基于ISSR 分子標記的鈴鐺鐵線蓮品種雜交F1 代鑒定

耿宇航，周欣瑩，賈艷艷，孫浩男，劉冬云

（河北農(nóng)業(yè)大學 園林與旅游學院，河北 保定 071000）

毛茛科（Ranunculaceae）鐵線蓮屬（Clematis）植物大多為藤本植物，觀賞價值極高，不僅常被用于籬垣廊架的垂直綠化和裝飾，還可用于地被、盆栽等［1］。其植株姿態(tài)優(yōu)雅，花色艷麗，花型豐富，有平展呈盤狀、鐘狀、半鐘狀及鈴鐺狀，單瓣或重瓣，花期較長，全年不同品種可交替開花［2-3］。我國鐵線蓮種質(zhì)資源豐富，幾乎涵蓋了鐵線蓮屬所有類型［4］。根據(jù)英國皇家園藝協(xié)會的分類，目前市場上常見的園藝品種可以分為：全緣組、南歐組、佛羅里達組、德克薩斯組和長瓣組等［5］。德克薩斯組鈴鐺型鐵線蓮為多年生草質(zhì)藤本，花單生，花型精巧，杯型，似“小鈴鐺”，下垂，萼片4 枚，莖葉纖細，花色豐富，萼片反卷程度不同，上下萼花色不同，萼片邊緣有波浪狀起伏，觀賞價值高，花期長，適應(yīng)性強。根據(jù)在華北地區(qū)栽種的表現(xiàn)，鈴鐺鐵線蓮花期為5—9月，在夏季高溫天氣仍然能保持小鈴鐺般優(yōu)雅的姿態(tài)，為華北地區(qū)垂直綠化提供新的選擇，但由于鐵線蓮育種年限漫長［6］，基因型高度雜合，后代分離廣泛［7］，只依靠形態(tài)學特征探究其真實性及遺傳特性會大大降低其育種效率。

國內(nèi)外學者對鐵線蓮屬植物的研究仍然以大花鐵線蓮為主［8］，而有關(guān)鈴鐺鐵線蓮的研究較少。鈴鐺鐵線蓮品種多產(chǎn)于北美和日本，其主要親本包括革花鐵線蓮（C.viorna）等，國內(nèi)也有部分花型相似野生種，如褐毛鐵線蓮（C.fusca）、芹葉鐵線蓮（C.aethusifolia）、甘青鐵線蓮（C.tangutica）等，褐毛鐵線蓮和甘青鐵線蓮早自19 世紀被引入歐洲［9］，可能也參與了鈴鐺鐵線蓮的育種進程。有性雜交育種仍然是鐵線蓮屬植物品種創(chuàng)新的最主要的、效果顯著的途徑［8,10］，但國內(nèi)鐵線蓮育種起步較晚，與國外育種研究差異較大［11］。限制鈴鐺鐵線蓮雜交育種的主要因素包括敗育［5］、育種年限漫長等，而利用分子標記對其雜交F1代進行鑒定，可以在植株生長早期從分子角度鑒定其是否為真雜種，較形態(tài)學鑒定更加穩(wěn)定、快捷和準確。目前，分子標記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于鐵線蓮屬植物親緣關(guān)系及遺傳變異分析的研究中，如ISSR［12-13］、SSR［14］、RAPD［15］等，但對于其雜交子代，目前僅有雜交座果率和結(jié)實率、子代表型等研究［6,16-17］，Yuan 等［18］利用RAPD 技術(shù)對卷萼鐵線蓮（C.tubulosa）和短尾鐵線蓮（C.brevicaudata）的雜交F1代進行了分子鑒定，其他分子鑒定研究鮮有所見。ISSR 分子標記技術(shù)是目前常用的分子生物學分析手段之一，它將SSR 和AFLP 的許多優(yōu)點與RAPD 的普遍性結(jié)合起來，具有多態(tài)性良好、成本低、操作便捷等特點［19-20］。本研究利用ISSR 分子標記技術(shù)對鈴鐺鐵線蓮雜交F1代幼苗進行真實性鑒定及遺傳多樣性分析，旨在為鈴鐺鐵線蓮新品種選育、指紋圖譜構(gòu)建等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料中6 個鈴鐺鐵線蓮品種分別為‘蓬巴杜’‘妙?！鞣苼啞材崴_’‘斯嘉麗’和‘胭脂扣’（圖1）。將6 個品種進行組配后進行常規(guī)人工雜交，獲得結(jié)實數(shù)、有胚率及發(fā)芽率如表1 所示，挑選長勢較為良好的F1代取材0.2 g 葉片，共獲得37 份雜交F1代材料。

