礦泉水中大腸菌群檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果及分析

趙金丹 姚艷春 楊海進(jìn) 雷夢(mèng) 胡鵬燕 胡威威

（中國(guó)家用電器研究院，北京 100053）

總大腸菌群是一群在37℃培養(yǎng)，24 h 內(nèi)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌[1]，是評(píng)價(jià)生活飲用水衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求每100 mL 的生活飲用水中不得檢出總大腸菌群[2]。水質(zhì)對(duì)用水者的健康有很大影響，總大腸菌群的測(cè)定對(duì)把控用水水質(zhì)有重要意義。

能力驗(yàn)證是指利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力[3]。能力驗(yàn)證作為重要的外部質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，是考查檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)能力維持情況和促進(jìn)能力提升的重要手段。李文綺等[4]對(duì)2020 年和2021 年連續(xù)兩年參加食品中菌落總數(shù)的檢測(cè)能力驗(yàn)證活動(dòng)進(jìn)行了經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，分析了關(guān)鍵影響因素。方瑩等[5]通過(guò)生活飲用水中微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證活動(dòng)，利用|z|值有效評(píng)價(jià)了實(shí)驗(yàn)室操作人員的檢測(cè)能力，分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在的問(wèn)題。本文對(duì)ACAS-PT1625（2023）礦泉水中大腸菌群的檢測(cè)能力驗(yàn)證的實(shí)施過(guò)程和結(jié)果進(jìn)行了分析總結(jié)，以期提升實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力水平。

1 材料與方法

1.1 測(cè)試樣品及陽(yáng)性菌株

測(cè)試樣品：2 份真空西林瓶樣品，編號(hào)1#、2#，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的ACAS-PT1625（2023）礦泉水中大腸菌群的檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品。

陽(yáng)性菌株：大腸埃希氏菌（CGMCC1.90），中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器設(shè)備

Thermo 1384 型二級(jí)生物安全柜，德國(guó)Thermo Scientific；Heratherm IMH180 微生物培養(yǎng)箱，德國(guó)Thermo Scientific；CL-32L 高壓滅菌器，日本ALP；2009D 型程控定量封口機(jī)，美國(guó)愛(ài)德士公司。

1.3 試劑

乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液，貨號(hào)CM108，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液（BGLB），貨號(hào)CM143，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；科立得試劑，美國(guó)愛(ài)德士公司。

1.4 檢驗(yàn)方法

ACAS-PT1625（2023）礦泉水中大腸菌群的檢測(cè)能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書建議使用GB 8538-2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》55 大腸菌群檢測(cè)方法中15 管發(fā)酵法和濾膜法或?qū)嶒?yàn)室常用方法進(jìn)行樣品檢測(cè)。本次測(cè)試采用GB 8538-2022 中15 管發(fā)酵法和GB/T 5750.12-2023《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 第12 部分：微生物指標(biāo)》中51 孔定量盤法進(jìn)行大腸菌群檢測(cè)。

1.5 檢驗(yàn)步驟

1.5.1 樣品接收

實(shí)驗(yàn)室接收到能力驗(yàn)證樣品后應(yīng)先確認(rèn)樣品包裝狀態(tài)是否完好，識(shí)別瓶身標(biāo)識(shí)并進(jìn)行登記，仔細(xì)閱讀參試指導(dǎo)書。能力驗(yàn)證樣品收到后應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè)，如不能立即檢測(cè)，按照參試指導(dǎo)書要求在指定溫度下進(jìn)行保存。

1.5.2 樣品處理

樣品需要用520 mL 無(wú)菌水再水化。樣品開(kāi)啟后，立即加入10 mL 無(wú)菌水進(jìn)行再水化，待溶解后，吸出放入無(wú)菌瓶中，再反復(fù)用余下的無(wú)菌水清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液放入上述無(wú)菌瓶中，此溶液即是待測(cè)樣品原液。操作各環(huán)節(jié)應(yīng)保證無(wú)菌和充分混勻。

1.5.3 15 管發(fā)酵試驗(yàn)

用移液槍吸取10 mL 樣品原液置于盛有90 mL 無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中，充分混勻，制成1∶10 的樣品勻液。按照相同方式制備10 倍系列稀釋樣品勻液。選擇2 個(gè)～3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液分別做15 管發(fā)酵，輕搖試管（避免小倒管中產(chǎn)生氣泡），使液體充分混合，置36℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取一接種環(huán)產(chǎn)酸產(chǎn)氣陽(yáng)性管培養(yǎng)液，接種到10 mL BGLB 中，置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。觀察BGLB 管中小倒管內(nèi)的產(chǎn)氣情況，如有氣體產(chǎn)生，確定為大腸菌群陽(yáng)性。

