層層自組裝修飾PLGA納米載體的制備及藥物釋放

郭 俊,童 菲,王 沛

(1.南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院a.牙體牙髓病科; b.正畸一科; c.中心實驗室; 2.江西省口腔生物醫(yī)學(xué)重點實驗室; 3.江西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,南昌 330006)

如何有效實現(xiàn)藥物的可控與持續(xù)釋放,以及提高其有效性、降低不良反應(yīng),是功能性藥物載體所面臨的重要挑戰(zhàn)[1]。納米藥物載體的表面化學(xué)修飾因反應(yīng)劇烈,且易破壞納米粒的結(jié)構(gòu),一直是一個技術(shù)難點。層層自組裝技術(shù)(Layer-by-layer self-assembly technology,LbL技術(shù))主要利用聚電解質(zhì)的靜電作用進行表面修飾,反應(yīng)溫和、操作簡單、可控性強,為納米載體的功能多樣化提供新思路[2-3]。近年來,LbL技術(shù)在納米藥物載體方面的應(yīng)用越來越多,LbL納米藥物載體憑借其多功能性和結(jié)構(gòu)的可控性而備受關(guān)注[4-5]。例如LbL納米藥物載體容易實現(xiàn)化療和基因治療的結(jié)合,負載功能基團表現(xiàn)出的刺激響應(yīng)控釋,連接靶向基團對癌細胞表現(xiàn)出的靶向性[6]。聚鳥氨酸(Poly-L-ornithine,PLO)是由L-鳥氨酸組成的聚陽離子,其側(cè)鏈上有一個伯胺。且PLO是一種低免疫源性的聚陽離子化合物,具有多種生物活性和良好的生物安全性[7-8]。巖藻聚糖(Fucoidan,Fu)是海帶等褐藻所固有的細胞間多糖,存在于褐藻細胞壁基質(zhì)中,是褐藻所特有的生物活性物質(zhì)。主要由L-巖藻糖組成,并以α-1,3糖苷鍵連接,含有大量硫酸酯基團。巖藻聚糖作為聚陰離子具有抗凝血、降血脂、增強機體免疫機能等多種生理活性,以及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力[9-10]。實現(xiàn)靶器官、靶組織或靶細胞等特定的生理位置釋放藥物,是靶向藥物載體的最終目標(biāo)。納米藥物特異性識別腫瘤細胞有助于提高其在腫瘤部位的滯留量,以減少不良反應(yīng)和提高療效[11-12]。核仁素是真核細胞核仁中的主要蛋白質(zhì),在腫瘤細胞膜表面大量表達,充當(dāng)多種蛋白質(zhì)分子的共受體,可以作為腫瘤藥物的標(biāo)記物。核酸適配體是利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)的體外篩選技術(shù),將核酸分子庫中得到的寡核苷酸片段,折疊成明確的三維結(jié)構(gòu),為其與靶分子特異性結(jié)合提供基礎(chǔ)[13-14]。核酸適配體(Aptamer,Apt)AS1411對核仁素具有較高的親和力[15],AS1411含有26個核苷酸,能形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu),其序列是5′-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3′。

本文選用PLGA納米粒負載抗腫瘤藥物阿霉素(Doxorubicin,Dox)(PD NPs),然后利用聚鳥氨酸和巖藻聚糖層層自組裝PD NPs。并將含有氨基的PLO和含有醛基的CHO-PEG-COOH進行醛胺反應(yīng)形成接枝共聚物,再與氨基修飾的AS1411進酰胺反應(yīng)結(jié)合,最后自組裝到納米粒,構(gòu)建具有靶向功能的層層自組裝納米粒。同時,優(yōu)化工藝條件,表征納米粒各項理化性能,使其嚴(yán)格符合給藥要求。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

PLO(分子量30～70 kDa)購買于西格瑪奧德里奇試劑有限公司;Fucoidan(分子鏈200～400 kDa)購買于山東潔晶集團股份有限公司;阿霉素(純度≥98%)購買于大連美倫生物技術(shù)有限公司。

