解整合素-金屬蛋白酶33基因多態(tài)性與膽管癌及血清腫瘤標(biāo)志物水平的相關(guān)性研究

邱 雷,危貴君

邱雷,危貴君,湖州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省湖州市 313000

0 引言

膽管癌(cholangiocarcinoma,CC)是發(fā)源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,根據(jù)病灶的解剖部位可分為肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝外膽管癌.ICC的惡性程度較高,發(fā)病隱匿,約占膽管癌的十分之一,患者預(yù)后差[1].目前認(rèn)為其發(fā)病與肝炎、糖尿病、吸煙、飲酒、基因多態(tài)性、肥胖等多種因素有關(guān).由于CC臨床癥狀不典型,早期發(fā)現(xiàn)較為困難,且病情發(fā)展迅速,尚缺乏有效根治手段,手術(shù)、放療及化療等常規(guī)抗腫瘤的遠(yuǎn)期療效不佳,易導(dǎo)致術(shù)后的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差[2,3].因此,尋找新的診療手段具有重要臨床意義.

解整合素-金屬蛋白酶(disintegrin and metalloproteinase,ADAM)33為ADAM家族的一員[4],能夠通過(guò)其所擁有的解體蛋白及金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域加速細(xì)胞-細(xì)胞-基質(zhì)之間的相互作用,在腫瘤、炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5,6].張國(guó)華等[7]研究顯示,膽管癌組織中ADAM33蛋白表達(dá)顯著升高,且與預(yù)后不良有關(guān).馬蘭紅等[8]研究發(fā)現(xiàn)攜帶ADAM33 rs678881GC、CC基因型的支氣管哮喘患兒血漿白細(xì)胞介素-4、免疫球蛋白E水平較高而γ-干擾素水平較低,且消化道反應(yīng)的發(fā)生率高,ADAM33 rs678881GC、CC基因型可能參與了兒童支氣管哮喘的發(fā)展.故本研究觀察了CC患者腫瘤組織中ADAM33 rs678881及rs2853209基因SNP的表達(dá)水平并分析ADAM33 rs678881及rs2853209與CC的易感性.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2017-01/2020-06期間于我院診治的膽管癌手術(shù)患者212例作為研究組,其中男性109例、女性103例,年齡(65.2±16.4)歲;腫瘤部位:肝內(nèi)膽管癌患者114例,肝外膽管癌患者98例;分化程度:高、中、低分化者分別為17例、139例及56例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者136例;術(shù)后1年復(fù)發(fā)或出現(xiàn)進(jìn)展者71例;臨床分期:Ⅰ/Ⅱ期73例,Ⅲ/Ⅳ期139例.納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者均行膽管癌切除手術(shù),且術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)確診為膽管癌;(2)術(shù)前均未進(jìn)行抗腫瘤治療;(3)臨床資料完整.以同期在我院體檢的健康查體者186例作為對(duì)照組,患者均無(wú)合并免疫性疾病、無(wú)嚴(yán)重心肺肝腎疾病.其中,男性97例、女性89例,年齡(63.3±17.5)歲.兩組病例的性別、年齡基線資料比較無(wú)差異,具有可比性.本研究已獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批.

1.2 方法

1.2.1 基因序列的SNP檢測(cè):患者入院后即抽取空腹肘部靜脈血,采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)法進(jìn)行SNP的檢測(cè).采用貝克曼公司生產(chǎn)的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行外周血DNA提取,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,鑒定DNA的濃度及純度并采用核酸電泳檢測(cè)序列的完整性,進(jìn)行PCR反應(yīng),ADAM33 rs678881上游引物5′-TTCAAAGCCTCCCCCTCTCATC-5′,下游引物5′-TGATCCAGGAAAAGCCACAGC-3′;ADAM33 rs2853209上游引物5′-AGGGTGAGGCAGCCAGCT-3′,下游引物5′-CTTCCTCAGTGGCCTCCCAGTCAATCG-3′,引物由上海寶成生物技術(shù)有限公司合成.PCR總反應(yīng)體系25 μL.PCR反應(yīng)條件:95 ℃下預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃下延伸30 s,72 ℃延伸7 min,共45個(gè)循環(huán).取8 μLPCR產(chǎn)物,加入2 U限制性核酸內(nèi)切酶I(restriction endonuclease Ⅰ,EcoR Ⅰ),用雙蒸水補(bǔ)足總反應(yīng)體系至10 μL,37 ℃水浴4 h,進(jìn)行酶切反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳并鑒定基因型.

