茶鵑木木材解剖學(xué)、生理特性及揮發(fā)性成分研究

王露露，劉欣怡，王雅麗，唐 文，洪少友，王 軍*

1. 海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?571101；2. 海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南?？?571101；3. 海南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，海南?？?570003

馬達(dá)加斯加是非洲大陸以東、印度洋西部，非洲第一和世界第四大島，屬于熱帶雨林氣候，終年濕熱，年降水量達(dá)2000~3800 mm，年平均氣溫約24 ℃，這里擁有眾多奇特生物，80%左右的野生動(dòng)植物都是該島獨(dú)有，特有植物有1萬多種，生物多樣性極其豐富，成為許多瀕危物種最后的家園，所以馬達(dá)加斯加又被稱為“最后的諾亞方舟”[1-5]。茶鵑木（HumbertiamadagascariensisLam.）也是該島特有的單種屬物種，生長在東海岸古老的玄武巖流或沿海沙灘上，其木材不易腐爛，呈黃色，堅(jiān)硬，密度大于水，有“柑橘檀香”味，又被稱為“藥香黃檀”和“馬達(dá)加斯加黃檀”，是整個(gè)東海岸地層中出現(xiàn)的典型物種，由于大量開采木材，使珍貴物種匱乏[6-7]。

茶鵑木為喬木，可高達(dá)30 m；樹皮淺褐色，具凹槽，皮孔不明顯。頂生花序，花冠鐘形，邊緣乳白色，雄蕊和花柱外露。蒴果橢球形或卵形，頂部具臍，被緊貼的萼片包圍果皮不開裂，肉質(zhì)，棕色，光滑，干燥后具網(wǎng)狀紋飾。種子1~2（4）粒，卵球形[8]。有學(xué)者[9]對(duì)茶鵑木的樹皮解剖發(fā)現(xiàn)其粗糙且很硬，橫切面無石細(xì)胞帶，形成層規(guī)則，高度硬化且面積大。微觀構(gòu)造特征表明：橫切面形成層寬約4層，連續(xù)13層均勻交替的薄壁篩管層；晶體纖維2行，薄壁組織1~2行，成排的篩管1~2行，晶體纖維2行等；橫截面分隔的隔間里均有一層草酸鈣晶體；在樹皮的硬化部分，大多數(shù)薄壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化成巨大的石細(xì)胞，是旋花科樹皮結(jié)構(gòu)中的稀有情況。研究還發(fā)現(xiàn)，茄科（Solanaceae）植物和旋花屬（Convolvulus）植物親緣關(guān)系緊密，均含有大量草酸鈣晶體，從樹皮的解剖學(xué)角度無法闡明茶鵑木的親緣關(guān)系。