表1 雜交組合信息Table 1 Information of hybrid combinations

圖1 雜交親本材料Fig.1 Flowers of the hybrid parents

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取與檢測 采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒（CW0531M，康為世紀），按照說明書步驟提取親本和子代的DNA，將檢測合格的DNA 模板及引物濃度分別稀釋成50 ng/μL、10 μmol/L 的工作液，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 特異性引物的篩選及PCR 擴增 本試驗參照王鑫［11］對鐵線蓮屬植物的ISSR 引物及ISSR-PCR反應(yīng)的擴增程序進行操作，引物及序列如表2 所示。挑選多態(tài)性良好的12 條引物進行親本特異性篩選。PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，退火溫度依據(jù)引物設(shè)定，72 ℃延伸1 min，設(shè)置PCR 反應(yīng)總程序共40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用FR-2000 成像系統(tǒng)上觀察并保存圖像。

表2 12 條多態(tài)性高的ISSR 引物Table 2 12 ISSR primers with high polymorphisml

1.2.3 子代真實性鑒定 用篩選出的多態(tài)性高、且具有父本特異性條帶的引物組合對供檢驗的37 個F1代進行雜交子代身份真實性鑒定。參照文獻［21］的判定標準，子代PCR 產(chǎn)物中產(chǎn)生與父本一致條帶或出現(xiàn)不同于父母本的條帶類型即為真雜種，若產(chǎn)生母本一致條帶則為假雜種或自交種。從擴增的電泳圖中選擇清晰可重復的條帶，同位點上有條帶的記“1”，無條帶的記“0”，轉(zhuǎn)化為1、0 矩陣，利用利用 Popgene 32 軟件計算等位基因數(shù)（Na）等指數(shù)，利用 NTsys 2.10 軟件分析，使用UPGMA 法繪制聚類分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 的純度檢測

對37 份雜交F1 代材料提取DNA，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度（圖2），所提取DNA 條帶清晰無拖帶，其OD 值的結(jié)果均在1.7 ～2.2 之間，說明DNA 純度較高、無蛋白質(zhì)和RNA 污染，可以投入試驗繼續(xù)使用。

圖2 37 份雜交F1 代DNA 基因組電泳檢測結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of genomic DNA from 37 hybrids

2.2 ISSR 標記特異性條帶鑒定

由圖3 和表3 可知，12 條引物在鈴鐺鐵線蓮雜交親本和F1代中可產(chǎn)生多個片段，多態(tài)性高，均可表現(xiàn)父本特異性，觀察到的特異性條帶可用作評估雜種純度的標記，利用能夠表現(xiàn)父本特異性的引物進行下一步雜種的鑒定。

表3 不同雜交組合的引物篩選結(jié)果Table 3 Filtering results of different primer combination

圖3 6 個雜交組合在引物下的部分PCR 擴增電泳圖譜Fig.3 Partial PCR amplification results of 6 hybridization combinations

2.3 后代擴增結(jié)果和分析

在ISSR 鑒定結(jié)果中，只有成功擴增出每個雜交組合中父本的特異性條帶的引物才可被認定是驗證該雜交子代真實性的引物。雜種和親本共43 份材料，在上述特異性引物檢測下條帶主要分布在250 ～2 000 bp，條帶統(tǒng)計結(jié)果如表所示（表4）。37 份材料均具有豐富的遺傳多樣性，F(xiàn)1代與親本共有條帶占多數(shù)，但也有X38 和X55 組合中子代條帶與父本共有偏多，說明這些雜交F1代得到父本的遺傳物質(zhì)較多，也說明了產(chǎn)生的F1代為真雜種；雜交F1代出現(xiàn)的多態(tài)性條帶分別來自父本或母本，說明不同子代遺傳了父母本不同的遺傳物質(zhì)，同時有些子代還出現(xiàn)了雙親均無的條帶，說明在雜交過程中，可能由于基因重組發(fā)生了新的變異。

