沉默miR-6771-3p通過(guò)靶向AXIN2/Wnt信號(hào)通路調(diào)控異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)研究

孫利娟,黃香平,張多多,張小雪,陸曉媛

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,江蘇 徐州 221004;2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科,江蘇 徐州 221004;3.華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院婦科,湖北 武漢 430030)

子宮內(nèi)膜異位癥是一種激素依賴性婦科疾病,表現(xiàn)為原子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖并遷移到子宮腔以外的區(qū)域,多好發(fā)于育齡期婦女[1-2]。已有研究[3]表明,子宮內(nèi)膜異位癥患者罹患其他疾病如風(fēng)濕病、卵巢癌、哮喘、不孕癥等的概率更高,危害女性健康。然而,子宮內(nèi)膜異位癥的確切機(jī)制尚未明確。目前研究[4]顯示,子宮內(nèi)膜細(xì)胞的高增殖性和遷移性在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。微小RNA(miRNA)是一種經(jīng)典的非編碼RNA,參與自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病和呼吸系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。既往研究[6]證實(shí),miRNA能夠激活或抑制多種信號(hào)通路,負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞的遷移、凋亡、增殖、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)行為。miRNA的異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和遷移之間存在相關(guān)性,恢復(fù)miRNA表達(dá)對(duì)改善子宮內(nèi)膜異位癥患者的預(yù)后可能具有重要作用[7-9]。miR-6771-3p是一個(gè)長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的miRNA,其基因定位于人染色體16q12.1,是影響卵巢癌化療耐藥性的決定性因素[10]。然而,miR-6771-3p在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究探討了miR-6771-3p在子宮內(nèi)膜異位組織中的表達(dá),分析其對(duì)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用和分子機(jī)制,以期miR-6771-3p靶向治療子宮內(nèi)膜異位癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 收集2020年6月至2022年9月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行“卵巢囊腫剝除術(shù)”,取得在位子宮內(nèi)膜組織和異位組織34例,均經(jīng)兩名以上病理科專家診斷為子宮內(nèi)膜異位癥?；颊吣挲g19～41歲,所有患者月經(jīng)規(guī)律,沒(méi)有其他生殖器官疾病,至少在5個(gè)月內(nèi)沒(méi)有經(jīng)過(guò)激素類藥物治療。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。胎牛血清、Lipofectamine 3000和引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。miR-6771-3p mimic和miR-NC mimic購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司。靶向沉默miR-6771-3p的短發(fā)夾RNA載體和對(duì)照載體購(gòu)自美國(guó)Corning公司。四噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒、軸抑制蛋白2(AXIN2)野生型載體(AXIN2-WT)和AXIN2突變型載體(AXIN2-MUT)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。一抗AXIN2、α-Tubulin、β-catenin、c-Myc、p-GSK3、Cyclin D1和山羊抗鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 細(xì)胞原代培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將術(shù)中得到的新鮮異位子宮內(nèi)膜組織采用磷酸鹽緩沖液沖洗4次,在細(xì)胞間內(nèi)剪碎組織,通過(guò)膠原酶消化20 min,取上清與含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混合終止消化,離心去上清,接種到新的培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),12 h后細(xì)胞換液。當(dāng)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,將細(xì)胞分為空載體組和沉默組,空載體組轉(zhuǎn)染對(duì)照載體,沉默組轉(zhuǎn)染靶向沉默miR-6771-3p的短發(fā)夾RNA載體,使用Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將狀態(tài)良好的異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)miR-6771-3p和AXIN2 mRNA表達(dá) 加入1 ml 預(yù)冷Trizol處理組織和細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)核糖核酸。miR-6771-3p上游引物為 5’-CTGCGGGTAGACAGGGGTTTG-3’,下游引物為5’-GACATTCACCACTGCCGTCTC-3’;GAPDH上游引物為 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’,下游引物為5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’;AXIN2上游引物為 5’-AGCCAAAGCGATCTACAAAAGG-3’,下游引物為5’-AAGTCAAAAACATCTGGTAGGCA-3’。RT-qPCR反應(yīng)條件:96 ℃預(yù)變性3 min;96 ℃變性45 s;63 ℃ 36 s,71 ℃ 36 s,32個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-6771-3p和AXIN2 mRNA表達(dá),以GAPDH和U6分別為內(nèi)參。

1.5 MTT檢測(cè)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖 將轉(zhuǎn)染后的異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞以6×103個(gè)/孔接種于96孔板,連續(xù)5 d在同一時(shí)間點(diǎn),加入40 μl MTT試劑,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱反應(yīng)5 h。去上清,加入160 μl二甲基亞砜,均勻振蕩20 min。在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定每一個(gè)孔在450 nm波長(zhǎng)的吸光度(OD)值。

1.6 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的遷移 將轉(zhuǎn)染后的異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞接種于12孔板,保證單層細(xì)胞鋪滿,去上清,采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗板底表面4次。采用200 μl槍頭尖端在板底表面垂直劃痕,采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗板底表面4次。加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。分別在0 h與24 h采用倒置顯微鏡照相,分別測(cè)量?jī)蓚€(gè)時(shí)間點(diǎn)的劃痕間距,比較各組細(xì)胞的遷移率。