有關(guān)茶鵑木的相關(guān)研究報(bào)道甚少，其中包括化學(xué)成分、分子生物學(xué)及上述的樹皮解剖學(xué)方面研究。在化學(xué)方面，有學(xué)者通過高效液相色譜法（HPLC）在茶鵑木木材中檢測到木質(zhì)素成分松脂素二甲醚[pinoresinol dimethyl ether或(+)-eudesmin)][10-11]，該成分具有拮抗血小板活性因子（PAF）活性的藥理作用[12]，另外還鑒定到化學(xué)成分環(huán)已二酸（cyclohexanderivate）[13]。分子生物學(xué)方面研究證明，茶鵑木因其具有輻射對(duì)稱的花，保留了旋花科的一些疑似祖先的特征，有別于其他主要草本類。通過rbcL、atpB、psbE-Joperon和trnL-trnF四個(gè)葉綠體片段證明了茶鵑木屬于旋花科[14]。利用核糖體和質(zhì)體rps2、matK、ITS序列構(gòu)建了旋花科菟絲子屬（CuscutaL.）系統(tǒng)發(fā)育模型，茶鵑木屬（HumbertiaLam.）分別與菟絲子屬rbcL、rps2、ITS單個(gè)基因樹在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是基本一致的[15]。在旋花科內(nèi)，目前最新的分子系統(tǒng)學(xué)研究主要基于細(xì)胞器和核基因片段，其結(jié)果支持廣義旋花科為一個(gè)單系，并進(jìn)一步將其劃分成2亞科12族，其中茶鵑木被歸入單獨(dú)的茶鵑木亞科，包含茶鵑木族（Humbertieae）、茶鵑木屬[14,16]。目前，尚無茶鵑木木材生理指標(biāo)、解剖結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性成分的研究報(bào)道，本研究將從茶鵑木木材生理指標(biāo)、宏觀與微觀結(jié)構(gòu)等方面對(duì)其木材解剖學(xué)進(jìn)行研究，并對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，旨在為茶鵑木木材的識(shí)別、生理指標(biāo)、化學(xué)成分等方面的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 茶鵑木木材樣品于2021年5月收集于海南省?？谑心静氖袌?，標(biāo)本號(hào)為CJM202105，由洪少友鑒定為茶鵑木（Humbertia madagascariensisLam.），憑證標(biāo)本藏于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.1.2 儀器與試劑 半自動(dòng)切片機(jī)（德國Leica RM 2235）；體式解剖顯微鏡（日本Olympus）；手持式數(shù)碼顯微鏡（深圳東儀精工AM413T）；萬分之一電子天平（北京賽多利斯BP221S）；中性樹膠（國藥集團(tuán)）；環(huán)保組織透明液（哈爾濱格林標(biāo)本）；GC-MS聯(lián)用儀（美國安捷倫HP6890/5975C）；超聲波清洗儀（美國Bransonic-B5510EMT）；烘箱（上海精密儀器設(shè)備有限公司）；雷磁pH酸度計(jì)S-3C（上海儀電科學(xué)儀器）；電熱恒溫水浴鍋DK-98-11（天津市泰斯特儀器有限公司）；全波長多功能酶標(biāo)儀Synergy H1（美國Bio-Tek）；微量法/蒽酮比色法試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）；微量法/考馬斯亮藍(lán)法試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）；使用的試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 木材基本密度測定 木材基本密度測定方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 1933—2009[17]。具體操作步驟如下：（1）試樣加工成尺寸為50 mm×50 mm×50 mm的標(biāo)準(zhǔn)立方體，相鄰面互相垂直，立方體六面用砂紙打磨使其表面盡量平整光滑。（2）將樣品放入烘箱內(nèi)，初始溫度60 ℃保持約6 h，然后將溫度升至(103±2)℃再烘10 h，然后從中選定3個(gè)樣品進(jìn)行第1次試稱，以后每隔2 h稱量1次，至最后2次質(zhì)量差不超過試樣質(zhì)量的0.5%時(shí)將樣品從烘箱內(nèi)取出，放入干燥器內(nèi)冷卻。（3）樣品冷卻至室溫后，從稱量瓶中取出稱量（m0）精確至0.001 g。（4）將樣品浸泡在水中，使樣品處于飽和水狀態(tài)，5 d后在樣品各面的中心位置用卡尺分別測出弦向、徑向和順紋方向的尺寸，準(zhǔn)確至0.01 mm，計(jì)算出飽和水樣品體積V0，樣品測量過程中始終保持表面濕潤?；久芏龋é眩聪铝泄接?jì)算，精確到0.001 g/cm3：式中，m0為烘干后試樣質(zhì)量，g；V0為飽和水樣品體積，cm3。

1.2.2 木材生理指標(biāo)測定 參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6043—2009測定木材的酸堿性，具體步驟如下：（1）試樣制備。將試樣破碎后置于通風(fēng)良好，無酸、堿性氣體的室內(nèi)氣干，均勻混合后取約200 g，用植物原料粉碎機(jī)粉碎后取粒徑為40~60目的木粉，備用；（2）在使用前按使用說明書校正酸度計(jì)。稱取木粉3 g（以絕干計(jì)，精確至0.001 g)，置于50 mL燒杯內(nèi)，準(zhǔn)確加入30.0 mL去除CO2的蒸餾水，攪拌5 min，放置15 min后再攪拌5 min，靜置20 min，測定pH，重復(fù)3次。每種木粉平行測定3次，3次測定結(jié)果差值不得大于0.04，取其平均值為測定結(jié)果。

