GEO基因芯片分析結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探析“黃連-木香-肉豆蔻”組方治療潰瘍性結(jié)腸炎的分子機制

朱文瑞,王鐵烽,徐洪鋒

朱文瑞,王鐵烽,徐洪鋒,紹興市中醫(yī)院中藥劑科 浙江省紹興市 312000

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種以腹痛、腹瀉、膿血便等腸道癥狀為主要臨床表現(xiàn)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病[1].目前,UC的西藥治療以5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制和生物制劑為主,但長期應(yīng)用易出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)、藥物依賴及停藥后易復(fù)發(fā)等問題[2,3],而類似糞菌移植[4]、干細胞移植[5]等治療手段多僅在臨床起步階段,價格昂貴且療效欠穩(wěn)定.中醫(yī)藥治療UC有其特有的優(yōu)勢[6],從中醫(yī)藥寶庫中挖掘安全有效的UC治療手段迫在眉睫.“黃連-木香-肉豆蔻”(Huanglian-Muxiang-Roudoukou,HMR)組方出自經(jīng)典名方豆蔻香連丸,據(jù)記載可用于“治泄瀉,腹痛,不拘寒熱赤白.”,其治療癥狀與UC的臨床表現(xiàn)大體相符.進一步通過數(shù)據(jù)挖掘分析姚乃禮等[7-9]全國名老中醫(yī)在治療UC方面的用藥規(guī)律,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連、木香、肉豆蔻是臨證治療中的高頻藥物.姚乃禮教授[10]、謝晶日教授[11]在治療UC的經(jīng)驗方中,用HMR以清腸燥濕,澀腸止瀉.綜上所述,HMR是中醫(yī)藥治療UC的常用藥物組合,但其治療UC的主要成分及潛在作用機制尚不明確,導(dǎo)致其在臨床中的使用受到限制.中藥復(fù)方成分多,靶點復(fù)雜,既往逐一靶點驗證的研究方式太過于繁瑣,需要消耗大量的人力及物力,無法全面性地探索藥物機制.基因表達譜、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等技術(shù)的出現(xiàn),使系統(tǒng)全面分析探索中藥治療疾病的機制實現(xiàn)了可能.因此,本文利用基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)中的芯片數(shù)據(jù)挖掘與UC發(fā)病相關(guān)的特異性表達基因,獲取健康人群和UC患者的核心差異表達基因,再運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)預(yù)測HMR治療UC的可能作用機制,以期為該組方的進一步研究與臨床應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 UC差異表達基因分析:在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞檢索與UC相關(guān)的基因表達譜數(shù)據(jù),選取人類正常樣本及UC患者樣本均大于10的GEO數(shù)據(jù)芯片,下載其對應(yīng)的結(jié)果矩陣(Matrix)與平臺注釋文件(Platforms),數(shù)據(jù)整理分組后導(dǎo)入R軟件,利用Limma包以|lgFC|＞1(FC表示差異倍數(shù))、P＜0.05為條件篩選出差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),并分別繪制差異基因火山圖和排名前40位差異基因的熱圖.

1.2 方法

1.2.1 HMR中活性成分及靶點篩選:利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)分別以“肉豆蔻”、“黃連”及“木香”為關(guān)鍵詞搜集HMR中各個中藥的化學(xué)成分,設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18為條件,篩選出符合條件的活性成分和其所對應(yīng)的靶點信息.借助UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/),限定物種為“Homo sapiens”,進行基因名匹配及標準化處理.

1.2.2 “中藥-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)的建立:將篩選得到的藥物靶點基因與疾病差異基因相互映射,得到交集基因,并查找與之相對應(yīng)的有效成分,將搜集到的中藥、活性成分、疾病、靶標蛋白中的基因依次輸入,利用Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化處理,構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò).