1.2 負載Dox的PLGA納米粒的制備

利用超聲乳化溶劑揮發(fā)法制備負載Dox的PLGA NPs(PD NPs),將20 mg的PLGA溶于1 mL 二氯甲烷作為油相置于冰浴中,4 mL 2%的BSA水溶液(即80 mg的BSA溶于4 mL水)和3 mg 的Dox為水相,用注射器將油相逐滴加入水相中,冰浴下功率1000 W超聲60 s,立刻將乳液倒入100 mL超純水中,磁力攪拌5 h揮發(fā)有機相。12 000 轉(zhuǎn)、10 min離心收集納米粒,超純水清洗3次,冷凍干燥后4 ℃冰箱保存。

1.3 PLO-g-PEG-COOH共聚物的合成及檢測

將92 mg的PLO溶于7 mL的pH 8.5的四硼酸鈉緩沖液中,使鳥氨酸單體的濃度達到100 mmol·L-1。隨后加入173 mg的OHC-PEG-COOH(Mw 2 kDa)。室溫下攪拌6 h,混合物裝入截留分子量8～12 kDa的透析袋置于超純水中透析,每隔12 h換1次超純水除去未反應(yīng)的OHC-PEG-COOH,透析時間為4 d。冷凍干燥后在-20 ℃下保存。

分別對PLO、CHO-PEG-COOH和PLO-g-PEG-COOH進行核磁共振氫譜(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)和紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)檢測。

1.4 層層自組裝PD NPs的制備

將1 mg·mL-1的PLO溶液調(diào)節(jié)pH為4.0,1 mg·mL-1巖藻聚糖溶液用0.22 μm濾膜過濾后調(diào)節(jié)pH為9.0。按照納米粒：聚電解質(zhì)=1：1的比例進行層層組裝,每層攪拌時間20 min;組裝完一層后,離心得到組裝后的納米粒,再組裝下一層。最后一層組裝聚電解質(zhì)為PLO-g-PEG-COOH,得到層層自組裝PD NPs(LPD NPs)。

1.5 核酸適配體AS1411的修飾及檢測

將1 mg·mL-1的納米粒在100 μL的乙醛(CH3CHO)溶液中孵化10 min封閉掉多余的氨基(-NH2)。水洗2遍,然后將納米粒和1 mg的NaBH4反應(yīng)10 min,減少席夫基團。水洗2遍,加入0.5 mg的N-羥基琥珀酰亞胺以活化羧基,15 min 后加入1 mL的1 mg·mL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和2 μg的AS1411-NH2,震蕩下反應(yīng)15 min,得到修飾AS1411的納米粒(LAPD NPs)。

為了檢測核酸適配體AS1411連接到LPA NPs,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。將6×loading buffer(2 μL)和10 μL樣品混合均勻后,分別加入不同的加樣孔內(nèi),進行電泳。將分散后的納米粒滴在300目的銅網(wǎng)上,置于真空干燥箱中過夜干燥,然后進行透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)來觀察納米粒的形貌。

1.6 層層自組裝過程的監(jiān)測

通過石英微晶天平(Quartz crystal microbalance,QCM)監(jiān)測層層自組裝的過程。在0.5 mol·L-1的NaCl溶液中建立穩(wěn)定的基線,石英晶體的電極吸附0.5 mg·mL-1的(PLO/Fucoidan),每層吸收15 min,0.5 mg·mL-1的PLO-g-PEG-COOH注入15 min,0.1 mg·mL-1乙醛(CH3CHO),0.5 mg·mL-1的NHS和EDC,10 μg·mL-1的AS1411-NH2依次泵入,保持20 min,石英微晶天平記錄其變化量。將每次組裝后的樣品取0.5 mg測定其Zeta電位,以確定每一層是否組裝上相應(yīng)的聚電解質(zhì)。

1.7 載藥自組裝微球?qū)ox的釋放率的測定

紫外-可見分光光度計在波長300～800 nm的范圍內(nèi)對Dox溶液掃描,判斷Dox的最大吸收峰為480 nm,并測定Dox在純水和pH 7.4的PBS溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算載藥量和包封率。將LAPD NPs裝入透析袋中,分別置于pH 5.5和pH 7.4的PBS溶液中,于37 ℃、100 轉(zhuǎn)·min-1搖床中進行藥物釋放。每隔0.5、1、2、4、6、9、12、24 h…取樣,并加入同體積的PBS溶液。在480 nm波長處檢測紫外吸收值,計算釋放的Dox濃度,繪制藥物釋放曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 PD NPs的形貌