采用蒽酮比色法測定淀粉含量，具體步驟如下：（1）稱取0.1 g新鮮樣本，3次重復(fù)，加入1 mL 80%乙醇充分勻漿后轉(zhuǎn)移到離心管中，80 ℃水浴提取30 min，3000×g，25 ℃離心5 min，棄上清；（2）沉淀中加入0.5 mL蒸餾水，放入95 ℃水浴糊化15 min，冷卻后加入0.35 mL高氯酸溶液，常溫提取15 min；（3）加入0.85 mL蒸餾水混勻，3000×g，25 ℃離心10 min，取50 μL上清液和250 μL蒽酮-濃硫酸溶液混勻，95 ℃水浴10 min，自然冷卻后取200 μL在酶標(biāo)儀波長620 nm下記錄吸光值。

采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白含量，具體步驟如下：（1）取0.1 g新鮮樣本，3次重復(fù)，加入2 mL蒸餾水充分冰浴勻漿后轉(zhuǎn)移到離心管中，8000×g，4 ℃離心10 min，取上清即待測液；（2）在96孔板中，取100 μL待測液（空白用100 μL蒸餾水）加入100 μL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻后在酶標(biāo)儀波長620 nm下記錄吸光值。

1.2.3 木材解剖學(xué) 用木鋸將莖段沿垂直于軸向鋸斷且斷口處保持平整，選取木材三切面（橫切面、弦切面和徑切面），置于手持式數(shù)碼顯微鏡下（倍數(shù)為35倍）觀測拍照，并記錄木材宏觀構(gòu)造特征。按王軍等[18]的木材制片方法制成三切面切片，將壓制好的切片置于體式解剖顯微鏡下觀測，其中木材橫切面放大倍數(shù)為40倍，弦切面和徑切面均為100倍，觀測拍照，并記錄木材微觀構(gòu)造特征。

1.2.4 GC-MS分析 樣品切碎后，過40目篩，精確稱取樣品，分別用3 mL乙醚超聲提取3次，每次超聲15 min，靜置5 min后過濾得到乙醚提取液，合并3次提取液，待乙醚揮發(fā)后，得到油狀乙醚提取物樣品，準(zhǔn)確稱重，加入2mL乙醚溶劑溶解，用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，即為樣品溶液。色譜條件：色譜柱HP-5MS 5% phenyl methyl siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；升溫程序：柱溫50 ℃，以5 ℃/min升溫至310 ℃，保持10 min，汽化室溫度為250 ℃，載氣為高純He（99.999%），載氣流量為1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲時(shí)間為4.0 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，接口溫度為280 ℃，倍增器電壓為1612 V，質(zhì)量掃描范圍為29~500m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶鵑木木材基本密度

通過測定木材基本密度，測得茶鵑木木材的基本密度為1.684 g/cm3；通過水試發(fā)現(xiàn)該木材沉水。

2.2 茶鵑木木材pH、淀粉含量及可溶性蛋白含量

通過測定，茶鵑木木材的pH為6.78，略呈堿性木材（按照文獻(xiàn)[19]劃分）；茶鵑木木材淀粉含量為10.953 mg/g，可溶性蛋白含量為0.271 mg/g。

2.3 茶鵑木木材的解剖學(xué)研究

茶鵑木木材的宏觀構(gòu)造見圖1，微觀構(gòu)造見圖2，對(duì)木材構(gòu)造特征描述參照《中國木材志》[20]。觀測結(jié)果如下：

圖1 茶鵑木木材的宏觀切面Fig. 1 Macro sections of the wood of H. madagascariensis Lam.

圖2 茶鵑木木材的微觀切面Fig. 2 Micro sections of wood of H. madagascariensis Lam.

木材粗視構(gòu)造：黃褐色，心邊材區(qū)別不明顯，有光澤，有“柑橘檀香”味。生長輪不明顯，木材類型為散孔材；管孔較大，肉眼下可見，在放大鏡下清晰可見，管孔大小略一致，分布均勻，管孔內(nèi)及邊緣含有白色至金黃色侵填體，弦切面上較明顯。軸向薄壁組織無或不明顯。橫切面上木射線清晰，均勻細(xì)密；徑切面上木射線斑紋明顯，分布密集；弦切面上呈細(xì)線狀，波痕略可見。

