梔子苷對部分膀胱出口梗阻模型大鼠膀胱功能障礙的改善作用及機制探討

馬威武,劉 強,李帥彪,蘇志恒,臧洪學,邵敬會

(保定市第四中心醫(yī)院泌尿外科,河北 保定 072350)

膀胱出口梗阻(Bladder outlet obstruction,BOO)是下尿路癥狀(Lower urinary tract symptoms,LUTS)的常見病因,其可以損害膀胱形態(tài)、結構和功能[1-2]。一般情況下,LUTS可以隨著阻塞的緩解而緩解,但部分患者在梗阻緩解后仍會出現(xiàn)嚴重的膀胱功能障礙和難治性LUTS,這表明患者發(fā)生了繼發(fā)于BOO的不可逆膀胱功能障礙,嚴重者還會出現(xiàn)腎小管和間質(zhì)損傷,繼而出現(xiàn)炎性細胞浸潤和間質(zhì)纖維化,最終損害腎功能[3]。然而,目前仍沒有有效的方法治療BOO繼發(fā)引起的膀胱功能損害。研究[4-6]表明,炎性反應和氧化應激參與BOO的病理過程,施加在膀胱上的壓力會導致過多促纖維化細胞外基質(zhì)蛋白沉積在膀胱壁中,損害膀胱結構及功能,最終形成難治性膀胱功能障礙。核因子E2相關因子2 (Nrf2)介導的抗氧化應激和核因子κB (NF-κB)參與的炎性反應對維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用,激活Nrf2抑制氧化應激和NF-κB信號傳導可改善膀胱功能障礙[7]。故找到改善氧化損傷和(或)抑制炎性反應的藥物可能是治療BOO的策略之一。梔子苷(Geniposide,GE)是一種從梔子果實中提取的環(huán)烯醚萜苷,具有多種藥理活性,包括抗氧化應激和抗炎作用[8]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)GE可以顯著逆轉(zhuǎn)部分膀胱出口梗阻(partial bladder outlet obstruction,pBOO)模型大鼠膀胱組織低順應性和提高膀胱肌張力,激活Nrf2提高抗氧化酶水平,抑制氧化損傷引起的膀胱炎癥。本研究明確了口服GE可以改善繼發(fā)于BOO的膀胱功能障礙,并闡明了其作用機制,為后續(xù)GE臨床治療BOO提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 GE (貨號為HY-N0009)和ZD7288 (貨號為HY-101346)購買于Med Chem Express公司;蘇木素-伊紅(HE)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購買于北京索萊寶科技有限公司(貨號G1120、BC0025);谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(貨號S0059S)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(貨號S0101S)、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(貨號P0018S)和蛋白印跡相關試劑購自上海碧云天生物技術有限公司;High Capacity RNA-to-cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號4368814)和SYBRTMGreen探針(貨號4309155)購自美國賽默飛公司;Nrf2和血紅素氧合酶-1 (HO-1)多克隆抗體來自英國Abcam公司(貨號ab92946、ab137749);核因子-κB p65 (NF-κB p65)、P-NF-κB p65 (Ser536)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(貨號8242、3033、5174、7074S)購買于美國Cell Signaling Technology公司;其余試劑購自國內(nèi)相關生物公司。

1.2 實驗動物 雌性SPF級別 SD大鼠30只,體重150～170 g購自珠海百試通生物科技有限公司,生產(chǎn)合格證號SCXK(粵)2020-0051;大鼠按照廣州銳格生物科技有限公司動物飼養(yǎng)管理規(guī)程進行飼養(yǎng),房間溫度(22±2)oC,濕度為50%～70%,房間12 h光照/12 h黑暗交替,大鼠自由進食和飲水。

1.3 實驗方法

1.3.1 pBOO大鼠模型建立及分組[9]:大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后,沿下腹腹壁切開1～2 cm,暴露膀胱后游離出膀胱頸,緊貼膀胱頸放置PE-20管,使用3-0聚丙烯縫合線在膀胱頸和尿道周圍系上系帶,拔出PE-20管,縫合切口。術后所有大鼠均皮下注射頭孢曲松鈉(7 mg/kg)防止術后感染,按照5 mg/(kg·d)攝入量在大鼠籠內(nèi)放入含有美洛昔康的膳食補充劑果凍,對術后大鼠鎮(zhèn)痛。pBOO造模4周后,將大鼠分為五組,假手術(Sham)組,pBOO組,GE 20、40、80 mg/kg組,每組6只,每天灌胃1次;Sham組和pBOO組大鼠給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)給藥14 d。

