通心痹合劑對動脈粥樣硬化家兔血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制

汪滿意 王道成 馬小東 薛 剛 屈長宏 嚴(yán)士海 朱萱萱

(1 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,揚(yáng)州,225009; 2 南京中醫(yī)藥大學(xué)揚(yáng)州附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,揚(yáng)州,225009; 3 江蘇省中醫(yī)院藥劑科,南京,210029)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種脂質(zhì)浸潤驅(qū)動的大、中血管慢性炎癥病變,是多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)[1]。中醫(yī)古籍中雖未見關(guān)于AS的論述,但結(jié)合其癥狀可將其歸屬于中醫(yī)“胸痹”“中風(fēng)”等范疇。中醫(yī)藥防治AS不穩(wěn)定斑塊主要從毒邪、內(nèi)虛外毒、絡(luò)病理論等方面進(jìn)行研究,相關(guān)分子機(jī)制主要圍繞脂質(zhì)浸潤、損傷反應(yīng)、氧化應(yīng)激及炎癥等經(jīng)典學(xué)說進(jìn)行深入研究[2]。本研究團(tuán)隊認(rèn)為易損斑塊的形成可能與痰瘀等有形之邪相關(guān),易損斑塊的破裂可能與熱毒等無形之邪相關(guān),在此理論指導(dǎo)下擬通心痹合劑應(yīng)用于臨床治療AS患者,療效甚佳。前期研究表明,通心痹合劑能明顯縮短冠心病心絞痛患者發(fā)作持續(xù)時間、減少發(fā)作次數(shù),其作用機(jī)制可能是通過抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝以達(dá)到防治冠心病目的[3];臨床研究發(fā)現(xiàn)其具有改善其內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抑制血小板活化的作用[4-5];動物實驗研究顯示,調(diào)節(jié)血脂和降低炎癥介質(zhì)水平可能是通心痹合劑抗AS的作用機(jī)制之一[6-7]。但其保護(hù)血管內(nèi)皮、抗炎的作用機(jī)制仍不清楚,為了研究通心痹合劑對AS的可能作用,故本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上,觀察通心痹合劑對血管內(nèi)皮保護(hù)的藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康的雄性家兔,體質(zhì)量2.0～2.5 kg,由南京江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。合格證號:SCXK(蘇)2017-0001。在嚴(yán)格遵循動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的前提下進(jìn)行實驗(倫理審批號:2021-19)。動物飼養(yǎng)環(huán)境:室內(nèi)溫度18～25 ℃,室內(nèi)相對濕度40%～70%。對照組飼喂普通飼料100 g/d,實驗動物飼喂高脂飼料100 g/d(1%膽固醇+5%蛋黃+5%豬油+89%普通飼料)。自然晝夜循環(huán)。

1.1.2 藥物 通心痹合劑(金銀花30 g、當(dāng)歸20 g、玄參30 g、瓜蔞皮12 g、川芎10 g、水蛭6 g研末、黃精30 g)藥物均出自道地藥材:金銀花產(chǎn)自河南,當(dāng)歸產(chǎn)自甘肅,玄參產(chǎn)自浙江,瓜蔞皮產(chǎn)自山東,川芎產(chǎn)自四川,水蛭產(chǎn)自浙江,黃精產(chǎn)自廣東。以上藥物經(jīng)揚(yáng)州市中醫(yī)院廖建春主任藥師鑒定符合2020年版《中華人民共和國藥典》質(zhì)量規(guī)定、由揚(yáng)州市中醫(yī)院制劑室統(tǒng)一提供,制備方法(統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)):先將生藥浸入清水中浸泡30 min,然后煎煮1 h,再留取濾液備用,再煎1 h并過濾后留取合并濾液,將前后2次煎煮藥液混合、離心、去除沉淀,上清液即藥汁,經(jīng)80 ℃水浴鍋蒸發(fā)濃縮處理,配制生藥含量1.84 g/mL的中藥湯劑,滅菌后4 ℃冷藏保存。辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H19990366)。