1.2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)的建立:將“1.2.2”項得到的交集基因?qū)隨TRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,物種選擇人類,設(shè)置相互作用閾值為“medium confidence(置信度＞0.400)”,隱藏沒有相互聯(lián)系的節(jié)點,將蛋白互作關(guān)系結(jié)果通過Cytoscape3.9.1軟件中進行可視化處理,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),借助cytoCNA插件進行拓撲結(jié)構(gòu)分析,計算節(jié)點的度值(Degree)、介度中心性(betweenness centrality,BC)和緊密中心性(closeness centrality,CC)值,并以Degree、BC和CC的中位數(shù)值作為節(jié)點重要性的量化參考[12,13],篩選核心靶點.

1.2.4 生物學(xué)功能富集分析:將“1.2.2”項得到的交集基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/),設(shè)置P＜0.01,限定物種為“Homo sapiens”,進行基因本體論(gene ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)富集分析.

1.2.5 分子對接驗證:從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載核心靶點蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),利用PyMOL 2.2軟件除去水分子,分離原配體,保存后導(dǎo)入Autodock Tools 1.5.6軟件中加氫、計算總電荷、設(shè)置原子類型,保存為“pdbqt”格式.從TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載上述篩選得到的核心成分(配體)的mol2結(jié)構(gòu),利用Autodock Tools 1.5.6軟件設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為“pdbqt”格式文件,最后利用Autodock-vina 1.1.2軟件進行分子對接,在PyMOL下實現(xiàn)對接結(jié)果可視化,繪制對接相互作用模式圖.

統(tǒng)計學(xué)處理采用R4.1.2軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析組間差異,組間兩兩比較用最小顯著性差異法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 UC差異基因分析 從GEO數(shù)據(jù)庫中選擇編號為GSE87473基因表達譜數(shù)據(jù).該芯片數(shù)據(jù)所采用的平臺為GPL13158[HT_HG-U133_Plus_PM] Affymetrix HT HGU133+PM Array Plate,包含了21例健康受試者和87例成人UC患者的結(jié)腸黏膜組織樣本,以|lgFC|＞1、P＜0.05為條件共篩選出差異表達基因967個,其中上調(diào)基因619個下調(diào)基因348個.篩選所得差異基因即為UC相關(guān)的基因差異基因,UC差異基因的火山圖及熱圖見圖1.

圖1 UC差異基因分析.A:火山圖;B:熱圖.紅色:上調(diào)基因;綠色:下調(diào)基因;黑色:無差異基因;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;FC:差值倍數(shù).

2.2 活性成分篩選及其作用靶點預(yù)測 根據(jù)限定條件,從TCMSP數(shù)據(jù)庫收集到肉豆蔻主要活性成分9個、木香主要活性成分6個、黃連主要活性成分14個,共得到HMR的主要活性成分29個,見表1.根據(jù)篩選所得的活性成分,獲得其所對應(yīng)的靶點輸入UniProt數(shù)據(jù)庫,刪除重復(fù)靶點后共得到163個有效靶點基因.

表1 HMR主要活性成分信息

2.3 “中藥-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)的建立 將藥物靶點基因與疾病差異基因相互映射,共得到28個交集基因,并查找與之對應(yīng)的有效成分,共得到24個有效成分,其中黃連10個、木香6個、肉豆蔻8個.運用Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò),見圖2.圖中共有54個節(jié)點和111條邊線,運用網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析得到各節(jié)點Degree值,其值越大意味著該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮越重要的作用.通過計算結(jié)果可知:Degree值排名前5位的活性成分為槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)、berberine(小檗堿)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、palmatine(巴馬汀).

