核桃JrbHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定與響應(yīng)冷脅迫基因表達(dá)分析

劉 凱，李 洋，張 強，王紅霞，張井剛，何富強，陳春晴

（1.濱州職業(yè)學(xué)院，山東 濱州 256603；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 山區(qū)研究所/河北省農(nóng)業(yè)工程中心/國家北方山區(qū)工程中心，河北 保定 071001；3.無棣譚陽林場，山東 濱州 256603；4.保定學(xué)院，河北 保定 071001）

核桃（Juglans regiaL.）由于經(jīng)濟價值高、堅果營養(yǎng)豐富，栽培面積大，在我國經(jīng)濟林中占有重要地位［1］，目前全國核桃種植面積667 多萬hm2［2］，是我國的重要樹種。核桃是由于自身樹體特性容易受到惡劣環(huán)境影響；在春季萌芽期耐冷脅迫的能力比較低［3］，我國北方核桃栽培區(qū)倒春寒和晚霜的發(fā)生成為了限制核桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要的環(huán)境因素。bHLH TFs 在結(jié)合逆境相關(guān)基因后發(fā)揮響應(yīng)的過程中十分關(guān)鍵。大量研究表明bHLH 家族成員參與非生物脅迫的響應(yīng)。過表達(dá)bHLH1（MdCIB1）的蘋果愈傷組織顯示出對PEG 6 000 處理后有更高耐受性，轉(zhuǎn)基因擬南芥通過Pro 含量升高、MDA 含量降低以及H2O2和O2-的積累減少，能夠維持蘋果愈傷組織的正常生長［4］。甜櫻桃中PavbHLH1、-18、-28、-60、-61、-65 和-66共7 個bHLH TFs 可能參與了對寒冷脅迫的調(diào)節(jié)［5］。密羅木MfbHLH38在過表達(dá)擬南芥植株中通過增加保水能力、調(diào)節(jié)滲透平衡、減少脅迫引起的氧化損傷，可能參與了依賴ABA 途徑增強了擬南芥對干旱和鹽分脅迫的耐受性［6］。目前關(guān)于bHLH TFs 家族成員的研究也越來越多，先后在辣椒［7］、高粱［8］、茶樹［9］、甜櫻桃［5］、大麥［10］等植物中進(jìn)行了鑒定和分析。但是有關(guān)核桃bHLH TFs 與非生物脅迫關(guān)系的研究鮮有報道。因此，在全基因組水平上對核桃bHLH TFs進(jìn)行鑒定和結(jié)構(gòu)分析，并分析其家族成員在冷脅迫與不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，將為核桃bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族在響應(yīng)冷脅迫過程中的作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

轉(zhuǎn)錄組測序材料為冷脅迫（0.5 ℃）處理48 h后2 年生的‘遼寧8 號’和‘清香’核桃［11］，且嫁接至同一砧木，測序數(shù)據(jù)存儲在國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(https://bigd.big.ac.cn/?lang=zh)，項目ID PRJCA006073。

表達(dá)分析為盆栽的2 年生‘清香’核桃，冷脅迫處理0、4、8、12、24、36、48 h；不同組織（根、嫩莖、嫩葉、雄花、雌花、老葉）采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園‘清香’核桃，采集后液氮速凍，用于RNA 提取并反轉(zhuǎn)錄為模板，進(jìn)行qPCR 表達(dá)分析（引物見表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2 核桃JrbHLH 基因家族分析

利用UniProt 數(shù)據(jù)庫中擬南芥bHLH 家族蛋白序列信息，采用HMMER 3.1 b 軟件構(gòu)建隱馬爾可夫模型，從NCBI 數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/? term=txid51240［orgn］）下載核桃蛋白序列，采用歐洲生物信息學(xué)研究所Pfam 蛋白家族數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；通過Gene Structure Display Server（http://gsds.gao-lab.org/） 和MEME（http://meme-suite.org/）在線分析工具分析核桃JrbHLH 家族成員的基因結(jié)構(gòu)和蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用MEGA X 軟件的NJ法構(gòu)建JrbHLH 和AtbHLH 家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 為1 000，其他參數(shù)默認(rèn)。