1.5.4 51 孔定量盤法

檢測(cè)所需水樣為100 mL，將待測(cè)樣品原液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇2 個(gè)～3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液進(jìn)行檢測(cè)。將100 mL 待測(cè)水樣加入到無(wú)菌三角瓶中，加入科立得試劑，混合均勻使之完全溶解后倒入51 孔定量盤中，輕拍除去氣泡，熱封后于36℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.5.5 陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照

采用大腸埃希氏菌（CGMCC1.90）作為陽(yáng)性對(duì)照菌株，制備成菌液濃度約為10 CFU/mL～102CFU/mL 的菌懸液，采用同批次無(wú)菌生理鹽水做空白對(duì)照，按1.5.3 節(jié)和1.5.4 節(jié)方法接種培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 15 管發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

兩份樣品經(jīng)乳糖膽鹽發(fā)酵后產(chǎn)酸、產(chǎn)氣陽(yáng)性管轉(zhuǎn)接種于BGLB 培養(yǎng)仍為陽(yáng)性。陽(yáng)性菌株接種管均有陽(yáng)性反應(yīng)，空白對(duì)照管均沒(méi)有菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)有效。大腸菌群15 管發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室綜合評(píng)定，將人員2 的15 管發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果作為最終結(jié)果并上報(bào)，即樣品1#中大腸菌群的濃度為7.9×104MPN/100 mL，樣品2#中大腸菌群的濃度為5.4×104MPN/100 mL。

表1 2 份樣品大腸菌群15 管發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

2.2 51 孔定量盤試驗(yàn)結(jié)果

本次能力驗(yàn)證樣品再水化后液體量較大，為了進(jìn)一步考察實(shí)驗(yàn)室不同人員、不同方法對(duì)同一指標(biāo)的檢測(cè)能力，采用51孔定量盤法對(duì)待測(cè)原液進(jìn)一步檢測(cè)。陽(yáng)性菌株接種培養(yǎng)定量盤均呈黃色，生理鹽水接種空白對(duì)照定量盤無(wú)顏色變化，試驗(yàn)有效。大腸菌群51 孔定量盤試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 2 份樣品大腸菌群51 孔定量盤試驗(yàn)結(jié)果

2.3 能力驗(yàn)證結(jié)果

能力驗(yàn)證提供者對(duì)參加者的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，按式（1）進(jìn)行z值計(jì)算。|z|≤2.0 為滿意結(jié)果，2.0 ＜|z|＜3.0為可疑結(jié)果，|z|≥3.0 為不滿意結(jié)果（離群值）。

式中：x-參加者檢測(cè)結(jié)果；X-指定值；σ-能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)偏差。

本次能力驗(yàn)證共有33 家實(shí)驗(yàn)室參加并反饋結(jié)果，能力驗(yàn)證提供者采用穩(wěn)健平均值作為指定值，采用穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差作為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差，指定值和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差如表3 所示。忽略單一實(shí)驗(yàn)室反饋數(shù)值對(duì)整體能力驗(yàn)證指定值和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差的影響，對(duì)本次實(shí)驗(yàn)室獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行z值分析，分析結(jié)果如表4所示。

表3 指定值和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差匯總

表4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總及z 值分析

2.4 質(zhì)量控制分析

2.4.1 過(guò)程分析

微生物檢測(cè)領(lǐng)域能力驗(yàn)證檢測(cè)周期較短，樣品處理后需要及時(shí)檢測(cè)，不容復(fù)測(cè)，具有一定難度，這就要求實(shí)驗(yàn)室提前做好各項(xiàng)準(zhǔn)備工作，對(duì)過(guò)程中可能出現(xiàn)的不穩(wěn)定因素進(jìn)行必要控制。以本次能力驗(yàn)證為例對(duì)操作過(guò)程進(jìn)行簡(jiǎn)要分析：

（1）實(shí)驗(yàn)室在接到寄樣通知后需要關(guān)注樣品物流進(jìn)度，及時(shí)收樣，收到樣品后檢查樣品狀態(tài)，如不能及時(shí)檢測(cè)，需要按照參試指導(dǎo)書要求進(jìn)行存儲(chǔ)。

（2）確定能力驗(yàn)證試驗(yàn)方法，一般情況下參試指導(dǎo)書會(huì)給出推薦方法，實(shí)驗(yàn)室也可以根據(jù)日常檢測(cè)情況選擇常用方法，方法確定后對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要用到的儀器、設(shè)備、環(huán)境進(jìn)行核查，確保各項(xiàng)參數(shù)以滿足試驗(yàn)要求。

（3）微生物檢測(cè)試驗(yàn)所用的耗材、試劑均需要進(jìn)行滅菌處理，同時(shí)要監(jiān)測(cè)滅菌效果。不同培養(yǎng)基滅菌溫度條件可能不同，配制時(shí)要嚴(yán)格按照相應(yīng)要求進(jìn)行操作，避免其成分性狀發(fā)生改變。