利用牛血清白蛋白作為表面活性劑,通過超聲乳化溶劑揮發(fā)法制備了負載Dox的PLGA NPs(PD NPs),其TEM如圖1A和1B所示。通過TEM觀察其形貌可以看到PD NPs分散性良好、大小均一、球形度完整,平均粒徑為100 nm左右。說明乳化溶劑揮發(fā)法不僅操作簡單,而且制備得到的樣品質(zhì)量好,牛血清白蛋白作為表面活性劑既能保證納米粒的穩(wěn)定性,又能維持其分散性。

2.2 PLO-g-PEG-COOH的驗證

通過核磁共振氫譜和傅立葉紅外光譜檢測合成的產(chǎn)物,如圖2A所示通過1H-NMR對所得產(chǎn)物PLO-g-PEG-COOH結(jié)構(gòu)進行驗證,化學(xué)位移4.7處為D2O的特征峰,化學(xué)位移1.6、2.9、4.3處為PLO的特征峰,3.6處為PEG的特征峰,在PLO-PEG的氫譜圖中化學(xué)位移都向左發(fā)生偏移,且1.6處化學(xué)位移變寬,說明PLO-g-PEG-COOH成功合成。在紅外光譜圖2B中,PLO-g-PEG-COOH在波數(shù)2800 cm-1處有一個強吸收單峰,是-CHO的吸收峰,在PLO和PLO-g-PEG-COOH中沒有出現(xiàn)這樣的強吸收單峰,此實驗結(jié)果表明PLO和PEG成功結(jié)合為接枝共聚物。

A:核磁共振氫譜;B:紅外光譜圖。圖2 PLO、CHO-PEG-COOH、PLO-g-PEG-COOH的表征檢測

2.3 層層自組裝的監(jiān)測結(jié)果

為了觀察聚電解質(zhì)靜電吸附層層自組裝PD NPs的過程,通過石英微晶天平來實時監(jiān)測,用Zeta電位檢測層層自組裝的表面修飾。如圖3A所示,首先通入NaCl溶液,依次是組裝上的PLO、Fucoidan等。為了連接核酸適配體AS1411,組裝接枝共聚物PLO-g-PEG-COOH,加入的乙醛溶液及NHS和EDS,最后一個是共價結(jié)合上的AS1411。通過觀察基線的變化可以看出,每一層都成功組裝上了LPD NPs。且每組裝一層都沒有降低上一層聚電解質(zhì)的吸附,說明層層自組裝的聚電解質(zhì)層穩(wěn)定性良好。此外,如圖3B所示,由于牛血清白蛋白作為其表面活性劑,故PD NPs的Zeta電位為負值,約為-38 mV。PLO為聚陽離子,故組裝后的PD-PLO NPs的Zeta電位為正值,實現(xiàn)了電荷的反轉(zhuǎn)。Fucoidan為聚陰離子,故組裝后的PD-(PLO/Fu) NPs的Zeta電位為負值。同樣的原理,每組裝一層都實現(xiàn)了Zeta電位的翻轉(zhuǎn),也說明了聚電解質(zhì)成功地層層自組裝到PD NPs上。

A:石英微晶天平(QCM)掃描圖;B:Zeta電位檢測。圖3 層層自組裝過程的監(jiān)測

2.4 LAPD NPs的理化性質(zhì)表征

為了進一步確定核酸適配體AS1411成功連接到納米粒上,進行了瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖4所示,電泳加樣孔中A是核酸適配體AS1411,B是納米粒,C是LPD NPs和AS1411的混合,D是LPA NPs。A、C和D有熒光,而B沒有熒光,因為B中不含有核酸。且A和C的核酸在電泳中的位置相同,而D的核酸位置在加樣孔附近,說明通過共價結(jié)合的納米粒和AS1411結(jié)合牢固,而LPD NPs和AS1411簡單結(jié)合后并不牢固。故聚電解質(zhì)成功地組裝上PLGA納米粒,且納米粒和AS1411結(jié)合牢固。在凝膠電泳電流的作用下,LAPD NPs上的AS1411結(jié)合牢固,也說明層層自組裝納米粒的穩(wěn)定性良好,受電流的影響不明顯。