1.3.2 pBOO模型大鼠膀胱尿流動力學檢查:異氟烷麻醉大鼠,從尿道插入直徑1 mm PE-20管,按壓膀胱排凈尿液,將導管連接到與微量輸液泵和壓力傳感器相連的三通閥,微量輸液泵以0.2 ml/min持續(xù)向膀胱內(nèi)灌注37 ℃、0.9%氯化鈉溶液,然后利用高性能多通道信號處理器系統(tǒng)放大和可視化壓力傳感器輸出的膀胱容量及膀胱壓。膀胱容量的變化(ΔV)以灌注0.9%氯化鈉溶液到漏尿時的灌注量表示,膀胱內(nèi)壓的變化(ΔP)以漏尿點壓力表示,膀胱順應性(Compliance,C)=ΔV/ΔP。

1.3.3 膀胱肌張力檢測:異氟烷麻醉安樂死大鼠,無菌條件下切取大鼠膀胱,使用Krebs-Ringer營養(yǎng)液清洗并剔除膀胱黏膜層,將膀胱切成7 mm×2 mm×2 mm大小的縱行肌條,放入含Krebs-Ringer營養(yǎng)液的浴槽內(nèi),外圍37 ℃恒溫水浴,按照19∶1通入O2和CO2到營養(yǎng)液中,孵育30 min后獲得膀胱肌條的基礎收縮力,調(diào)整基礎張力至0.75 g后記錄肌條收縮相對穩(wěn)定之后連續(xù)的張力,然后給予終濃度為50 μmol/L的ZD7288,記錄膀胱肌條自發(fā)性收縮幅度變化。

1.3.4 膀胱組織病理檢測:石蠟包埋膀胱組織切成5 μm,按照HE試劑盒說明書進行染色,最后利用熒光顯微鏡下進行拍照(×100)。

1.3.5 MDA含量及GSH-Px、SOD活性檢測:膀胱組織稱重后,分別按照MDA、GSH-Px及SOD試劑盒說明書進行檢測。MDA含量、GSH-Px和SOD活性結果用各組別BCA定量的蛋白質(zhì)量進行標準化。

1.3.6 蛋白印跡檢測:蛋白定量及變性后,每孔上樣25 μg,通過SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉2 h,將膜與對應一抗(1∶1000稀釋)在4 ℃下孵育過夜后,加入HRP偶聯(lián)的二抗(1∶2000稀釋)室溫孵育2 h,利用Image Lab圖像采集和分析軟件進行成像與灰度分析。

1.3.7 實時熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測:利用High Capacity RNA-to-cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄后進行RT-qPCR檢測。以18s rRNA為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt計算白介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白介素-1β (IL-1β) mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠膀胱重量及膀胱與體重比值比較 與Sham組相比,pBOO組大鼠膀胱重量及膀胱與體重的比值均顯著增加(均P<0.05);GE 40、80 mg/kg組治療2周后,均可以顯著降低大鼠膀胱重量及膀胱與體重的比值(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠膀胱重量及膀胱與體重比值比較

2.2 各組大鼠膀胱順應性和膀胱張力比較 與Sham組相比,pBOO組大鼠膀胱出現(xiàn)梗阻性低順應性和膀胱肌張力下降(均P<0.05);GE 40、80 mg/kg組治療后可以顯著提高大鼠膀胱梗阻性低順應性和膀胱肌張力(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠膀胱順應性和膀胱張力比較

2.3 GE顯著降低pBOO模型大鼠膀胱組織炎性細胞浸潤 HE染色結果顯示,pBOO大鼠膀胱組織出現(xiàn)明顯的炎癥細胞浸潤,GE治療后可以明顯抑制大鼠膀胱組織中的炎癥細胞浸潤,見圖1。

2.4 各組大鼠膀胱組織MDA含量、SOD和GSH-Px活性比較 與Sham組相比,pBOO組大鼠MDA含量顯著上調(diào)(P<0.05),SOD及GSH-Px活性明顯降低(均P<0.05)。GE 40、80 mg/kg組顯著降低MDA含量、增加SOD及GSH-Px活性(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠膀胱組織MDA含量、SOD和GSH-Px活性比較