（4）再水化是能力驗(yàn)證操作過(guò)程中的第一步，也是至關(guān)重要的一步，會(huì)對(duì)后面整體試驗(yàn)過(guò)程產(chǎn)生不可逆的影響。參試指導(dǎo)書中給出了詳細(xì)的再水化操作，操作人員要仔細(xì)閱讀并按照要求進(jìn)行試驗(yàn)，一般反復(fù)清洗西林瓶?jī)?nèi)壁不少于3 次，以保證獲得全部待測(cè)樣品。

（5）能力驗(yàn)證樣品模擬污染水體的實(shí)際情況，添加多種背景菌，增加考核難度，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)參試指導(dǎo)書要求，預(yù)先判斷樣品污染程度并進(jìn)行稀釋，以保證結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確性。試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)根據(jù)需要增加陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照，降低對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的誤判，以保證結(jié)果的可靠性。

（6）按照參試指導(dǎo)書和結(jié)果報(bào)告單中要求報(bào)告結(jié)果，按實(shí)驗(yàn)室要求填寫能力驗(yàn)證原始記錄，檢驗(yàn)原始記錄詳實(shí)，包含試驗(yàn)環(huán)境、設(shè)備、試劑、操作步驟以及關(guān)鍵步驟下的結(jié)果、結(jié)論等信息，以便審核人員進(jìn)行復(fù)核。

2.4.2 結(jié)果分析

將數(shù)據(jù)錄入SPSS 27 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，1#測(cè)試結(jié)果P=0.105、2#測(cè)試結(jié)果P=0.616，實(shí)驗(yàn)室不同人員采用2 種方法對(duì)2 份能力驗(yàn)證樣品檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05），且3 名檢測(cè)人員的2 種方法檢測(cè)|z|值均≤2.0，均可以順利通過(guò)本次能力驗(yàn)證。

2.4.3 檢測(cè)方法分析

從檢測(cè)方法來(lái)看，51 孔定量盤法|z|值較小，最大為0.3，準(zhǔn)確性高于15管發(fā)酵法，無(wú)需確認(rèn)試驗(yàn)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短，可以很好地滿足實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)需求，特別是應(yīng)對(duì)大批量或應(yīng)急檢測(cè)，不足之處是成本較高；15 管發(fā)酵法|z|值差別較大，最小0.1，最大1.3，對(duì)人員操作熟練度要求較高，相較于51孔定量盤法操作繁瑣，前期準(zhǔn)備試劑、耗材較多，需要確認(rèn)試驗(yàn)，檢測(cè)周期長(zhǎng)，但檢測(cè)成本低，整體滿足日常檢測(cè)需求，不適應(yīng)大批量或者應(yīng)急檢測(cè)。

2.4.4 人員操作分析

為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室多名檢測(cè)人員能力，本次能力驗(yàn)證由3 名人員同時(shí)進(jìn)行。操作均在生物安全柜中進(jìn)行，移液槍加樣，固定溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用儀器設(shè)備均在計(jì)量有效期內(nèi)，且進(jìn)行了期間核查，一定程度內(nèi)排除儀器設(shè)備對(duì)試驗(yàn)的影響。從表4可以看出人員2 檢測(cè)結(jié)果更接近于樣品指定值，人員3 檢測(cè)結(jié)果誤差較大，分析原因是在日常檢測(cè)工作中人員3 對(duì)大腸菌群項(xiàng)目檢測(cè)次數(shù)較人員1 和人員2 少，熟練程度低。通過(guò)本次能力驗(yàn)證可以有效評(píng)價(jià)檢測(cè)人員操作水平，為后續(xù)人員培訓(xùn)、監(jiān)督、考核提供依據(jù)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)室由3 名檢測(cè)人員采用GB 8538-2022 中15 管發(fā)酵法和GB/T 5750.12-2023 中51 孔定量盤法對(duì)本次能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行大腸菌群檢測(cè)，|z|值均≤2.0，可以順利通過(guò)本次能力驗(yàn)證。15 管發(fā)酵法和51 孔定量盤法均可以滿足日常檢測(cè)需求，51 孔定量盤法操作更為便捷，可以應(yīng)對(duì)大批量或應(yīng)急檢測(cè)。

通過(guò)本次礦泉水中大腸菌群的檢測(cè)能力驗(yàn)證活動(dòng)，有效利用z值結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)水平進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)檢驗(yàn)人員的業(yè)務(wù)能力，對(duì)試驗(yàn)過(guò)程中可能存在的問(wèn)題進(jìn)行預(yù)防和糾正，同時(shí)完善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和管理。能力驗(yàn)證作為實(shí)驗(yàn)室重要的外部質(zhì)量控制手段，可以有效考核實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力，有利于實(shí)驗(yàn)室自我評(píng)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制具有重要意義。