香菇多糖通過細胞凋亡和細胞周期阻滯增強食管癌細胞的放射敏感性

趙桂芳,吳 琛

(1.江西省人民醫(yī)院,南昌醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤科; 2.南昌大學第二附屬醫(yī)院眼科,南昌 330006)

全球食管癌每年新發(fā)病例為60多萬例[1],而我國食管癌每年新發(fā)為30多萬例,占全球年新發(fā)病例數(shù)的一半[2]。我國食管癌居國內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率的第4位,病死率的第6位,即使是早期可行手術(shù)治療的患者,其5年生存率僅約10%～25%,預(yù)后非常差[3-4]。臨床上約80%的食管癌患者處于中晚期,治療手段非常有限。目前放療是食管癌的重要治療手段,但放射抗拒是臨床治療中最常見的問題。放射抗拒導(dǎo)致放療后腫瘤局部復(fù)發(fā)仍是目前影響食管癌患者生存的重要因素。

臨床上常用化療藥物來增強食管癌的放療敏感性,但這類藥物對食管癌患者總生存時間的改善已處于瓶頸期,因此尋找新的放療增敏劑來提高腫瘤患者的生存率顯得尤為必要。有研究[5]表明,藥食同源的香菇多糖(Lentinan,LNT)對乳腺癌、肺癌、消化道腫瘤等多種腫瘤及惡性胸腹腔積液均具有抑制作用,其主要抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移及血管生成等。既往有臨床研究[6]證實LNT能增加食管癌患者的放療療效,但其機制尚不清楚。故本研究旨在觀察LNT對人食管癌細胞Eca109的放療增敏作用,并初步探討其放療增敏的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人食管癌Eca109細胞株由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心贈送。

LNT(規(guī)格2 mL：1 mg)購自金陵藥業(yè)股份有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;青鏈霉素購于美國Hyclone公司;MTT試劑購自美國Biosharp公司;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國BD公司;碘化丙啶(PI)試劑購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將人食管癌細胞Eca109復(fù)蘇后,用含有RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,待細胞長至80%～90%時,用0.25%的胰酶消化后傳代。取對數(shù)期生長的Eca109細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT試驗

將Eca109細胞接種于96孔板中,貼壁后分別加入不同質(zhì)量濃度(0、6.125、12.5、25.、50、100、200、400、800 μg·mL-1)LNT處理24 h,然后用MTT溶液避光孵育4 h后每孔加入DMSO溶解振蕩,待其混合均勻后用酶標儀在490 nm波長條件下測定各孔的吸光度(OD)值。抑制率(IR)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。實驗重復(fù)3次。根據(jù)各組抑制率篩選LNT后續(xù)質(zhì)量濃度。

1.2.3 克隆形成實驗

實驗分為2組:LNT+放療組、單純放療組。取對數(shù)期生長的Eca109細胞,將細胞懸液充分混勻后接種到6孔板中,LNT+放療組用200 μg·mL-1LNT作用24 h后予以不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)放療,單純放療組僅予以不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)放療。培養(yǎng)細胞定期換液,于37 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7～14 d后予以甲醇固定,結(jié)晶紫染色,計數(shù)2組形成的克隆球數(shù)(50個以上細胞形成的細胞團為1個克隆球)。計算細胞的集落形成率(PE):PE=單純放療組克隆球形成數(shù)/單純放療組接種細胞數(shù)×100%。利用PE計算細胞存活分數(shù)(SF):SF=LNT+放療組克隆形成數(shù)/LNT+放療組接種細胞數(shù)×集落形成率。采用SigmaPlot軟件擬合細胞存活曲線。采用簡單多靶單擊模型計算放射敏感性相關(guān)參數(shù)放射增敏比(SER),分析LNT對Eca109細胞放療敏感性的影響并篩選后續(xù)放療劑量。

1.2.4 流式細胞術(shù)測細胞凋亡和細胞周期

實驗分為4組:對照組、LNT組、單純放療組、LNT+放療組,其中LNT質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1,放療劑量為2 Gy。取對數(shù)期生長的Eca109細胞,將細胞懸液充分混勻后接入6孔板中,4組細胞均處理24 h。細胞凋亡實驗用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色,室溫下放置15 min后流式細胞儀上機檢測,計算各組細胞凋亡率。細胞周期實驗用乙醇固定各組細胞、RNA酶溶解、水浴、PI染色后,流式細胞儀上機檢測,統(tǒng)計并分析各組在G1、S、G2/M期的分布情況。

1.2.5 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件、Photoshop軟件、SPSS 22.0軟件分別對實驗圖像和實驗數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示;2組間比較采用獨立樣本t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LNT對人食管癌Eca109細胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示,與0 μg·mL-1LNT組比較,隨著LNT質(zhì)量濃度的增加,其對Eca109細胞的抑制率增高(均P<0.05)。見圖1。后續(xù)實驗選取200 μg·mL-1為LNT的質(zhì)量濃度。