1.1.3 試劑與儀器 內(nèi)皮肽試劑盒(BP公司,美國,生產(chǎn)批號:20130215TRP);一氧化氮試劑盒(BP公司,美國,生產(chǎn)批號:20130210RW);VEGF試劑盒(Abcam公司,英國,生產(chǎn)批號:GR66352-1);基質(zhì)金屬蛋白酶-9試劑盒(Santa Cruz公司,美國,生產(chǎn)批號:4599R);核因子κB抗體(Bioworld公司,美國,生產(chǎn)批號:130402R);BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京天根生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:PA115-01);核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)、凋亡相關(guān)斑樣蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein,ASC)、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1、β-肌動蛋白一抗(Abcam公司,英國,生產(chǎn)批號分別為:ab4207、ab226191、ab238972、ab9485、ab8227)。全自動生化分析儀(Beckman Coulter有限公司,美國,型號:Au481-10);球囊導(dǎo)管(Dedwards Lifesciences,美國,型號:59219817);離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司,型號:LDZ-5);紫外線分光光度計(上海光譜儀器有限公司,型號:756PC)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將健康雄性家兔隨機(jī)分為對照組和模型組。對照組(10只)家兔正常飼養(yǎng)4周。模型組家兔給予高脂飼料100 g/d飼養(yǎng)2周,應(yīng)用頸動脈球囊拉傷術(shù)損傷造模加飼喂高脂飼料2周[8]。4周后評估造模情況,取2只觀察組家兔經(jīng)主動脈根部蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色,若脂質(zhì)斑塊形成,確定造模成功。將造模成功的50只家兔隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組、通心痹合劑大劑量組、通心痹合劑中劑量組、通心痹合劑小劑量組,每組10只。

1.2.2 給藥方法 辛伐他汀組按照1.33 mg/kg(2 mL/kg)辛伐他汀片灌胃;通心痹合劑大劑量組按照9.87 g/kg(2 mL/kg)灌胃,通心痹合劑中劑量組按照4.93 g/kg(2 mL/kg)灌胃,通心痹合劑小劑量組按照2.47 g/kg(2 mL/kg)灌胃(中劑量來自于臨床等效劑量的換算,小劑量、大劑量分別為中劑量的0.5倍、1.5倍);對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水(2 mL/kg),1次/d。連續(xù)給藥8周。對照組飼喂普通飼料,其余組高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 標(biāo)本獲取 實驗結(jié)束時經(jīng)家兔耳緣靜脈采血2 mL,3 000 r/min離心10 min后取血清(離心半徑10 cm),放入-80 ℃冰箱冷藏備用。無菌條件下解剖家兔,取其主動脈,一部分常規(guī)4%多聚甲醛固定,石蠟包埋用于組織學(xué)分析;另一部分新鮮組織離體后液氮冷凍,用于相關(guān)蛋白檢測。

1.2.3.2 全自動生化儀測定血脂 用全自動生化分析儀檢測總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平。

1.2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清內(nèi)皮肽、一氧化氮水平 具體方法嚴(yán)格按試劑盒說明操作。

1.2.3.4 半定量法測定血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、核因子κB的陽性細(xì)胞數(shù) 采用半定量法判斷,即根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞的面積及著色強(qiáng)度進(jìn)行分級評分,二者乘積的積分進(jìn)行統(tǒng)計分析。每個視野所見陽性細(xì)胞數(shù)的面積分0級(陰性,0分)、1級(陽性細(xì)胞占1%～25%,1分)、2級(陽性細(xì)胞占26%～50%,2分)、3級(陽性細(xì)胞占51%～75%,3分)、4級(陽性細(xì)胞占76%～100%,4分),著色強(qiáng)度計分標(biāo)準(zhǔn)為:0分(無著色)、1分(淺黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)。

1.2.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測主動脈組織中血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、核因子κB蛋白的表達(dá)水平 將備用切片預(yù)熱后脫蠟、梯度乙醇脫水;進(jìn)行抗原修復(fù);再于3% H2O2去離子水中孵育以消除內(nèi)源過氧化物酶活性;分別用SP試劑盒中3種試劑進(jìn)行孵育并沖洗;最后用DAB顯色劑顯色;樹脂封片。免疫組織化學(xué)染色陽性,可見細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。應(yīng)用圖像全自動分析系統(tǒng),對每張免疫組織化學(xué)玻片陽性目標(biāo)出現(xiàn)最多的區(qū)域隨機(jī)挑選5個視野(×200),求得陽性單位(Positive Unit,PU)值。

1.2.3.6 蛋白免疫印跡檢測主動脈組織中NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1蛋白的表達(dá)水平 取適量主動脈組織,利用蛋白裂解液裂解組織提取組織總蛋白,配置制備BCA工作液(稀釋對照品A∶B為50∶1),取6組各6個樣品及各濃度標(biāo)準(zhǔn)品100 μL,加入EP管中,根據(jù)說明書提取、測定蛋白濃度。將蛋白與適量上樣緩沖液的混合液加熱變性后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSpolyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)膜后封閉1 h(5%脫脂奶粉),加一抗(1∶3 000,4 ℃,過夜),TEST洗膜3次后二抗(1∶5 000,室溫,1 h)。孵育完成洗膜3次。以β-肌動蛋白為內(nèi)參照,根據(jù)ECL發(fā)光法記錄曝光圖片,分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 通心痹合劑對AS家兔血脂的影響 與對照組比較,模型組總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇均明顯升高,高密度脂蛋白膽固醇下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,辛伐他汀組、通心痹合劑各劑量組均可明顯降低家兔血液中的總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇,升高高密度脂蛋白膽固醇,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 通心痹合劑對AS家兔血脂的影響

