%,桂葉油提取率為1.79%,超聲桂枝油提取率為1.49%,桂枝油提取率為1.33%。肉桂葉中含油量比肉桂枝更高,超聲輔助蒸餾能有效提高肉桂油的提取率。

②通過GC-MS分析在肉桂油中共檢測(cè)出16種化學(xué)成分,其中相對(duì)含量最高的成分為肉桂醛,其次為鄰甲氧基肉桂醛和香豆素。桂葉油比桂枝油中鄰甲氧基肉桂醛的含量更高,超聲輔助蒸餾比水蒸氣蒸餾對(duì)鄰甲氧基肉桂醛的提取效果更好,超聲桂葉油中鄰甲氧基肉桂醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為29.62%。

③提取的4種肉桂油抗氧化能力由大到小的順序?yàn)槌暪鹑~油、桂葉油、超聲桂枝油、桂枝油。超聲桂葉油的抗氧化活性最高,其在質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)76.30%,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總抗氧化能力FRAP值達(dá)到564.86 μmol/L,與濃度為175.68 μmol/L的L-抗壞血酸相當(dāng)。肉桂油中各主要成分的抗氧化能力由大到小的順序鄰甲氧基肉桂醛、肉桂醛、香豆素。