1.2.2 腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè):患者入院后即抽取空腹肘部靜脈血4 m L.采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清sICAM-1水平,電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、癌細(xì)胞表面抗原(cancer cell surface antigen,CA19-9)水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析及計(jì)算,計(jì)量資料以mean±SD表示,采用單因素方差分析;不同基因型之間變異發(fā)生率的比較χ2檢驗(yàn),均值比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 ADAM33 rs678881、rs2853209與膽管癌易感性的相關(guān)關(guān)系 研究組ADAM33 rs678881 GC、CC的基因分布頻率顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),提示攜帶ADAM33 rs678881GC、CC基因型的人群更易發(fā)生膽管癌.研究組ADAM33 rs678881C等位基因分布頻率顯著高于對(duì)照組(P＜0.05).兩組ADAM33 rs2853209各基因型及等位基因分布頻率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.提示攜帶ADAM33 rs678881 C等位基因型的人群更易發(fā)生膽管癌.見(jiàn)表1.

表1 ADAM33基因rs678881、rs2853209與膽管癌易感性的相關(guān)關(guān)系[n(%)]

2.2 兩組腫瘤標(biāo)志物水平比較 研究組患者CA19-9、sICAM-1及CEA水平顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),提示膽管癌患者血清CA19-9、sICAM-1及CEA等腫瘤標(biāo)志物水平顯著增高.見(jiàn)表2.

表2 兩組CA19-9、sICAM-1及CEA水平的比較(mean±SD)

2.3 研究組各基因型患者CA19-9、sICAM-1及CEA水平比較 ADAM33 rs678881GG、GC、CC基因型患者的CA19-9、sICAM-1及CEA水平依次升高,各基因型之間水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).rs2853209患者的CA19-9、sICAM-1及CEA水平各基因型之間比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.在ADAM33 rs678881患者中,不同基因型患者的血清腫瘤標(biāo)志物水平不同,尤以CC基因型患者的水平最高.見(jiàn)表3.

表3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型膽管癌患者患兒的CA19-9、sICAM-1及CEA水平比較(mean±SD)

2.4 研究組各基因型患者單核苷酸多態(tài)性與膽管癌臨床病理關(guān)系 根據(jù)ADAM33基因rs678881、rs2853209與膽管癌易感性的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),攜ADAM33 rs678881 C等位基因型的人群更易發(fā)生膽管癌,因此將ADAM33 rs678881位點(diǎn)的GC和CC基因型合并,來(lái)比較GC/CC基因型、CC基因型與膽管癌臨床病理的關(guān)系.在212例膽管癌患者中,GC/CC基因型在性別、年齡分層、腫瘤部位、分化程度、方面的發(fā)病頻率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.在臨床TNM分期Ⅰ/Ⅱ型患者中GC/CC基因型頻率顯著低于Ⅲ/Ⅳ期患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組中GC/CC基因型頻率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).在有復(fù)發(fā)或進(jìn)展的患者組中GC/CC基因型頻率顯著高于無(wú)復(fù)發(fā)或無(wú)進(jìn)展患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).提示ADAM33基因rs678881位點(diǎn)GC/CC基因型可能是膽管癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素,與膽管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或進(jìn)展和臨床 NM分期晚關(guān)系密切.見(jiàn)表4.

表4 ADAM33基因rs678881與膽管癌臨床病理的相關(guān)關(guān)系[n(%)]

2.5 ADAM33基因rs678881多態(tài)性與膽管癌預(yù)后的關(guān)系 所有患者均連續(xù)3年,失訪5例,失訪率為2.35%.其中,GC/CC基因型患者中位生存時(shí)間為17.6 mo,3年生存率為21.7%;而GG基因型患者中位生存時(shí)間為23 mo,3年生存率為33.0%.GC/CC基因型患者的中位生存時(shí)間及3年生存率均顯著低于GG基因型患者.提示ADAM33基因rs678881GC/CC基因型可作為判斷膽管癌雨后的重要指標(biāo).

3 討論

CC多為源自膽管黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,治療仍以外科手術(shù)為主[9,10],由于早期臨床癥狀不典型,往往易漏診,由于手術(shù)根治率不高,術(shù)后缺乏有效治療藥物,5年生存率不足30%.因此,探索膽管癌的發(fā)病機(jī)制,尋找早期有效的治療藥物十分重要.

ADAM33基因是新近研究較多基因,研究發(fā)現(xiàn)其與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展有關(guān),可能是易感基因[11],其存在特殊的結(jié)構(gòu)域,包括信號(hào)肽、金屬蛋白酶、解整合素等,性質(zhì)較為保守,通過(guò)其變化能夠參與各種信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo).研究表明[12,13],ADAMs家族蛋白與腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān),可能是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的重要因素.有研究發(fā)現(xiàn)[14],ADAM33在胃癌組織中表達(dá)升高,能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及遷移.張國(guó)華等[7]研究發(fā)現(xiàn),膽管癌組織中ADAM33蛋白表達(dá)上調(diào),且與預(yù)后不良有關(guān),但ADAM33基因的單核苷酸多態(tài)性與膽管癌發(fā)病的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道.

