吡格列酮影響紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)痛大鼠的作用機(jī)制

張?jiān)聵s,張麗萍,章 陽(yáng),賈宏彬,陳珍珍

0 引 言

藥物紫杉醇是目前常用的腫瘤化療藥物,但其可導(dǎo)致化療后神經(jīng)痛。目前研究認(rèn)為,紫杉醇產(chǎn)生的神經(jīng)痛可能與脊髓神經(jīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)、T型鈣通道、神經(jīng)元反應(yīng)改變以及脊髓背角的促炎和抗炎信號(hào)傳導(dǎo)異常有關(guān)[1-3]。激活或抑制這些受體或信號(hào)的傳遞可有效的緩解神經(jīng)痛,如激活mTOR 和 PI3K 受體或抑制TRPA1和IL-6信號(hào)等[4-5]。此外,神經(jīng)損傷后脊髓和大腦皮層中的星形膠質(zhì)細(xì)胞在慢性神經(jīng)病理性疼痛的形成和維持中發(fā)揮著重要作用[6-7]。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)增加對(duì)神經(jīng)修復(fù)具有雙重作用。一方面在神經(jīng)損傷的初始階段,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)的作用。另一方面反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)具有一定的抑制作用[8],如影響周圍的G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的表達(dá)參與傷害感受的調(diào)節(jié),并以可逆和時(shí)間依賴的方式引發(fā)疼痛[9]。既往研究證實(shí),促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6,以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白、連接蛋白和水通道蛋白4等參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展[6,8,10-12,13-16]。既往大量研究發(fā)現(xiàn),核受體過氧化小體增殖體激活型受體(peroxisome prolifterator-activatedreceptor, PPAR) 超家族成員PPARγ參與調(diào)控神經(jīng)免疫炎癥,具有一定的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[12,17-18],可以通過激活PPARγ可以預(yù)防化療藥物導(dǎo)致的周圍神經(jīng)病變,緩解相關(guān)神經(jīng)病理性疼痛[19-20]。吡格列酮為PPARγ的激動(dòng)劑,通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、活化PPARγ聯(lián)合信號(hào)通路等途徑緩解化療性神經(jīng)病理性疼痛[21-22],但其作用機(jī)制是否與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能有關(guān)目前尚無定論。

1 材料與方法

1.1 建模與分組選擇SD雄性大鼠32只,體重200～220 g,由南京大學(xué)附屬金陵醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供,研究嚴(yán)格遵從《赫爾辛基宣言》要求。動(dòng)物飼養(yǎng)的溫度為18～22 ℃,濕度40%～70%,光照12 h,晝夜交替。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(軍)2018-0006。所有大鼠經(jīng)靜置適應(yīng)環(huán)境1周后,隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將大鼠分為4組:空白組,安慰劑組,治療組和拮抗劑組(GW9662),每組8只。空白組第1、3、5、7天腹腔注射1 mL/kg等滲鹽水,其余各組大鼠腹腔注射2 mg/mL的紫杉醇(2 mg/kg)制備紫杉醇誘導(dǎo)的慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型。第7天測(cè)量冷縮足反應(yīng)閾值(number of cold-stimulated paw withdrawal,TNCW)后,治療組大鼠連續(xù)7 d腹腔注射10 mg/mL的吡格列酮(10 mg/kg),拮抗劑組大鼠于吡格列酮給藥前30 min腹腔注射GW9662(2 mg/kg),所有模型組大鼠按1 mL/kg腹腔注射賦形劑20%二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)。

1.2 藥物配置紫杉醇溶于20%DMSO中配置為2 mg/mL濃度;吡格列酮溶于0.9%的等滲鹽水中配置為10 mg/mL濃度;GW9662溶于20%中配置為3 mg/mL濃度。所需藥物均由南京索爾生物科技有限公司提供。

1.3 行為學(xué)測(cè)定TNCW的測(cè)定:給藥當(dāng)天及第2-14天測(cè)定大鼠的TNCW。將大鼠放置在金屬網(wǎng)底( 孔徑為5 mm×5 mm)的透明有機(jī)玻璃籠內(nèi), 適應(yīng)30 min后采用0.1 mL丙酮刺激右后足足底部,記錄30 s內(nèi)的陽(yáng)性反應(yīng)(足抬起、甩腿、舔足或拭足)次數(shù)。測(cè)試3次, 測(cè)試間隔時(shí)間至少5 min,將3次的平均陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)作為 TNCW,所有測(cè)試均于8:00～10:00之間進(jìn)行。

1.4 細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)濃度測(cè)定第14天完成行為學(xué)檢測(cè)后處死大鼠,取大鼠L5脊髓組織,采用大鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒(TNF-α,Diaclone Research, Besancon Cedes, France; IL-1β,Biosource Europe SA, Niveiles, Belgium)測(cè)定TNF-α、IL-1β水平。按試劑盒內(nèi)的說明書嚴(yán)格操作,使用測(cè)定波長(zhǎng)450 mm時(shí)的光密度,作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)一步將樣品光密度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,并乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),計(jì)算出樣品的細(xì)胞因子濃度,最后采用測(cè)定的細(xì)胞因子濃度除以樣品的蛋白濃度,結(jié)果以pg/mg表示。

1.5 膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(mRNA)表達(dá)水平的測(cè)定取大鼠L5脊髓組織,采用Trizol RNA試劑盒提取總核糖核酸、逆轉(zhuǎn)錄RNA為反向脫氧核糖核酸,使用Rotor-GeneTM 3000 實(shí)時(shí)定量多聚鏈反應(yīng)檢測(cè)儀 (Corbett Research, Sydney, Australia) 測(cè)定GFAP與基因β肌動(dòng)蛋白(β-actin)的水平,計(jì)算兩種標(biāo)志物mRNA的表達(dá)量。β-actin和GFAP引物序列,正向引物為5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′, 5′-GCTGGAGCAAGACAAACATTC-3′;反向引物為: 5′-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3′,5′-CCCTACCCACTCCTACATCGT-3′。