圖2 HMR治療UC的“中藥-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖.HMR:黃連-木香-肉豆蔻;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9;MMP3:基質(zhì)金屬蛋白酶3;MMP1:基質(zhì)金屬蛋白酶1;GJA1:縫隙連接蛋白α;IL-6:白介素6;IL-1β:白介素1β;ICAM-1:細胞間黏附分子-1;Fos:原癌基因蛋白;EGF:表皮生長因子;DUOX2:雙氧化酶;CXCL2:CXC趨化因子配體2;CXCL11:CXC趨化因子配體11;CXCL10:CXC趨化因子配體10;CCL2:CC趨化因子配體2;BCL2:結(jié)合蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2;VCAM1:血管細胞粘附分子1;TNF:腫瘤壞死因子;THBD:血栓調(diào)節(jié)素;STAT1:信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1;SPP1:分泌磷蛋白1;SELE:E選擇素;PTGS2:環(huán)加氧酶2;PPARg:過氧化物酶體增殖物激活受體γ;PLAU:尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子;PCOLCE:前膠原C-蛋白酶增強蛋白;NR3C2:核受體亞家族C組成員2;NOS2:誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;NFKBIA:核因子κB抑制劑α.

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的建立 基于STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)分析HMR治療UC的靶點蛋白之間的相互作用,得到的PPI網(wǎng)絡(luò),見圖3.通過Cytoscape軟件及內(nèi)置的Cyto NCA模塊進行可視化呈現(xiàn)及網(wǎng)絡(luò)拓撲分析.圖中節(jié)點表示靶點蛋白,邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián),Degree值越大,則對應(yīng)的節(jié)點越大和顏色越濃.該PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共涉及26個節(jié)點、224條邊,經(jīng)拓撲學(xué)分析結(jié)果后,以Degree、BC和CC的均大于其相應(yīng)的中位數(shù)值為條件[12-14],并按照Degree值由大到小排序,篩選出白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、CC趨化因子配體2[chemokine (C-C motif) ligand 2,CCL2]、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)共11個核心靶點.

圖3 HMR治療UC的PPI網(wǎng)絡(luò).HMR:黃連-木香-肉豆蔻;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;PPI:蛋白互作;Degree:度值;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9;MMP3:基質(zhì)金屬蛋白酶3;MMP1:基質(zhì)金屬蛋白酶1;GJA1:縫隙連接蛋白α;IL-6:白介素6;IL-1β:白介素1β;ICAM-1:細胞間黏附分子-1;Fos:原癌基因蛋白;EGF:表皮生長因子;DUOX2:雙氧化酶;CXCL2:CXC趨化因子配體2;CXCL11:CXC趨化因子配體11;CXCL10:CXC趨化因子配體10;CCL2:CC趨化因子配體2;VCAM1:血管細胞粘附分子1;TNF:腫瘤壞死因子;THBD:血栓調(diào)節(jié)素;STAT1:信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1;SPP1:分泌磷蛋白1;SELE:E選擇素;PTGS2:環(huán)加氧酶2;PPARg:過氧化物酶體增殖物激活受體γ;PLAU:尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子;NR3C2:核受體亞家族C組成員2;NOS2:誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;NFKBIA:核因子κB抑制劑α.

2.5 生物學(xué)功能富集分析 運用Metascape數(shù)據(jù)庫將28個藥物靶點基因與UC疾病差異基因的交集基因進行GO功能富集分析,主要包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞組分(cellular component,CC),篩選各項排列前5的條目所對應(yīng)靶點具有的功能信息,繪制氣泡圖,見圖4.由圖4可知,HMR治療UC的BP主要涉及脂多糖刺激變化過程、對神經(jīng)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、對輻射的反應(yīng)、對肽的反應(yīng)、對細胞外刺激的反應(yīng)等;MF主要涉及細胞因子活性、整合素結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、血紅素結(jié)合等;CC主要涉及質(zhì)膜外側(cè)面、膜筏、細胞外基質(zhì)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔等.運用Metascape數(shù)據(jù)庫進行KEGG功能富集分析,篩選排列前10的條目所對應(yīng)靶點具有的功能信息,繪制氣泡圖,見圖5.由圖5可知,HMR治療UC靶點關(guān)聯(lián)的通路主要有TNF信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路、Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)信號通路等.