木材顯微構(gòu)造：散孔材，管孔為橢圓形、圓形，數(shù)目為3~5個(gè)/mm2，單管孔，分散分布，管孔弦徑80~210 μm，管孔內(nèi)及邊緣含有金黃色樹膠，樹膠通常有不規(guī)則分隔，穿孔板斜列。軸向薄壁組織無或不明顯。木射線非疊生，同形，單列，7~9根/mm；射線細(xì)胞較大，清晰可見，大小均等，長30~47 μm，寬55~70 μm，多數(shù)為橢圓形、長圓形，邊緣規(guī)則；射線高度為1~10個(gè)細(xì)胞，多數(shù)為4~8個(gè)細(xì)胞，9~10個(gè)細(xì)胞甚少，射線長32~280 μm，多數(shù)為100~170 μm；射線寬度為6~20 μm；射線間距35~300 μm，多數(shù)為150~200 μm；橫臥射線含方形細(xì)胞3~7層，長20~100 μm，高20~50 μm；射線細(xì)胞通常不含樹膠。三切面上導(dǎo)管外側(cè)及纖維組織中橢圓狀晶體明顯，數(shù)量眾多，縱向排列規(guī)則，大小平均為1.3 μm×6.5 μm。

2.4 茶鵑木揮發(fā)性成分GC-MS分析

圖3為茶鵑木樣品乙醚提取物的總離子流圖，對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist 2005和Wiley 275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，借鑒前人[21-22]的鑒定方法，結(jié)合質(zhì)譜圖與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，并用峰面積歸一化法得出色譜峰在樣品中的總相對(duì)含量占出峰總面積的98.44%，總檢出率較高，各揮發(fā)性化學(xué)成分的類型和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。由圖3和表1可知，茶鵑木木材揮發(fā)性成分共鑒定出13個(gè)化合物，其中，主要成分為脂肪酸類（88.81%），還有脂類（8.12%）和萜烯類（0.94%）等，鑒定出的化合物中含量較高的為棕櫚酸（47.32%），其次為硬脂酸（38.79%），二者的相對(duì)百分含量合計(jì)為86.11%，其他成分相對(duì)百分含量較高的還有己二酸二辛酯（2.81%）、十二烯酸十二烯酯（2.81%）、異丙烯酸十二酯（1.70%）和十二烷酸（1.53%）等。

表1 茶鵑木木材揮發(fā)性成分Tab. 1 Volatile constituents in wood of H. madagascariensis Lam.

圖3 茶鵑木木材的GC-MS總離子流圖Fig. 3 GC-MS total iron chart of wood of H. madagascariensis Lam.

3 討論

植物晶體主要存在于植物器官的莖中，其次是葉，最后是根，其含量與環(huán)境的鹽濃度、脅迫時(shí)間和生長時(shí)間均呈正比[23]，具有特殊的結(jié)構(gòu)和生理功能，在植物保護(hù)和防御、結(jié)石病防治、離子平衡、植物病蟲防治、植物適應(yīng)逆境等方面具有重要作用[24-27]。馬達(dá)加斯加?xùn)|海岸由于氣候炎熱、臺(tái)風(fēng)眾多、土壤鹽堿化嚴(yán)重等因素，造就了其獨(dú)特的氣候環(huán)境[6]，對(duì)于植物而言需要有特殊的適應(yīng)機(jī)制。本研究通過木材特性和解剖學(xué)發(fā)現(xiàn)：茶鵑木木材沉水，基本密度為1.684 g/cm3；管孔較大、分布較稀，射線單列、細(xì)密，內(nèi)含眾多縱向規(guī)則排列的橢圓狀晶體。且前人從茶鵑木的樹皮中也發(fā)現(xiàn)了大量草酸鈣晶體，從而造就了上述木材構(gòu)造細(xì)密、重硬和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)。

木材的酸堿性質(zhì)主要來自抽提物、半纖維素的糖醛酸和乙?；?，以及木質(zhì)素具有的弱酸性基和纖維素含有的羥基，并且木材在貯藏過程中，會(huì)不斷產(chǎn)生酸性物質(zhì)，因此世界上絕大部分木材呈弱酸性，把pH<6.5的木材歸屬于酸性木材，把pH>6.5的木材歸屬于堿性木材，極少數(shù)木材或者心材屬于堿性木材[19]。半纖維素是決定木材pH的一個(gè)因子，當(dāng)樹體受脅迫時(shí)，形成愈傷組織，因而加速生長，并降低了半纖維素的含量，木材pH提高，因此受脅迫的樹體有偏堿性的趨勢[28]。本研究中，茶鵑木的pH為6.78，略呈堿性。

