3味山姜屬中藥黃酮類成分對大鼠環(huán)核苷酸水平及交感神經(jīng)-腎上腺軸的影響

秦華珍 謝旭格 黃少敏 牛新邁 戴慶玲 柳俊輝

(廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧,530200)

高良姜AlpiniaofficinarumHance,大高良姜AlpiniagalangalWilld.,紅豆蔻AlpiniagalangalWilld.3味山姜屬中藥都是性味辛溫(熱),主歸脾胃經(jīng),屬于溫里藥,具有溫中散寒、燥濕、行氣止痛、止嘔止瀉等功效,臨床上主治脘腹冷痛[1]。有研究者發(fā)現(xiàn)黃酮類成分是該屬植物的主要活性成分之一[2-3]。已有研究表明有些中藥的拆分組分與其全成分具有相似的作用,與其藥性屬性相符合[4-7]。有研究證實一些溫?zé)崴幙梢蕴岣邫C體的基礎(chǔ)代謝率,或?qū)Νh(huán)核苷酸水平和自主神經(jīng)系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用[8]。本文提取3味山姜屬中藥黃酮類成分,復(fù)制胃潰瘍寒證大鼠模型,測定胃組織中腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate Cyclase,AC)、磷酸二酯酶2(Phosphodiesterase2,PDE2)、環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(Cyclic Guanosine Monophosphate,cGMP)的含量及血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic Hormone,ACTH)、多巴胺β羥化酶(Dopamine Beta-Hydroxylase,D-β-H)的含量,研究3味山姜屬中藥黃酮類成分對胃潰瘍寒證大鼠環(huán)核苷酸水平及交感神經(jīng)-腎上腺軸ACTH、D-β-H的影響,探討黃酮類成分的藥性歸屬,尋求3味山姜屬中藥溫?zé)崴幮缘奈镔|(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠,180～220 g,5周齡,90只,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,許可證號:SCXK(湘)2016-0002。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物房,大鼠自由飲水,以標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂食,室內(nèi)環(huán)境溫度16 ℃,本實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)(倫理審批號:DW20210311-021)。

1.1.2 藥物 高良姜、大高良姜、紅豆蔻均購自安國市冷背藥材有限公司,批號:20181018;知母購于廣東匯群中藥飲片股份有限公司,批號:20200412;以上藥材均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室馬雯芳教授鑒定,高良姜為姜科山姜屬植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根;大高良姜為姜科山姜屬植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的干燥根;紅豆蔻為姜科山姜屬植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的果實;知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖。

1.1.3 試劑與儀器 石油醚(60～90 ℃)(天津市富宇精細化工有限公司,批號:20190310);乙醇(西隴化工股份有限公司,批號:20190316);氫氧化鈉(海麥克林生化科技有限公司,批號:C10492126);冰乙酸(成都市科隆化學(xué)品有限公司,批號:20200201);鹽酸(西隴化工股份有限公司,批號:20190316);聚山梨酯-80(吐溫80)(麥克林,批號:C10794975);ACTH、D-β-H、腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate Cyclase,AC)、PDE2、cAMP、cGMP)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒均購于Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司,批號分別為:202007、202007、202010、202010、202010、202010。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與模型制備 取SPF級雄性SD大鼠90只,隨機取10只為空白組,其余各組造模,造模成功后簡單隨機化選取10只為模型組,其余70只隨機分為:干姜姜辣素組、高良姜高劑量組、高良姜低劑量組、大高良姜高劑量組、大高良姜低劑量組、紅豆蔻高劑量組、紅豆蔻低劑量組,共7組,每組10只。沿用前期研究的造模方法,每天早上灌服冰知母水煎液(劑量10.44 g/kg,生藥量0.5 g/mL,給藥量2 mL/100 g,溫度4 ℃),下午灌服15%冰乙酸溶液1 mL,1次/d,連續(xù)給藥4 d。

1.2.2 給藥方法 造模藥物的制備:取知母1 kg,加10倍量的純水浸泡1 h后煮沸,保持微沸1 h,紗布過濾,收集濾液,濾渣加入8倍量純水煮沸40 min,紗布過濾,收集濾液,合并2次濾液,加熱濃縮至生藥濃度為0.5 g/mL濃度,靜置至常溫,保存至4 ℃冰箱備用。冰乙酸溶液的制備:取一定量的99.5%冰乙酸,加入純水稀釋得到15%冰乙酸溶液。