2.5 各組大鼠膀胱組織Nrf2/NF-κB通路蛋白相對表達水平比較 與Sham組相比,pBOO組大鼠Nrf2和HO-1蛋白表達顯著下降(均P<0.05),NF-κB蛋白磷酸化水平明顯提高(P<0.05);GE 40、80 mg/kg組顯著增加Nrf2和HO-1蛋白表達、降低NF-κB蛋白磷酸化水平(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠膀胱組織Nrf2/NF-κB通路蛋白相對表達水平比較

2.6 各組大鼠大鼠膀胱組織炎癥因子mRNA表達水平比較 與Sham組比較,pBOO組IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);與pBOO組比較,GE 40、80 mg/kg組IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達水平顯著降低(均P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠大鼠膀胱組織炎癥因子mRNA表達水平比較

3 討 論

研究[10]發(fā)現(xiàn),BOO誘導的模型大鼠膀胱重塑與有膀胱出口梗阻的患者相似,是探索膀胱結構和功能改變的常用模型。我們發(fā)現(xiàn)口服GE可顯著改善pBOO大鼠膀胱功能障礙。研究[11-12]表明,口服GE在不同疾病模型中的治療劑量范圍在20～200 mg/kg。急毒研究表明,GE在574 mg/kg可引起大鼠肝毒性;長毒研究表明,大鼠連續(xù)口服24.3、72.9 mg/kg 90 dGE,不會引起肝毒性[13]。綜上,我們選擇的20、40、80 mg/kg劑量是安全的。

BOO可以導致膀胱順應性下降,逼尿肌層中細胞外基質(zhì)蛋白沉積是順應性降低的主要原因,由于逼尿肌對阻塞的適應,膀胱會出現(xiàn)肥大和膀胱肌彈性消失[14-15]。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn),pBOO大鼠膀胱重量明顯增大,膀胱組織出現(xiàn)梗阻性低順應性和膀胱肌張力下降。口服GE可提高pBOO大鼠膀胱梗阻性低順應性和膀胱肌張力,降低膀胱重量。這提示我們GE可能通過抑制細胞外基質(zhì)蛋白沉積改善膀胱功能。

氧化應激產(chǎn)生的活性氧會損傷膀胱組織,激活Nrf2通路可以通過促進抗氧化基因HO-1、谷胱甘肽還原酶和SOD表達來改善膀胱功能障礙[16-17]。研究[18]發(fā)現(xiàn),Nrf2過表達通過抑制炎癥細胞募集發(fā)揮抗炎作用。因此,我們首先研究了GE在pBOO大鼠膀胱中的抗氧化活性。結果表明,GE治療后顯著逆轉(zhuǎn)了pBOO大鼠中MDA含量及GSH-Px和SOD活性;同時,GE還促進了Nrf2和HO-1蛋白表達,這與預測結果和其他文獻[19-20]報道相似。綜上,GE可能通過激活Nrf2增加pBOO大鼠的抗氧化酶活性來緩解氧化應激。

pBOO產(chǎn)生的異常膀胱內(nèi)壓觸發(fā)了從慢性炎癥到纖維化的進展,從而導致膀胱結構和功能改變。Sezginer等[7]發(fā)現(xiàn),pBOO可以導致NF-κB易位進入細胞核,引起炎性反應。Yucel 等[21]表明NF-κB抑制劑可以保護膀胱抵抗氧化應激。Chen等[9]檢測了繼發(fā)于pBOO的膀胱中細胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的表達,發(fā)現(xiàn)pBOO膀胱中IL-6、IL-1β和TNF-α在mRNA和蛋白水平上均顯著上調(diào)。因此,抑制NF-κB活性降低炎性因子含量可抵抗pBOO中氧化損傷。我們的結果表明,口服GE可以降低pBOO模型大鼠膀胱組織炎性細胞浸潤和細胞因子含量。這提示我們,GE的抗炎作用也可能有助于通過長期治療緩解膀胱纖維化。

綜上,口服GE在pBOO模型中顯著改善膀胱功能障礙,這可能與激活Nrf2通路,抑制pBOO大鼠膀胱組織中氧化應激和炎性反應相關。GE作為潛在的抑制膀胱炎癥和氧化應激緩解膀胱功能障礙的候選藥物,未來還需要更多的臨床前試驗來驗證GE對膀胱功能障礙和膀胱纖維化的影響。