1.3 核桃JrbHLH 基因的生物信息學(xué)分析

采用WEBLOGO（http://www.weblogo/）分析家族成員蛋白氨基酸保守位點；利用NCBI 在線分析軟件ORF Finder （https://www.ncbi.nlm.nih.gov /orffnder/）查找bHLH 基因家族成員的ORF。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)使用ExPASy （https://web.expasy.org/protparam/）在線網(wǎng)站分析［12］；利用NetPhos 3.1 Server 和Net NGlyc 1.0 Server 分別預(yù)測蛋白的糖基化和磷酸化位點；采用SignalP3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線工具對蛋白信號肽預(yù)測；利用ngLOC 與Nuc-PLoc 在線軟件（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Nuc-PLoc/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；使用STRING 在線工具（https://www.string-db.org/）分析蛋白互作；使用Plantcare 在線工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析基因家族成員啟動子序列功能。

1.4 qRT-PCR 反應(yīng)體系、程序與計算方法

反應(yīng)程序：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；72 ℃，1 min；4 ℃，holding。qPCR 反應(yīng)體系（20 μL）：含12.5 μL SYBR MIX、1.0 μL cDNA 模板、1.0 μL F Primer、1.0 μL R Primer、4.5 μL ddH2O；反應(yīng)體系：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 min；72 ℃，1 min；4 ℃，holding。試驗結(jié)果用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃JrbHLH 家族成員挖掘與分析

利用擬南芥bHLH 家族成員的蛋白序列信息構(gòu)建隱馬爾可夫模型搜索核桃蛋白數(shù)據(jù)，初步鑒定了124 個bHLH 家族基因。經(jīng)過Pfam 結(jié)構(gòu)域分析，最終獲得72 個JrbHLH TFs 家族成員，并根據(jù)其在核桃中的注釋信息進(jìn)行編號（表2）。72 個基因中，最短591 bp（JrbHLH140），最長21 151 bp（JrbHLH112），開放閱讀框（ORF）長度約為393（JrbHLH130-4）～1 839 bp（JrbHLH13），翻譯的JrbHLH 蛋白長度約為130（JrbHLH130-4）～612個氨基酸（JrbHLH13），分子量（MW）為14.86（JrbHLH130-4）～67.96 kD（JrbHLH13），等電點（PI）為4.61（JrbHLH93-2）～9.51（JrbHLH130-4），74%為弱酸性（PI＜7），26%為部分堿性。

表2 核桃JrbHLH 家族成員的基因信息Table 2 Basic information of JrbHLH gene family members in J.regia

通過對家族成員信號肽進(jìn)行預(yù)測（表3），發(fā)現(xiàn)72 個成員缺乏信號肽。ExPASy 用于預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，如基因不穩(wěn)定指數(shù)和疏水性。JrbHLH 蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)在36.61（JrbHLH144-2）～69.01（JrbHLH96） 之 間， 只 有JrbHLH144-2 和JrbHLH75 是穩(wěn)定蛋白（穩(wěn)定系數(shù)＜40）。蛋白質(zhì)的平均疏水性從-0.858（JrbHLH104）到-0.212（JrbHLH51-2），均為親水性蛋白。ngLOC 和Nuc-PLoc 在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示，72 個蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核。利用Net-NGlyc 1.0 和NetPhos 3.1Server 預(yù)測蛋白的磷酸化位點和糖基化，有助于了解核桃bHLH家族成員在蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾的差異。磷酸化位點結(jié)果顯示72 個bHLH 蛋白均含有多個磷酸化位點（表3），主要體現(xiàn)在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點數(shù)量的差異。通過對核桃JrbHLH 家族成員N-糖基化和O-糖化的潛在位點分析結(jié)果顯示，該家族成員含有數(shù)量不等的潛在位點。

2.2 核桃bHLH 家族成員的同源進(jìn)化分析

進(jìn)一步將多序列比對來的結(jié)果制作成WebLogo圖（圖1）。72 bHLH 中各位點的氨基酸大小反映在氨基酸保守性上。其中24 個位點呈現(xiàn)50%以上的保守氨基酸，尤其是Glu-10、Arg-11/Arg-13/Arg-14、Leu-24、Pro-30 和Leu-513 等氨基酸殘基，均呈現(xiàn)90%以上的保守性，Pro-30 和Leu-53 達(dá)到100%。