受試藥物的制備:取適量高良姜、大高良姜、紅豆蔻飲片分別粉碎成粗粉,依次加入40倍量95%、60%乙醇,每次回流提取4 h,過濾,合并所得的濾液,減壓濃縮,回收乙醇至無醇味。將粗提物加適量的水混勻,煮沸,加入1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10～11,煮沸1 h,過濾,重復(fù)2次,合并濾液,濾液加入1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至1～2,水浴保溫30 min,放置24 h,析出沉淀,離心,棄去上清液,沉淀用蒸餾水抽洗2～3次,40 ℃真空干燥,得到高良姜、大高良姜、紅豆蔻黃酮提取物,備用,用時以0.5%吐溫80溶液配成相應(yīng)濃度。

陽性藥物的制備:稱取適量干姜姜辣素,以0.5%吐溫80溶液溶解,制備得到4.5 mg/mL(給藥體積為1 mL/200 g)干姜姜辣素溶液,備用。造模結(jié)束后第2天開始給藥,空白組、模型組灌服0.5%吐溫80溶液,陽性組灌服干姜姜辣素溶液,各受試藥物組灌服相應(yīng)高低劑量組溶液,給藥體積均為1 mL/100 g,每12 h給藥1次,共給藥4次[9],低劑量組給藥量相當(dāng)于生藥量2.2 g/kg,高劑量組給藥量相當(dāng)于生藥量8.8 g/kg。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 大鼠胃組織AC、PDE2、cAMP、cGMP含量測定 末次給藥后,禁食不禁水12 h,腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠,劑量為0.5 mL/100 g,剖開大鼠腹部,沿腹腔剪開,剝離胃,沿胃大彎剪開,用生理鹽水清洗去除食物殘渣,剪取胃潰瘍病灶及周圍組織約1 g,加入冰生理鹽水,制備10%組織勻漿,3 000 r/min離心15 min(離心半徑16.5 cm),分取上清液,備用,參照試劑盒方法測定大鼠胃組織AC、PDE2、cAMP、cGMP含量。

1.2.3.2 大鼠血清ACTH、D-β-H含量測定 末次給藥后,禁食不禁水12 h,腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠,劑量為0.5 mL/100 g,腹主動脈采血,靜置數(shù)小時使血清析出,3 000 r/min離心15 min(離心半徑16.5 cm),分離血清,于-80 ℃冰箱凍存,備用,參照試劑盒方法測定大鼠血清ACTH、D-β-H含量。

2 結(jié)果

2.1 對胃潰瘍寒證大鼠胃組織環(huán)核苷酸水平的影響 與空白組比較,模型組大鼠胃組織AC含量降低、PDE2含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,高良姜、大高良姜、紅豆蔻高低劑量組大鼠胃組織AC含量升高,高劑量組及低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05);高良姜、大高良姜、紅豆蔻高低劑量組大鼠胃組織PDE2含量降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。見表1。與空白組比較,模型組大鼠胃組織cAMP含量與cAMP/cGMP比值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);cGMP含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較,高良姜、大高良姜、紅豆蔻高低劑量組大鼠胃組織cAMP含量及cAMP/cGMP比值升高。其中高良姜低劑量組的cAMP含量及cAMP/cGMP比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),大高良姜低劑量組cAMP/cGMP比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其余各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01);cGMP含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 3味山姜屬中藥黃酮類成分對胃潰瘍寒證大鼠胃組織AC、PGE2含量的影響

表2 3味山姜屬中藥黃酮類成分對胃潰瘍寒證大鼠胃組織cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響

2.2 對胃潰瘍寒證大鼠ACTH、D-β-H的影響 與空白組比較,模型組大鼠的血清ACTH、D-β-H含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,各給藥組血清ACTH、D-β-H含量均升高。在升高ACTH含量方面,與模型組比較,大高良姜高低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),其他組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);在升高D-β-H含量方面,與模型組比較,高良姜與紅豆蔻高劑量組、大高良姜高低劑量組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),高良姜與紅豆蔻低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3味山姜屬中藥黃酮類成分對胃潰瘍寒證大鼠血清ACTH、D-β-H含量的影響