表4 雜交F1 代的ISSR 擴增位點統(tǒng)計信息Table 4 Statistical information of ISSR amplified loci of F1 hybrid

2.4 遺傳多樣性分析

采用多個遺傳參數(shù)對鈴鐺鐵線蓮雜交后代遺傳多樣性進行分析，結(jié)果顯示，鈴鐺鐵線蓮親本和F1代的等位基因數(shù)范圍在1.829 ～1.939 之間，等位基因數(shù)在1.410 ～1.639 之間、基因多樣性為0.251 ～0.362 之間、多樣性信息指數(shù)為0.385 ～0.531之間，基因庫較為豐富。

植物間遺傳相似系數(shù)越大，說明遺傳背景越相似。鈴鐺鐵線蓮親本和子代之間的遺傳相似性系數(shù)在0.400 ～0.771 之間，F(xiàn)1代與親本相差較大的為X155 雜交組合（表5），變動幅度為0.371，其中D5 與父本‘安尼薩’親緣關(guān)系最遠，相似性系數(shù)為0.400，D3、D4、D6 與母本‘索菲亞’最為相似，相似性系數(shù)為0.771。F1代之間相似性系數(shù)相差較大的為X162 組合，7 個F1代遺傳相似性系數(shù)在0.523 ～0.886 之間，平均相似性系數(shù)為0.702，其中，D5 和D6 親緣關(guān)系最近，相似性系數(shù)可達0.886，D4 和D9 相似性系數(shù)最低，為0.523。由此可見，F(xiàn)1代和親本之間、F1代之間都存在著豐富的遺傳變異。

表5 ISSR 標記的X155 組合中親本與雜交F1 代遺傳相似性系數(shù)Table 5 Genetic similarity coefficients between parents and F1 hybrids in the X155 combination marked by ISSR

2.5 聚類分析

根據(jù)遺傳相似性系數(shù)矩陣，利用UPMGMA 法進行聚類分析，構(gòu)建聚類分析樹狀圖（圖4）。從樹狀圖看出，鈴鐺鐵線蓮F1代雜種和父母本的遺傳相似系數(shù)在0.420 ～0.770 之間，變動幅度為0.350，雜交F1代和親本可大致都分為2 類，X38、X155、X168 組合中F1代為偏父型，X18、X55、X162 組合中F1代為偏母型。在X18 組合中，親本和F1代的遺傳相似系數(shù)在0.510 ～0.820 之間，以遺傳相似系數(shù)0.542 為閾值，親本和子代可分為2 大類，第1類為母本‘妙?！? 個子代，第2 類為父本‘蓬巴杜’，其中子代中的A4 和A7 最為相似，相似性系數(shù)達0.820，A4、A7、A1、A5 與母本的親緣關(guān)系較近。在X38 組合，親本和6 個雜交F1代的遺傳相似系數(shù)在0.480 ～0.890 之間，以遺傳相似系數(shù)0.568 為閾值，親本和子代可分為2 大類，第1 類為母本‘蘇菲’，第2 類為父本‘蓬巴杜’和雜交F1代，而在第2 個分支中，F(xiàn)1代先聚為1 類，再與父本聚為1 個分支，表明F1代都為偏父型，與父本親緣關(guān)系較近，但雜交F1代之間又比其在雙親間親緣關(guān)系更近，其中子代B3 和B6 最為相似，遺傳相似性系數(shù)可達0.900。

圖4 6 個雜交組合親本和子代的UPGMA 聚類圖Fig.4 UPGMA clustering of parents and hybrids of the 6 hybrid combination