2 結(jié) 果

2.1 吡格列酮對(duì)大鼠行為學(xué)的影響與空白組相比,腹腔注射紫杉醇各組大鼠TNCW次數(shù)明顯增加(P<0.05);與安慰劑組比,在注射吡格列酮后治療組大鼠TNCW次數(shù)顯著下降(P<0.05),拮抗劑組與安慰劑組比TNCW差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠不同時(shí)間點(diǎn)冷刺激誘發(fā)縮足次數(shù)四組之間的比較Table 1 Number of feet withdrawal induced by cold stimulation at different time in rats

2.2 吡格列酮對(duì)腰脊髓組織細(xì)胞因子水平的影響與空白組相比, 成模各組大鼠脊髓L5脊髓中TNF-α和IL-1β表達(dá)明顯增高(P<0.05);與安慰劑組相比,治療組L5脊髓組織中TNF-α、IL-1β水平明顯下降(P<0.05);拮抗劑組與安慰劑組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 吡格列酮對(duì)脊髓細(xì)胞因子含量的影響Table 2 The level of TNF-α and IL-1β in the spinal cord of rats

2.3 吡格列酮對(duì)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物mRNA相對(duì)表達(dá)水平與空白組大鼠L5脊髓腰膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物GFAP的mRNA表達(dá)水平(92.88±8.15)相比,安慰劑組、治療組、拮抗劑組(258.63±9.41,191.25±6.45,251.25±4.13)明顯升高(P<0.05);與安慰劑組相比,治療組GFAP mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05),而拮抗劑組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

紫杉醇對(duì)于惡性腫瘤的化療有良好效果,屬于一線化療藥物,應(yīng)用廣泛。但是臨床發(fā)現(xiàn),使用紫杉醇化療后,患者發(fā)生周圍神經(jīng)痛的比例逐漸增多。紫杉醇神經(jīng)毒性的發(fā)生率約為62%,許多患者無法承受化療導(dǎo)致的神經(jīng)痛而選擇放棄化療。目前氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)元反應(yīng)改變以及炎癥因子和信號(hào)傳導(dǎo)等被認(rèn)為是化療性神經(jīng)痛產(chǎn)生的主要原因[1,3]。然而,星形膠質(zhì)細(xì)胞同樣作用于炎性因子的釋放和信號(hào)通路的傳導(dǎo),其對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展起重要的作用[9,13-15]。

吡格列酮可以通過星形細(xì)胞和PPARγ的活化調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展[12,18,23]?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子(例如TNF-α和IL-1β),進(jìn)一步影響突觸前后膜的穩(wěn)定性和興奮性,參與痛覺易化的發(fā)生,我們通過檢測(cè)化療后的大鼠的腰脊髓發(fā)現(xiàn),紫杉醇化療也增加了脊髓炎性因子的濃度水平,這或許表示化療性周圍神經(jīng)痛的機(jī)制與脊髓炎性因子的增加有關(guān)。但這是否與星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)尚不明確,因此我們繼續(xù)檢測(cè)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化標(biāo)志物GFAP mRNA,我們同樣發(fā)現(xiàn)在紫杉醇治療7 d后,脊髓GFAP相比空白組明顯升高,這或許提示脊髓炎性因子的升高與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。接著我們通過連續(xù)7 d腹腔注射吡格列酮,觀察大鼠的行為學(xué)改變,并于7 d后檢測(cè)腰脊髓炎性因子和GFAP水平,探討吡格列酮用于治療化療性神經(jīng)痛的機(jī)制。在7 d的觀察期,痛覺過敏行為明顯緩解,此外腰脊髓膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP mRNA表達(dá)水平及炎癥細(xì)胞因子水平與vehicle治療組比明顯降低,當(dāng)同時(shí)注射GW9662時(shí),脊髓GFAP mRNA的表達(dá)較單用吡格列酮明顯升高,提示吡格列酮可能通過先激活PPARγ再抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化改變已發(fā)生的脊髓炎癥反應(yīng),對(duì)化療性周圍神經(jīng)痛大鼠有治療作用。有研究證實(shí)了吡格列酮對(duì)神經(jīng)病理性大鼠疼痛行為具有治療作用,并認(rèn)為與其抑制膠質(zhì)細(xì)胞及降低血中的促炎細(xì)胞因子相關(guān)[23-25]。我們通過檢測(cè)脊髓中的促炎細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)脊髓炎性因子的降低同樣與星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制有關(guān)。本研究揭示,吡格列酮用于治療化療性神經(jīng)痛的機(jī)制不僅是抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活的化同樣是治療化療性神經(jīng)痛的機(jī)制之一。未來,我們將繼續(xù)研究吡格列酮治療后大鼠近、遠(yuǎn)端肢體表皮角質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)纖維密度的改變,探討吡格列酮治療神經(jīng)痛可能的機(jī)制。由于時(shí)間和經(jīng)費(fèi)有限,本研究未納入脊髓GFAP的免疫組化或免疫熒光染色實(shí)驗(yàn),需在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步改進(jìn)。

綜上,吡格列酮可以抑制紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)損傷導(dǎo)致的腰脊髓星形膠質(zhì)活化,減少脊髓炎性細(xì)胞因子的釋放,緩解大鼠化療性周圍神經(jīng)痛,其作用可以被PPARγ拮抗劑GW9662翻轉(zhuǎn)。因此,吡格列酮活化PPARγ抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化釋放的炎性因子,從而改善化療性神經(jīng)痛。