圖4 HMR治療UC的GO分析.HMR:黃連-木香-肉豆蔻;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;GO:基因本體;BP:生物過程;MF:分子功能;CC:細胞組分.

圖5 HMR治療UC的KEGG分析.HMR:黃連-木香-肉豆蔻;UC:潰瘍性結(jié)腸炎;KEGG:京都基因與基因組百科全書;TNF:腫瘤壞死因子;HIF-1:缺氧誘導(dǎo)因子1.

2.6 分子對接驗證 將“2.4”項下“中藥-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前5的活性成分,與“2.5”項下PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前5的核心靶點進行分子對接,計算活性成分與核心靶點間的結(jié)合能,結(jié)果見表2.結(jié)合能值越小表示結(jié)合能越高,活性成分越容易與蛋白結(jié)合,結(jié)合能-5.0 kcal/mol表明兩者之間結(jié)合活性較好;小于-7.0 kcal/mol表明兩者之間有很強結(jié)合活性[15].然后再分別選取結(jié)合能最低的成分,并用PyMol軟件對其對接結(jié)果進行可視化展示,見圖6.

圖6 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接模式.綠色:配體;黃色:與配體對接的氨基酸殘基;紅色虛線:氫鍵;IL-1β:白介素1β;IL-6:白介素6;CCL2:趨化因子配體2;TNF:腫瘤壞死因子;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9.

表2 分子對接結(jié)果

對接結(jié)果顯示,槲皮素、豆甾醇、小檗堿、β-谷甾醇、巴馬汀與關(guān)鍵靶點IL6、CCL2、TNF、IL-1β、MMP9的結(jié)合能均小于-5.0 kcal·mol-1,說明活性成分與靶點之間具有較好結(jié)合活性,槲皮素與MMP9,β-谷甾醇與TNF的結(jié)合能小于9.0 kcal·mol-1,說明兩者之間具有強烈的結(jié)合活性.分子對接可視化分析研究發(fā)現(xiàn),槲皮素通過氨基酸殘基Q227、A242、R249與MMP9形成3條氫鍵,β-谷甾醇通過氨基酸殘基TYR-119與TNF形成1條氫鍵,β-谷甾醇通過氨基酸殘基GLY-44、PHE-96、PHE-98、TRP-47與MMP9形成4條氫鍵,并且上述配體化合物均能良好地包埋在受體靶蛋白的活性口袋中.

3 討論

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多通路的作用特點,傳統(tǒng)的藥理學(xué)方法不能系統(tǒng)闡述其治療UC的作用機制.隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)因能多系統(tǒng)闡述藥理作用機制,與中醫(yī)整體觀相契合而被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥治療疾病作用機制研究[16,17].為了更好地挖掘和利用我國豐富的中醫(yī)藥資源,本文立足于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)系統(tǒng)地探討HMR治療UC的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制.

本研究發(fā)現(xiàn)HMR中含有的槲皮素、豆甾醇、小檗堿、β-谷甾醇和巴馬汀等為治療UC的主要活性成分.研究表明[18],槲皮素通過誘導(dǎo)緊密連接蛋白修復(fù)UC模型小鼠的的腸上皮細胞,并顯著降低腸道炎癥損傷;豆甾醇在結(jié)腸炎中通過激活丁酸-過氧化物酶體增殖物激活受體γ軸修復(fù)調(diào)節(jié)性T細胞與輔助性T細胞17平衡,可抑制模型小鼠血液中炎癥細胞增殖,有效控制結(jié)腸組織損傷[19];β-谷甾醇以濃度依賴的方式降低UC模型小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平,并且β-谷甾醇可顯著增加腸道上皮細胞抗菌肽的表達,降低致病菌(含傷寒沙門氏菌等)的存活率[20];小檗堿以微生物依賴的方式恢復(fù)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的UC小鼠炎癥,并且小檗堿通過維持腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能、調(diào)節(jié)腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)來發(fā)揮對結(jié)腸的保護作用[21-23];巴馬汀通過抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎癥小體的活化,降低UC小鼠結(jié)腸中髓過氧化物酶、IL-1β、TNF-α的水平[24].以上結(jié)果表明從HMR中的篩選得到的多種活性成分在治療UC方面發(fā)揮著重要的作用.