圖1 bHLH 域的WebLogo 圖Fig.1 WebLogo of bHLH domain

為探究核桃中bHLH 成員進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA X 對核桃和擬南芥中bHLH 家族成員采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2?；跀M南芥的bHLH 基因分類顯示，核桃bHLH 家族成員可分布到15 個亞群，部分亞群缺失。在72 個核桃蛋白中，18 亞組分布最多，包含12 個核桃JrbHLH蛋白，6、17、20 亞組最少，每個亞組僅包含1 個。

圖2 采用MEGA X 鄰接法( NJ )構(gòu)建擬南芥和核桃系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic analysis of Arabidopsis thaliana and Juglans regia with the joining (NJ) method by MEGA X

2.3 核桃JrbHLH 家族基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

為了進(jìn)一步分析72 個成員基因結(jié)構(gòu)，繪制外顯子- 內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖。結(jié)果表明，除JrbHLH13、JrbHLH3、JrbHLH87-1、JrbHLH87-2、JrbHLH144-1 和JrbHLH144-2 外，bHLH 基因均含有1 ～9 個內(nèi)含子。在同一亞家族內(nèi)存在相似的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)。如在第9 亞群中，每個基因含有3 個內(nèi)含子，第12 亞群有5 個內(nèi)含子。利用MEME 軟件對72 個蛋白的保守motif 進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見圖4。前10 個保守基序位于bHLH 家族成員典型的跨膜螺旋區(qū)和未知的功能復(fù)合體區(qū)，而且在核桃bHLH 家族的72 個成員共有motif 1 和motif 2，并且高度保守。

2.4 核桃bHLH TFs 啟動子順式結(jié)合元件分析

通過對家族成員啟動子上游2 000 bp 區(qū)域進(jìn)行與激素和脅迫相關(guān)的順式結(jié)合元件分析，結(jié)果見圖3。由圖3 可以看出，除JrbHLH128-1、JrbHLH128-2、JrbHLH137-2、JrbHLH140、JrbHLH85-1、JrbHLH85-2、JrbHLH93-4、JrbHLH95-1、JrbHLH95-2、JrICE1、JrbICE4之外，核桃bHLH 基因啟動子區(qū)存在豐富的激素信號和脅迫應(yīng)答調(diào)控元件，推測可能是參與核桃逆境脅迫和生長發(fā)育相關(guān)。

2.5 基于冷脅迫轉(zhuǎn)錄組核桃差異表達(dá)基因的表達(dá)分析

根據(jù)冷脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析，并對冷脅迫下DEGs 進(jìn)行篩選，padj ＜0.05 and log2(fold change) ＞1 為新的篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表4。獲得16 個冷脅迫下差異表達(dá)基因，在‘遼寧8 號’中有6 個顯著上調(diào)的基因，分別是JrbHLH35-1、JrICE4、JrbHLH35-2、JrbHLH13、JrbHLH74、JrbHLH128-1， 顯著 下 調(diào) 的 有6 個，JrbHLH80、JrbHLH63、JrbHLH3、JrbHLH77、JrbHLH122、JrbHLH41；在‘清香’冷脅迫48 h 后顯著上調(diào)的有6 個，JrICE3、JrbHLH74、JrbHLH25、JrbHLH128-1、JrbHLH130-2、JrbHLH51-2，顯著下調(diào)的有2 個，分別是JrbHLH3、JrbHLH122。

表4 JrbHLH 基因家族DEGs 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Table 4 Expression of DEGs in JrbHLH gene family

采用qPCR 分析在‘清香’冷脅迫不同時間和‘清香’不同組織中16 個差異基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)（結(jié)果見圖4 和圖5）。

圖5 不同組織中DEGs 的相對表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of selected DEGs genes in different tissues

結(jié)果表明，JrbHLH122和JrbHLH25的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，JrbHLH13和JrbHLH3的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢，兩者區(qū)別是JrbHLH13在冷脅迫后期表達(dá)增加，可能在該時期對耐冷脅迫性有更大的影響；JrbHLH3表達(dá)量在冷脅迫早期增加，峰值出現(xiàn)在冷脅迫24 h，比對照高近5 倍。JrbHLH128和JrbHLH63則呈現(xiàn)相反的表達(dá)模式，JrbHLH128在冷脅迫開始后先上升后下降，而JrbHLH63則先下降后上升。在不同組織中表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)一些基因表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)。如JrbHLH3在成熟葉、根和芽中高表達(dá)，JrbHLH80在成熟葉中表達(dá)最多，JrbHLH13在根中表達(dá)最多。結(jié)果表明16 個DEG對冷脅迫均有不同程度的響應(yīng)，進(jìn)一步驗證了這些DEGs 能夠響應(yīng)冷脅迫的誘導(dǎo)，并且參與到不同組織器官的發(fā)育中。