2.2 對血管內(nèi)皮內(nèi)皮肽、一氧化氮的影響 與對照組家兔比較,模型組家兔血液中的內(nèi)皮肽濃度升高(P<0.05)。與模型組家兔比較,經(jīng)過藥物治療后,通心痹合劑各劑量組家兔血液中的內(nèi)皮肽濃度降低(P<0.05)。與對照組比較,模型組一氧化氮顯著下降(P<0.05);辛伐他汀組和通心痹合劑各組較模型組明顯升高(P<0.01)。見表2。

表2 通心痹合劑對家兔內(nèi)皮肽、一氧化氮的影響

2.3 半定量法測定血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、核因子κB的陽性細(xì)胞計數(shù) 與對照組比較,模型組血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、核因子κB均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；給予相應(yīng)藥物干預(yù)后，通心痹合劑各劑量組、辛伐他汀組血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、核因子κB表達(dá)均明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和核因子κB測定結(jié)果

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測兔主動脈血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、核因子κB的水平

通心痹合劑各劑量組、辛伐他汀組血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、核因子κB表達(dá)均明顯減弱。見圖1～3。

圖1 通心痹合劑對AS家兔血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響(免疫組織化學(xué),×200)注:各組家兔血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果(陽性表達(dá)為棕色顆粒)

2.4.1 通心痹合劑對AS家兔血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(dá)水平的影響 模型組兔血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)明顯增強(qiáng),與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);給予相應(yīng)藥物干預(yù)之后,通心痹合劑高劑量組、通心痹合中劑量組、通心痹合劑低劑量組和辛伐他汀組兔血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)都明顯減弱,與模型組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見圖1。

2.4.2 通心痹合劑對AS家兔基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組比較,模型組家兔主動脈組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白的表達(dá)水平明顯升高,表現(xiàn)為深棕黃色,呈強(qiáng)陽性表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,辛伐他汀組和通心痹合劑高劑量組、通心痹合劑中劑量組主動脈組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白的表達(dá)水平有不同程度的降低,呈弱陽性表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),通心痹合劑小劑量組兔主動脈中基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)明顯,主動脈全層均表現(xiàn)為棕黃色,呈陽性表達(dá),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 通心痹合劑對AS家兔基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)的影響(免疫組織化學(xué),×200)注:各組家兔基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果(陽性表達(dá)為棕色顆粒)

2.4.3 通心痹合劑對AS家兔核因子κB蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組比較,模型組家兔主動脈組織中核因子κB蛋白的表達(dá)水平明顯升高,表現(xiàn)為深棕黃色,強(qiáng)陽性表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,辛伐他汀組和通心痹合劑大劑量組、通心痹合劑中劑量組主動脈組織中核因子κB蛋白的表達(dá)水平有不同程度的降低,弱陽性表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),通心痹合劑小劑量組兔主動脈中核因子κB表達(dá)明顯,主動脈全層均表現(xiàn)為棕黃色,陽性表達(dá),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 通心痹合劑對AS家兔核因子κB表達(dá)的影響(免疫組織化學(xué),×200)注:各組家兔核因子κB蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果(陽性表達(dá)為棕色顆粒)

2.5 通心痹合劑對AS家兔主動脈斑塊核因子κB-NLRP3通路相關(guān)蛋白的影響 與對照組比較,模型組NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,通心痹合劑各劑量組、辛伐他汀組NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1表達(dá)水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 各組家兔主動脈斑塊核因子κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

表4 各組家兔主動脈斑塊核因子κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

AS是一種由多因素引起的發(fā)生在動脈壁的慢性炎癥病變[9]。研究表明,冠心病臨床表現(xiàn)形式與斑塊的穩(wěn)定性直接相關(guān)[10-11]。臨床試驗表明,抗炎治療可降低冠心病患者AS事件風(fēng)險[12]。在人和動物體內(nèi)的炎癥部位及AS損傷區(qū)域都可檢測到內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。出現(xiàn)功能障礙的內(nèi)皮細(xì)胞對血液中的低密度脂蛋白通透性增加。低密度脂蛋白被氧化成氧化型低密度脂蛋白就成為與損傷相關(guān)的分子模式,破壞內(nèi)皮細(xì)胞并觸發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。而基質(zhì)金屬蛋白酶-9和血管內(nèi)皮生長因子的檢測可明確AS斑塊性質(zhì),反映斑塊穩(wěn)定性及病變程度[14]。其作用機(jī)制為血管內(nèi)皮生長因子刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞,引起基質(zhì)金屬蛋白酶-9等基因及蛋白表達(dá)上調(diào),進(jìn)而有可能促進(jìn)AS斑塊內(nèi)基質(zhì)降解,引起斑塊破裂[15]。