通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析發(fā)現(xiàn),HMR治療UC核心靶點有IL-1β、IL-6、CCL2、TNF、MMP9等.炎癥反應(yīng)是UC病理生理基礎(chǔ),炎癥因子在UC腸道炎癥持續(xù)過程中發(fā)揮著重要作用.研究發(fā)現(xiàn),UC發(fā)病期間IL-1β分泌增加直接介導(dǎo)了UC初期炎癥的發(fā)生,且IL-1β分泌過多可激活樹突樣細胞、促進白細胞介素-2受體過表達,加重結(jié)腸黏膜局部的炎癥反應(yīng);IL-6分泌增加影響腸上皮細胞電解質(zhì)分泌紊亂,介導(dǎo)其他炎癥細胞發(fā)生炎性反應(yīng)[26,27].TNF-α參與細胞免疫炎癥反應(yīng),在UC患者受損腸黏膜中呈高水平表達,誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細胞大量凋亡,從而增加腸道上皮細胞通透性[28-30].CCL2是一種重要的趨化因子[31],腸道炎癥時,內(nèi)皮細胞、單核細胞等細胞在TNF-α、IL-1等炎性因子刺激下會大量釋放CCL2,而該趨化因子可高度特異性地激活并趨化淋巴細胞和單核-巨噬細胞等免疫細胞向正常腸黏膜組織聚集,并促進這些免疫細胞潛入發(fā)炎的腸黏膜組織,進而使腸黏膜發(fā)生更嚴重的免疫炎性損害[32].此外,一項臨床發(fā)現(xiàn)[33]MMP9在活動性UC患者結(jié)腸黏膜中持續(xù)高表達,而活化的MMP9可分解多種蛋白底物,甚至導(dǎo)致抗TNF藥物無效.近年來有學(xué)者提出,高效且高選擇性的MMP抑制劑的研發(fā)或?qū)⒊蔀閁C生物制劑研發(fā)的新方向[34].上述結(jié)果提示PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點在UC的調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答上有著重要作用,表明HMR治療UC主要通過上述多靶點發(fā)揮作用.

KEGG富集分析顯示,HMR治療UC主要涉及的通路為炎癥反應(yīng)及腸黏膜免疫相關(guān)通路,如TNF信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路等.本研究發(fā)現(xiàn),在HMR治療UC中TNF信號通路的基因數(shù)富集最多且表達顯著.TNF信號通路可通過影響腸黏膜T細胞的活化、增殖,促進Th1細胞的極化及效應(yīng)功能,上調(diào)γ干擾素的表達,從而促進腸黏膜的炎癥反應(yīng)[35].同時,還可作用于輔助性T細胞17使其分泌白介素17(interleukin-17,IL-17)增加,導(dǎo)致腸黏膜免疫失調(diào)引發(fā)腸道炎癥反應(yīng).此外,TNF信號通路還能激活下游NF-κB通路,促進IL-lβ、IL-6、IL-17等炎癥因子釋放[36],而這些炎癥因子又可以反作用于NF-κB信號通路,調(diào)控多種炎癥因子相關(guān)基因,進一步加重腸道炎癥反應(yīng).GO富集分析顯示,HMR治療UC與脂多糖刺激變化等生物過程有關(guān),且多發(fā)生在細胞的質(zhì)膜外側(cè)面、膜筏、細胞外基質(zhì)區(qū)域,通過影響細胞因子活性、整合素結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性等分子功能發(fā)揮作用.本研究通過GO、KEGG富集分析證明HMR治療UC是多個分子、多條信號通路對多種細胞生物學(xué)行為進行調(diào)節(jié)的結(jié)果.