3 討論

雜交可以繼承父母本的優(yōu)良性狀，還可以創(chuàng)造新的優(yōu)良性狀，豐富物種遺傳多樣性。對于鈴鐺鐵線蓮的生物學特性來說，對鈴鐺鐵線蓮雜交后代進行早期鑒定是十分必要的，利用分子鑒定能夠較早地剔除假雜種，為進一步育種工作的展開提供依據(jù)［22］。12 條引物在鈴鐺鐵線蓮中都能擴增出多態(tài)性高且具有特異性的條帶，但不同品種的特異性引物有所區(qū)別。F1代在引物的擴增下，均遺傳了父本的特異性條帶或產(chǎn)生了新的帶型，為真雜種，且多數(shù)條帶都來自于親本，出現(xiàn)了父母本條帶結(jié)合的情況，例如X18、X168 組合，雙親共有條帶可占比45.38%、52.20%，說明這些F1代融合了父母本的遺傳物質(zhì)，可能表型會更加豐富。但也有F1代在引物的擴增下出現(xiàn)了新的條帶，即產(chǎn)生了父母本均不具有的條帶類型，尤其是X38 和X162 組合中，分別出現(xiàn)了25 和28 個新位點，說明雜交后代的基因發(fā)生了重組，可能會產(chǎn)生新的性狀，原因可能是父母本雜合性較高，不同長度的等位核苷酸序列之間形成了異源雙鏈體，表現(xiàn)為不同于親代的新位點，這在Dongre［23］對棉屬（Gossypium）雜種后代的鑒定、Jade［24］對珍珠粟（Pennisetum glaucum）和象草（(Pennisetum purpureumSchumach）種間雜種后代的研究中都出現(xiàn)了相似的情況。

鈴鐺鐵線蓮37 個F1代真雜種單株和父母本的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.400 ～0.771，變動幅度為0.371，說明鐵線蓮雜交F1代具有較豐富的遺傳變異性。ISSR 聚類圖分析結(jié)果表明這6 個組合出現(xiàn)了不同的偏向父母本的情況，X18、X55、X162為偏母型，和母本親緣關(guān)系較近的原因可能是細胞質(zhì)基因在遺傳性狀的表達中發(fā)揮了作用［25］；而X38、X155、X168 都為偏父型，推斷可能是在雜交過程中發(fā)生了染色體的不均衡分配，一些DNA 片段的插入所導致［26］。而Carvalho［27］在對小麥族（Triticeae）種間雜交F1代遺傳關(guān)系進行分析時，也出現(xiàn)了不同雜交組合偏向不同父母本的現(xiàn)象。

在雜交過程中發(fā)現(xiàn)，溫度降低會延長鈴鐺鐵線蓮雜交種的成熟時間，且鈴鐺雜交成熟種存在休眠時間過長的現(xiàn)象，有的可長達1 年，但余偉軍［9］發(fā)現(xiàn)，在雜交種由綠變黃時取下，隨取隨播可以減少種子休眠物質(zhì)的積累，可以起到促進鈴鐺鐵線蓮雜種萌發(fā)的作用。在試驗中還發(fā)現(xiàn)以‘蓬巴杜’品種作為雜交組合的母本，結(jié)實率高，出苗時間較早，長勢較快，Xu［28］等對白樺（Betula platyphylla）雜種后代進行分析研究后發(fā)現(xiàn)以白樺系Q3 作為雜交組合的母本，其后代具有較強的性狀，身高和直徑表現(xiàn)較好；Gupta［29］也發(fā)現(xiàn)珍珠粟（Pennisetum glaucum）雜交F1代的雜種優(yōu)勢和G4R、G10B 等親本有關(guān)。待F1代植株成熟后，可結(jié)合其形態(tài)特征進行進一步分析，為未來其育種做準備。

4 結(jié)論

本研究首次利用ISSR 分子標記對鈴鐺鐵線蓮雜交F1代進行真實性鑒定和遺傳多樣性分析，37 個F1代均為真雜種，獲得親本結(jié)合的遺傳物質(zhì)較多，還產(chǎn)生了新的遺傳物質(zhì)，具有產(chǎn)生遺傳變異的特點，且遺傳多樣性豐富。F1代在基因上出現(xiàn)了明顯偏向某一方的現(xiàn)象，為后續(xù)雜交親本選擇與選配提供借鑒。ISSR 分子標記可有效地在鈴鐺鐵線蓮雜交后代生長早期用于鑒定其是否為真雜種，為鈴鐺鐵線蓮新品種選育、指紋圖譜構(gòu)建等提供分子依據(jù)。