LNT/(μg·mL-1)#P<0.05,*P<0.01與0 μg·mL-1LNT組比較。圖1 不同質(zhì)量濃度LNT對食管癌細胞Eca109增殖的影響

2.2 LNT對Eca109細胞的放療增敏作用

與單純放療組比較,LNT+放療組的SF顯著降低,放療增敏比SER為1.27。見圖2。后續(xù)實驗選擇2 Gy為放療的劑量。

2.3 LNT聯(lián)合放療對Eca109細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,對照組、LNT組、單純放療組、LNT+放療組的細胞凋亡率分別為(4.82±1.42)%、(32.21±1.90)%、(14.14±3.07)%和(55.58±1.87)%。與其他3組比較,LNT+放療組的細胞凋亡率更高(t=37.301、15.13、19.937,均P<0.01)。見圖3—4。

2.4 LNT聯(lián)合放療對Eca109細胞周期的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,對照組、LNT組、單純放療組、LNT+放療組的G2/M期的比例分別為(12.55±1.18)%、(20.91±1.38)%、(38.96±1.53)%、(48.86±3.94)%。與其他3組比較,LNT+放療組G2/M期比例更高(t=15.256、11.572、4.049,均P<0.01)。見圖5—6。

圖5 各組細胞周期分布情況(流式細胞術(shù))

*P<0.01。圖6 各組細胞周期的分布

3 討論

我國食管癌常見的病理類型是鱗癌和腺癌,其中鱗癌占90%以上,惡性程度高,預(yù)后差[7]。為延長患者的生存時間,降低局部復(fù)發(fā)率,臨床多采用手術(shù)、放療、化療、靶向及免疫等綜合治療手段,其中放療可顯著降低食管癌的復(fù)發(fā)率[8],因此如何提高食管癌患者的放療敏感性是延長患者生存時間的關(guān)鍵。臨床上,以鉑類、紫杉類、氟尿嘧啶類為代表的化療藥物是目前用于增強食管癌放療敏感性的常見藥物[9],但療效仍不理想,而且這類藥物存在嚴重的不良反應(yīng),甚至部分患者因不良反應(yīng)太大而未能繼續(xù)放療。

LNT是從香菇中提取的一種天然生物活性純化多糖,安全性高[10]。臨床研究[11]表明LNT具有免疫調(diào)節(jié)、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長等作用。動物研究[12]發(fā)現(xiàn)LNT聯(lián)合AdIRF3可通過刺激INF-β的表達而抑制小鼠乳腺癌的生長。另有研究[13]采用LNT處理人結(jié)直腸癌SW837細胞,發(fā)現(xiàn)LNT呈濃度依賴性抑制SW837細胞的增殖,同時CD155、CD80、CD47、HSP70、HSP90等免疫相關(guān)分子的表達水平升高。同步放化療聯(lián)合LNT治療非小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移也發(fā)現(xiàn),該治療可延長患者生存時間,提高其生存率及局部控制率[14]。本課題組[15]在臨床工作中發(fā)現(xiàn)使用LNT的食管癌患者,腫瘤明顯縮小,且放療相關(guān)的不良反應(yīng)發(fā)生率低。本研究發(fā)現(xiàn)LNT呈濃度依賴性抑制人食管癌細胞Eca109的生長,且能顯著增加人食管癌細胞Eca109的放療敏感性。

王嶸等[16]研究發(fā)現(xiàn),LNT的放療增敏作用機制可能與誘導(dǎo)細胞周期阻滯和激活ERK1/2信號通路有關(guān)。細胞周期分為G0、G1、S和G2/M期,其中G2/M期細胞對放療最敏感。故細胞周期阻滯在G2/M期是增強放療敏感性的標志之一。本研究發(fā)現(xiàn),LNT+放療組細胞周期阻滯在G2/M期的比例最高,表明LNT聯(lián)合放療可能通過將細胞周期阻滯在G2/M期實現(xiàn)放療增敏。另有研究[17]顯示,LNT通過下調(diào)凋亡抑制蛋白survivin的表達,進而促進人胰腺癌細胞ASPC-1的凋亡。本研究結(jié)果顯示,LNT+放療組的Eca109細胞凋亡率明顯增強,提示LNT的放療增敏作用是通過促進細胞凋亡實現(xiàn)的。

綜上,本研究在細胞水平證實LNT對食管癌具有放療增敏作用,其機制可能是通過誘導(dǎo)細胞凋亡和G2/M期細胞周期阻滯來實現(xiàn)的。但介導(dǎo)LNT放療增敏的信號通路尚不清楚,有待后續(xù)深入研究。