4 結(jié)論

綜上所述,HMR可能是通過槲皮素、豆甾醇及小檗堿等多成分,作用于IL-1β、IL-6、CCL2等多靶點,調(diào)節(jié)TNF信號通路、NF-κB信號通路、TLR信號通路等多種信號通路,從抗炎和調(diào)節(jié)腸道免疫等方面發(fā)揮對UC的治療作用.本次分析結(jié)果表明HMR治療UC的多成分、多靶點、多通路的作用機制,為今后臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供了一定的思路和參考.

文章亮點

實驗背景

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病,常反復(fù)發(fā)作,纏綿難愈,多數(shù)需要終身用藥維持.長期使用抗UC藥物可引發(fā)藥物不良反應(yīng).隨著中醫(yī)治療的發(fā)展,越來越多的中藥方劑在治療UC上展現(xiàn)出了較好的療效.“黃連-木香-肉豆蔻”(Huanglian-Muxiang-Roudoukou,HMR)是眾多名老中醫(yī)治療UC的常用組方,研究其抗UC機制有助于藥物開發(fā)和推廣.

實驗動機

探索HMR治療UC的作用機制,以期為該組方的進一步研究與臨床應(yīng)用提供參考.

實驗?zāi)繕?/p>

通過基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)中的基因芯片分析結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探究HMR治療UC的潛在分子機制.

實驗方法

采用GEO數(shù)據(jù)庫獲取UC芯片數(shù)據(jù),運用R語言綜合分析篩選出疾病差異表達基因,獲得UC的疾病靶標數(shù)據(jù)庫;利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)分別檢索HMR的活性成分及其作用靶點;取疾病差異表達基因與藥物作用靶點間的交集基因,通過Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)并進行拓撲分析,以此篩選出主要活性成分及核心靶點;同時利用Metascapes數(shù)據(jù)庫進行進行基因本體(gene ontology,GO)功能分析及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路;最后使用AutoDock vina軟件對主要活性成分和核心靶點進行分子對接.

實驗結(jié)果

共篩選得到UC差異表達基因967個,HMR活性成分29種,對應(yīng)的靶點163個.“中藥-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中有活性成分24個,主要活性成分涉及槲皮素、豆甾醇、小檗堿、β-谷甾醇、巴馬汀等;蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中有蛋白26個,核心靶點涉及白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、CC趨化因子配體2[chemokine (C-C motif) ligand 2,CCL2]、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)等;GO富集分析主要涉及脂多糖刺激變化等生物過程,質(zhì)膜外側(cè)面等細胞成分,細胞因子活性等分子功能;KEGG通路分析主要涉及TNF信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路、Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)信號通路等;運用分子對接模擬證實排名前5的主要活性成分與核心靶點之間均具有較強的結(jié)合活性.

實驗結(jié)論

通過生物信息學(xué)方法篩選及預(yù)測,HMR可能是通過槲皮素、豆甾醇及小檗堿等多成分,作用于IL-1β、IL-6、CCL2等多靶點,調(diào)節(jié)TNF信號通路、NF-κB信號通路、TLRs信號通路等多種信號通路,進而影響UC涉及的炎癥、腸道免疫等多種方式,來發(fā)揮改善UC的作用.

展望前景

基于以上分析,HMR治療UC是通過多靶點、多通路的,也提示中藥的研究是較為復(fù)雜的,需要從多維度、多靶點進行研究.基于生物信息學(xué)方法,本研究初步揭示了HMR治療UC相關(guān)靶點之間的復(fù)雜關(guān)系,也挖掘了其潛在治療靶點及可能參與機制.但對于HMR整體治療UC的機制仍是初步的,考慮到具體到臨床中的個人更為復(fù)雜,如藥物的劑量、煎煮方法、劑型等不同,會起到不一樣的臨床療效.因此,基于以上不足,仍需進一步開展相關(guān)的藥理學(xué)實驗,進一步驗證和闡明HMR治療UC的作用機制.