本研究結(jié)果顯示,研究組的ADAM33 rs678881 GC、CC的基因分布頻率顯著高于對(duì)照,提示攜帶ADAM33 rs678881GC、CC基因型的人群更易發(fā)生膽管癌.研究組的ADAM33 rs678881C等位基因分布頻率顯著高于對(duì)照組,提示攜帶ADAM33 rs678881C等位基因型的人群更易發(fā)生膽管癌.而兩組ADAM33 rs2853209各基因型及等位基因分布頻率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.提示ADAM33 rs2853209與膽管癌的發(fā)病相關(guān)性較小.

同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn),ADAM33 rs678881GG、GC、CC基因型患者的CA19-9、sICAM-1及CEA水平依次升高,各基因型之間水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.表明ADAM33基因rs678881的單核苷酸多態(tài)性能夠反映膽管癌的惡性程度,其可能參與了膽管癌的發(fā)展.

將含C等位基因和不含C等位基因分成兩組,研究不同基因型組與膽管癌臨床病理的關(guān)系,結(jié)果顯示,在 212例膽管癌患者中,GC/CC基因型和GG兩組基因型在不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度組間分布中比較,差異無(wú)顯著性.但GC/CC基因型頻率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM Ⅲ/Ⅳ期、有復(fù)發(fā)或進(jìn)展組明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM Ⅰ/Ⅱ期、無(wú)復(fù)發(fā)或進(jìn)展組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.提示GC/CC基因型可能與膽管癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān).

在為期3年的隨訪期中,GC/CC基因型患者3年生存率低于GG基因型患者,說(shuō)明AG/GG基因型可能時(shí)預(yù)測(cè)膽管癌預(yù)后的重要因素.

4 結(jié)論

綜上所述,ADAM33 rs678881GC、CC基因型及C等位基因與膽管癌的發(fā)病密切相關(guān),可能是易感基因,而rs2853209基因多態(tài)性可能與膽管癌的易感性無(wú)關(guān).但由于本研究樣本量較小,研究時(shí)間較短,并未進(jìn)一步研究不同類(lèi)型膽管癌中基因型的分布差異,在下一步的研究中將加以驗(yàn)證.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

膽管癌(cholangiocarcinoma,CC)是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其臨床癥狀不典型,往往預(yù)后較差.膽管癌組織中(disintegrin and metalloproteinase,ADAM)33蛋白表達(dá)顯著升高,可能是導(dǎo)致CC預(yù)后不良的一個(gè)重要因素,但其基因多態(tài)性與CC發(fā)病的相關(guān)關(guān)系研究相對(duì)較少.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究試圖探討遺傳因素之基因多態(tài)性對(duì)與CC病情進(jìn)展及預(yù)后之間的聯(lián)系,為CC患者的診斷及更有效治療提供基因分型的依據(jù).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究旨在通過(guò)對(duì)ADAM33基因進(jìn)行分型,分析ADAM33基因多態(tài)性與膽管癌及血清腫瘤標(biāo)志物水平的相關(guān)性,從而確定不同基因型的患者對(duì)CC的易感性,為CC患者的診斷及治療提供借鑒和依據(jù).

實(shí)驗(yàn)方法

本研究主要采用數(shù)據(jù)分析的方法,分析CC患者ADAM33基因多態(tài)性與膽管癌及血清腫瘤標(biāo)志物水平的相關(guān)性,統(tǒng)計(jì)并分析ADAM33基因型與CC患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系,從而闡述ADAM33基因型對(duì)CC患者易感性的影響.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究組的ADAM33 rs678881 GC及rs678881 CC的基因分布頻率較對(duì)照組高.研究組的ADAM33 rs678881C等位基因分布頻率較對(duì)照組高.GC/CC基因型頻率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM Ⅲ/Ⅳ期、有復(fù)發(fā)或進(jìn)展組明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅠ/Ⅱ期、無(wú)復(fù)發(fā)或進(jìn)展組.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

ADAM33 rs678881GC、CC基因型及C等位基因與CC的發(fā)病密切相關(guān),可能是易感基因,參與了CC的病程進(jìn)展.

展望前景

本研究隨訪時(shí)間相對(duì)較短,病例數(shù)較少,且為單中心研究,對(duì)于ADAM33引起CC的分子機(jī)制不明確.下一步將對(duì)這些患者做進(jìn)一步的跟蹤隨訪,分析在更長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)ADAM33與CC復(fù)發(fā)的關(guān)系及具體作用機(jī)制.