炎癥小體在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,NLRP3炎癥小體是目前研究最為廣泛的炎癥小體,其識別炎癥的受體為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族NLRP3[16],由ASC、NLRP3、效應(yīng)蛋白半胱天冬酶-1前體3部分組成。就AS分子機(jī)制而言,目前已有研究表明[17],NLRP3炎癥小體通路相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、胱天蛋白酶-1在不穩(wěn)定性斑塊中的表達(dá)要顯著高于穩(wěn)定性斑塊。核因子κB是控制NLRP3表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子信號通路,在NLRP3基因啟動子區(qū)有3個核因子κB的結(jié)合位點,其對于NLRP3基因轉(zhuǎn)錄是必需的[18]。當(dāng)NLRP3受到上游核因子κB信號刺激時,可上調(diào)炎癥反應(yīng)基因表達(dá)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)。因此抑制NLRP3炎癥小體激活,可顯著抑制炎癥通路,改善AS的進(jìn)展及預(yù)后。

研究發(fā)現(xiàn),“炎癥學(xué)說”與“瘀毒內(nèi)結(jié)”存在緊密聯(lián)系,血栓形成、脂質(zhì)浸潤、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞焦亡等病理過程均與中醫(yī)內(nèi)毒理論相符合[19-20]。AS在中醫(yī)理論中的病理變化為脈道不利,《金匱要略心典》載“無邪不有毒,熱從毒化,變從毒起,瘀從毒結(jié)”,痰毒、瘀毒阻礙氣機(jī),郁久則化為熱毒,耗傷心陰,不通或不榮則痛,發(fā)為胸痹。因此,易損斑塊的形成可能與痰瘀等有形之邪相關(guān),易損斑塊的破裂可能與熱毒等無形之邪相關(guān)。毒在上焦者當(dāng)清解之,故針對胸痹毒邪理論立以“清熱解毒、活血化痰、益氣養(yǎng)陰”之法,創(chuàng)“通心痹合劑”應(yīng)用于臨床。通心痹合劑是由“四妙勇安湯”加減而成,原方為治療熱毒型脫疽的一則著名古方,近年來臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其具有抗AS作用。本課題組基于對AS上述病機(jī)的認(rèn)識,在原方基礎(chǔ)上方加瓜蔞皮、川芎、水蛭、黃精,臨床療效顯著。本方以金銀花、玄參為君藥,清熱解毒,滋陰涼血,當(dāng)歸補(bǔ)血而主動,活血而不傷新血,瓜蔞皮清熱化痰、寬胸散結(jié),二藥共為臣藥,川芎、水蛭活血化瘀通絡(luò),黃精氣陰雙補(bǔ),乃共為佐藥。全方清熱解毒、活血化痰、益氣養(yǎng)陰,且清而不燥、寒而不凝、潤而不膩、滋而能通,共奏通絡(luò)之效。

本實驗中采用高脂喂養(yǎng)加頸動脈球囊拉傷術(shù)來加速誘導(dǎo)家兔AS形成的過程,并將模型組家兔的血脂、主動脈表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、核因子κB蛋白的變化、核因子κB/NLRP3炎癥小體信號通路等指標(biāo)的檢測結(jié)果與對照組比較,結(jié)果表明,本實驗AS模型造模成功。通過模型組與藥物處理動物對比發(fā)現(xiàn),與辛伐他汀作用類似,方中水蛭可能通過減少脂質(zhì)浸潤,抑制內(nèi)膜增厚,減緩AS的進(jìn)展,川芎能減小斑塊面積,從而發(fā)揮抗AS的作用[21-22]。檢測核因子κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),模型組家兔主動脈組織中核因子κB、NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1蛋白的表達(dá)水平明顯升高,說明核因子κB/NLRP3通路參與AS炎癥的發(fā)展。與模型組比較,通心痹合劑明顯降低核因子κB、NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1蛋白的表達(dá),提示通心痹合劑可抑制核因子κB/NLRP3通路調(diào)控的炎癥反應(yīng),緩解AS的發(fā)展。單一通路對疾病的闡釋較為局限,已有研究從核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1通路的角度對本病進(jìn)行闡釋[23-24]。動物實驗僅從相關(guān)指標(biāo)表達(dá)及病理變化角度進(jìn)行探討,今后仍需要從分子、基因及臨床試驗等進(jìn)一步揭示其作用靶點與機(jī)制。

利益沖突聲明:無。