當(dāng)植物遭受非生物脅迫（高溫、鹽堿地等）時(shí)，植物體內(nèi)淀粉水解，會(huì)增加植物體內(nèi)可溶性糖含量，保護(hù)酶活性增多，細(xì)胞液的濃度增高，冰點(diǎn)降低，可減輕細(xì)胞的脫水，保護(hù)原生質(zhì)膠體，從而提高對(duì)非生物脅迫的抵抗力[29]；且可溶性蛋白也是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量也是植物代謝過程中蛋白質(zhì)損傷的一項(xiàng)重要指標(biāo)[30]，植物中可溶性蛋白含量高，抗逆性就越強(qiáng)[31]。本研究中茶鵑木的淀粉含量為10.953 mg/g，蛋白含量為0.271 mg/g，均有利于抵抗生長過程中遭受非生物脅迫。

植物脂肪酸既是細(xì)胞膜脂的主要成分，又是重要的能源物質(zhì)，隨著深入研究表明，很多脂肪酸及其衍生物可誘導(dǎo)各種植物產(chǎn)生防御反應(yīng)[32]。例如大豆中硬脂酸可抑制種子種傳病毒莖潰瘍病菌的侵染[33]；擬南芥油酸參與了水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)植物防御信號(hào)傳導(dǎo)[34]；在鱷梨發(fā)生炭疽病時(shí)，亞油酸可增強(qiáng)抗性等[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，茶鵑木木材中的脂肪酸類成分共有6種，占樣品總相對(duì)百分質(zhì)量的88.81%，尤其是飽和脂肪酸棕櫚酸（47.32%）和硬脂酸（38.79%）含量較高。其中棕櫚酸可誘導(dǎo)胰島素瘤細(xì)胞MIN6細(xì)胞凋亡并對(duì)胰島素成熟有影響，也可誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，此外棕櫚酸還可用于多種化工原料，其特殊香氣和滋味，亦可用于配制食用香料或作為食品添加劑的原料，據(jù)報(bào)道木質(zhì)部棕櫚酸具有促使腫瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞凋亡的作用[36-37]。硬脂酸是長鏈飽和脂肪酸的主要成分，可作為信號(hào)分子參與機(jī)體炎癥、代謝、免疫的調(diào)節(jié)，其具有致炎和抗炎、致氧化和抗氧化等多重作用，可通過多種途徑參與風(fēng)濕性疾病的發(fā)生、發(fā)展，代謝組學(xué)研究還揭示其可作為風(fēng)濕性疾病的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[38]。

不飽和脂肪酸含有碳碳雙鍵，具有極強(qiáng)還原性，可氧化形成小分子揮發(fā)性物質(zhì)，如醛、酸等，而不同的不飽和脂肪酸所氧化產(chǎn)生的揮發(fā)性成分不同，使得其氣味也不同[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，茶鵑木木材揮發(fā)性成分中含有少量的不飽和脂肪酸，即亞油酸（0.23%）和油酸（0.61%），亞油酸可被氧化生成亞油酸過氧化物，進(jìn)而裂解生成己醛。在濃度較低時(shí)，己醛能賦予食品一定的青香、果香香味；油酸可被氧化生成8-油酸氫過氧化物、9-油酸氫過氧化物、10-油酸氫過氧化物和11-油酸氫過氧化物等混合物，再裂解生成壬酸，而壬酸具有蠟香和柑橘香味[40]，據(jù)此推測茶鵑木具有的特殊“柑橘香味”可能與此有關(guān)。

由于茶鵑木為馬達(dá)加斯加特有物種，其分布區(qū)狹窄，數(shù)量稀少，因此，人們對(duì)其了解和研究甚少。本研究對(duì)茶鵑木木材性質(zhì)、生理生化指標(biāo)、木材解剖學(xué)及其揮發(fā)性成分進(jìn)行了初步分析，拓寬了馬達(dá)加斯加特有植物的研究，為該植物的木材識(shí)別、資源的保護(hù)、開發(fā)利用及進(jìn)一步深入研究等方面提供科學(xué)依據(jù)。