A:AS1411;B:LP NPs;C:LPD NPs和AS1411的混合;D:LAPD NPs。

LAPD NPs的形貌見圖5,與未組裝前的PD NPs相比,其粒徑略有增大,平均粒徑約為150 nm。LAPD NPs呈核殼型結(jié)構(gòu),粒徑大小均一,球形度完整,自組裝效果良好。說明通過溫和的層層自組裝過程并不會改變納米粒的形態(tài),且最外層修飾上核酸適配體AS1411的過程也對納米粒的形態(tài)影響很小。綜上,由于靜電作用層層自組裝溫和的表面修飾,故對納米粒的形貌及理化性質(zhì)影響很小。

A:較小倍數(shù)(scale bar=0.5 μm);B:較大倍數(shù)(scale bar=50 nm)。圖5 載藥后的LAPD NPs的形貌(TEM)

2.5 LAPD NPs的藥物釋放

根據(jù)測定的Dox的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算LAPD NPs的載藥量及藥物釋放曲線。如圖6A所示,Dox的最大吸收峰在480 nm處。圖6B所示,Dox在PBS中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.018 0x-0.003,回歸系數(shù)R2為0.999 3,說明其線性相關(guān)性良好。通過Dox的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算LAPD NPs的載藥量為(2.32±0.04)%,包封率為(15.89±0.31)%。隨后,對LAPD NPs的體外釋藥行為進行測定,Dox的體外釋放情況見圖7。在模擬生理環(huán)境(pH=7.4)的條件下,LAPD NPs持續(xù)緩慢地釋放出Dox,28 d的釋放時間內(nèi),Dox的累積釋放率約為55%,說明Dox仍持續(xù)地從納米粒中釋出。隨著藥物的持續(xù)釋放,自組裝層之間的組分減少,可能導(dǎo)致聚電解質(zhì)之間的靜電作用減弱,故造成400 h后Dox的釋放率顯著升高,且釋放速率越來越高。LAPD NPs的釋藥曲線可表明具有良好的藥物緩釋能力。

A:Dox全波長掃描;B:Dox在pH 7.4的PBS中標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6 Dox的性質(zhì)檢測

圖7 LAPD NPs中阿霉素釋放曲線

3 結(jié)論

本文構(gòu)建的LAPD NPs首先利用超聲乳化溶劑揮發(fā)法制備負載Dox的PLGA納米粒,其次通過層層自組裝技術(shù)包裹上聚鳥氨酸和巖藻聚糖,最后連接核酸適配體AS1411賦予其靶向功能。超聲乳化溶劑揮發(fā)法制備的PD NPs大小均一,粒徑約為100 nm,其Zeta電位約為-30 mV,利于聚電解質(zhì)的負載。通過石英微晶天平觀察了其層層自組裝過程,每組裝一層其基線的變化說明了聚電解質(zhì)組裝成功,且Zeta電位的正負翻轉(zhuǎn)也證實了這點。此外,合成了接枝共聚物PLO-g-PEG-COOH,并通過酰胺反應(yīng)連接靶向基團核酸適配體AS1411。經(jīng)核磁共振氫譜和紅外光譜驗證了聚合物的結(jié)構(gòu),并通過瓊脂糖凝膠色譜檢測核酸適配體的成功鍵接。對載藥納米粒LAPD NPs進行了載藥率、包封率和藥物釋放率的測定,結(jié)果顯示LAPD NPs具有緩慢釋放藥物特性。故LAPD NPs通過靜電作用的層層自組裝技術(shù)實現(xiàn)了納米藥物載體的多種功能,這種弱相互作用力結(jié)合的形式相對化學(xué)鍵結(jié)合更方便且易操作。