3 討論

胃潰瘍是指胃黏膜被自身消化,從而形成潰瘍疾病[10]。高良姜、大高良姜、紅豆蔻有溫胃止嘔、散寒止痛的功效和抗胃潰瘍的作用[11-13],黃酮類成分是高良姜、大高良姜、紅豆蔻3味山姜屬中藥的主要成分之一。按中醫(yī)的理論,胃潰瘍屬“嘈雜”“胃痞病”[14],主要病因在于陰寒之邪侵犯,脾胃失溫,氣血津液凝結(jié)、經(jīng)脈阻滯,臨床上表現(xiàn)為惡寒喜暖、大便稀溏、脘腹劇痛等[15]。有研究顯示,冷應(yīng)激性胃潰瘍存在一定的性別差異[16]。本實驗在中醫(yī)胃潰瘍的病因以及病機的指導(dǎo)下,根據(jù)課題組前期的研究,采用冰乙酸及冰知母溶液對雄性大鼠進行造模,同時通過營造外界寒冷因素的干擾,讓大鼠在應(yīng)激狀態(tài)下使機體交感神經(jīng)、內(nèi)分泌功能失調(diào)產(chǎn)生急性胃潰瘍[17],符合寒邪客胃型病理上的胃潰瘍寒證特征[18],復(fù)制胃潰瘍寒證模型。以3味山姜屬中藥黃酮類成分對胃潰瘍寒證大鼠環(huán)核苷酸水平及交感神經(jīng)-腎上腺軸ACTH、D-β-H的影響進行研究。

AC是細胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的一種水解酶,是cAMP信號通路的主要調(diào)控因子,可以催化ATP轉(zhuǎn)化成cAMP[19]。當(dāng)外界信號刺激或細胞內(nèi)代謝條件發(fā)生變化,AC的表達隨之發(fā)生變化,從而激活cAMP信號通路,調(diào)節(jié)機體生理過程[20]。PDE2可以同時催化cAMP和cGMP的水解,cAMP和cGMP作為細胞內(nèi)的第二信使物質(zhì),在神經(jīng)元細胞之間傳遞信息使其成為創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙相關(guān)治療干預(yù)的重要靶點,環(huán)核苷酸系統(tǒng)指標(biāo)是典型的中藥寒熱溫涼藥性判斷指標(biāo)[21]。本研究結(jié)果顯示,高良姜、大高良姜、紅豆蔻高低劑量組大鼠胃組織AC含量明顯升高,PDE2含量明顯降低,cAMP含量及cAMP/cGMP比值升高,說明3味山姜屬中藥黃酮類可通過調(diào)節(jié)機體生理變化,從而調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸系統(tǒng)。

交感神經(jīng)與腎上腺髓質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能關(guān)系密切,故常合稱為交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)。ACTH可以促進D-β-H分泌,可刺激腎上腺皮質(zhì)分泌腎上腺皮質(zhì)激素升高血壓、增進抵抗力、醫(yī)學(xué)上可用于抗炎癥、抗過敏等[22]。有研究顯示,通過穴位貼敷刺激大鼠交感神經(jīng)可以有效緩解乙酸造成的大鼠胃潰瘍黏膜損傷,促進潰瘍愈合,改善胃平滑肌節(jié)律性收縮活動,從而減輕胃潰瘍癥狀[23]。說明當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)時,下丘腦通過釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素,刺激ACTH的合成和分泌[24]。D-β-H蛋白響應(yīng)刺激從含有兒茶酚胺的囊泡中釋放D-β-H,從而催化多巴胺轉(zhuǎn)化為去甲腎上腺素并從交感神經(jīng)元釋放到循環(huán)中,刺激腎上腺皮質(zhì)分泌腎上腺皮質(zhì)激素,進而產(chǎn)生抗胃潰瘍作用[25]。本研究結(jié)果顯示,各給藥組血清ACTH、D-β-H含量均升高,說明3味山姜屬中藥黃酮類成分有升高ACTH、D-β-H含量,提高交感神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)功能活動和抗胃潰瘍的作用。

綜上所述,高良姜、大高良姜、紅豆蔻黃酮類成分能夠調(diào)節(jié)胃潰瘍寒證大鼠環(huán)核苷酸水平和促進交感神經(jīng)-腎上腺軸功能活動。通過升高AC、cAMP、ACTH、D-β-H含量及cAMP/cGMP比值,降低PDE2含量,調(diào)節(jié)胃潰瘍寒證大鼠環(huán)核苷酸水平從而促進交感神經(jīng)-腎上腺軸功能活動,說明具有親緣關(guān)系的3味山姜屬中藥的藥性具有相似性,即溫?zé)崴幮?3味山姜屬中藥黃酮類成分為其體現(xiàn)溫?zé)崴幮缘幕瘜W(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。