3 討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)外已經(jīng)對基因家族進(jìn)行了大量的研究，并獲得了多個植物響應(yīng)逆境的家族，其中就包括bHLH TFs 家族。bHLH TFs 家族已在許多植物物種中得到鑒定，例如，銀杏葉中鑒定出85 個bHLH TFs［13］，甜櫻桃中鑒定出66 個bHLH TFs［5］，茶樹中鑒定出134 個bHLH TFs［9］，龍血樹中鑒定出62 個［14］，桂花中則有206 個bHLH TFs［15］等。然而，對核桃中bHLH TFs 在非生物脅迫響應(yīng)中的作用知之甚少。

在本研究中，72 個bHLH TFs 家族成員被鑒定出來后并進(jìn)行了生物信息分析發(fā)現(xiàn)，bHLH 基因數(shù)量低于其他植物物種，這可能與基因組復(fù)制的進(jìn)化差異或這些植物物種的基因組大小有關(guān)［16-17］。基因結(jié)構(gòu)分析表明，每個小分支結(jié)構(gòu)相似，亞群高度保守；此外，基因序列分析表明，JrbHLH 家族成員高度保守，但亞家族之間存在較大差異。15 個亞組有共有的Motif 1 和Motif 2，一些亞組的成員也有自己獨特的保守基序，這一現(xiàn)象也得到了其他植物研究人員的證實［17］。與其他常見植物物種相比，核桃中bHLH 家族的亞組較少，這可能是由于整個核桃基因組中的全基因組復(fù)制事件較少，這在其他物種中已有報道。例如，在桂花中成功鑒定了206個OfbHLH TFs，被分為25 個亞組，推測是基因重復(fù)事件基因家族的擴張［15］。龍血樹中鑒定的62 個bHLH TFs，根據(jù)與擬南芥蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育比較，這些基因被分為19 個亞組［12］。在山茶中共鑒定了134 個CsbHLH TFs，根據(jù)擬南芥分類將它們分為17 個亞組［9］。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在核桃72 個TFs 中有14個基因為差異表達(dá)基因， 包括JrbHLH35-1、JrICE4、JrbHLH35-2、JrbHLH13、JrbHLH74、JrbHLH128-1、JrbHLH80、JrbHLH63、JrbHLH3、JrbHLH77、JrbHLH122、JrbHLH41等。在其他植物中做了大量同源基因的研究。例如，茶樹和楊樹中bHLH35 均可以改善脅迫下的耐受性［18-19］。bHLH13與JAZ 相互作用并抑制JA 參與到擬南芥的應(yīng)激反應(yīng)中［20］。擬南芥AtMIR396a 的過表達(dá)降低了GRF 基因和bHLH74 等靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，并導(dǎo)致更短的根表型，過表達(dá)bHLH74促進(jìn)了根的生長［21］。桂花（Osmanthus fragrans）bHLH128具有轉(zhuǎn)錄激活活性，參與了耐寒基因表達(dá)的調(diào)控［15］。棉花GhbHLH130低溫和干旱中參與了ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［22］；而且在煙草中過表達(dá)MdbHLH130顯著的提高了煙草的耐旱能力［23］。將苦蕎FtbHLH3轉(zhuǎn)化擬南芥使MDA 含量下降、REC 和ROS 減少，提高Pro 含量、抗氧化活性升高導(dǎo)致干旱/氧化耐受性增加［24］。bHLH122在擬南芥中轉(zhuǎn)化后，增加了植物對不良環(huán)境的適應(yīng)能力，bhlh122對鹽脅迫更敏感［25］。本研究結(jié)果在72個TFs 中篩選到的這16 個基因在冷脅迫下表達(dá)差異顯著，推測可能參與到核桃響應(yīng)冷脅迫的過程，而且bHLH3 轉(zhuǎn)錄水平與多個黃酮類和糖苷類相對含量存在顯著相關(guān)性，進(jìn)一步說明了bHLH TFs 在核桃響應(yīng)冷脅迫中的重要作用。