1.7 生物信息學(xué)技術(shù)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系 采用miR Sponge軟件預(yù)測(cè)miR-6771-3p具有結(jié)合位點(diǎn)的靶基因mRNA。收集生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,在24孔板孵育24 h。分別將2 μl AXIN2野生型載體(AXIN2-WT)或AXIN2突變型載體(AXIN2-MUT)與miR-6771-3p mimic或miR-NC mimic共轉(zhuǎn)染異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育46 h,采用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒裂解異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞并分析熒光素酶的相對(duì)活性。

1.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中AXIN2蛋白和Wnt信號(hào)通路蛋白的表達(dá) 加入160 μl RIPA裂解液處理轉(zhuǎn)染后的異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,40 min后離心得到上清,經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,在4 ℃聚轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。在9%脫脂牛奶中進(jìn)行封閉50 min。將膜與一抗AXIN2(1∶3000稀釋)、α-Tubulin(1∶4000稀釋)、Cyclin D1(1∶3000稀釋)、β-catenin(1∶2000稀釋)、c-Myc(1∶2000稀釋)、p-GSK3(1∶1000稀釋)在5 ℃孵育過(guò)夜。與對(duì)應(yīng)山羊抗鼠二抗在37 ℃孵育125 min,選擇α-Tubulin為內(nèi)參,在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。

2 結(jié) 果

2.1 子宮在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織中miR-6771-3p表達(dá)比較 RT-qPCR檢測(cè)顯示,子宮在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織中miR-6771-3p表達(dá)分別為(1.15±0.13)和(4.02±0.24),子宮異位內(nèi)膜組織中miR-6771-3p的表達(dá)高于子宮在位內(nèi)膜組織(P<0.01)。

2.2 短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)染對(duì)miR-6771-3p表達(dá)水平的影響 RT-qPCR檢測(cè)顯示,沉默組和空載體組異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中miR-6771-3p分別為(0.97±0.39)和(4.51±1.64),沉默組明顯低于空載體組(P<0.01)。

2.3 沉默組和空載體組異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖情況比較 通過(guò)MTT法分析顯示(圖1),在第2、3、4、5天,沉默miR-6771-3p的沉默組異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞活力低于空載體組(均P<0.05)。

注:與空載體組相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 沉默組和空載體組異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖情況比較

2.4 沉默組和空載體組異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞遷移情況比較 通過(guò)細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)分析顯示,沉默組和空載體組異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞遷移率分別為(16.36±4.38)%和(55.38±7.12)%,沉默組異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞遷移率明顯低于空載體組(P<0.01)。

2.5 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-6771-3p的靶基因 采用miR Sponge軟件預(yù)測(cè)顯示(圖2),miR-6771-3p與AXIN2 mRNA具有結(jié)合位點(diǎn),AXIN2野生型載體位點(diǎn)(GGGUUU)突變?yōu)锳XIN2突變型載體(CCCAAA)。

圖2 miR-6771-3p與AXIN2 mRNA的結(jié)合位點(diǎn)

2.6 miR-6771-3p與AXIN2 mRNA的相互關(guān)系 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)(圖3),與AXIN2-WT+miR-NC mimic共轉(zhuǎn)染相比,AXIN2-WT+miR-6771-3p mimic明顯降低了異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性(P<0.01)。

注:與miR-NC比較,**P<0.01圖3 miR-6771-3p與AXIN2 mRNA的相互關(guān)系

2.7 沉默miR-6771-3p對(duì)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中AXIN2 mRNA表達(dá)的影響 RT-qPCR檢測(cè)顯示,沉默組和空載體組異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中AXIN2 mRNA表達(dá)分別為(7.87±1.26)和(1.01±0.42),沉默組AXIN2 mRNA表達(dá)顯著高于空載體組(P<0.01)。

2.8 沉默miR-6771-3p對(duì)AXIN2蛋白和Wnt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)顯示(圖4),與空載體組相比,沉默miR-6771-3p后AXIN2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01),細(xì)胞Wnt信號(hào)通路蛋白β-catenin、c-Myc、p-GSK3、Cyclin D1表達(dá)明顯降低(均P<0.01)。

注:與空載體組比較,**P<0.01圖4 沉默miR-6771-3p對(duì)AXIN2蛋白和Wnt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥是常見(jiàn)的婦科疾病之一,一般采用手術(shù)和激素治療,患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)很高[11-13]。因此,尋找潛在的分子治療靶點(diǎn)可能有助于改善子宮內(nèi)膜異位癥的預(yù)后。最近研究[14-16]表明,miRNA參與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和遷移過(guò)程,可以作為子宮內(nèi)膜異位癥的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。例如,在位子宮內(nèi)膜組織中miR-126表達(dá)高于異位子宮內(nèi)膜組織,miR-126可通過(guò)有效抑制異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲,減緩子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展[17]。又如,miR-141-5p在異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平顯著低于在位子宮內(nèi)膜組織,其通過(guò)抑制異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和增殖,降低子宮內(nèi)膜異位癥的病灶大小[18]。既往研究[10]發(fā)現(xiàn),miR-6771-3p在卵巢癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá),參與調(diào)控卵巢癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性。然而,miR-6771-3p在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用和生物學(xué)機(jī)制尚未被報(bào)道研究。

本研究通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在34例子宮異位內(nèi)膜組織中miR-6771-3p表達(dá)明顯高于在位內(nèi)膜組織,這表明miR-6771-3p可能是子宮內(nèi)膜異位癥的促進(jìn)因子。為進(jìn)一步確定其在子宮內(nèi)膜異位癥中的功能,本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),沉默miR-6771-3p可明顯抑制異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移,這說(shuō)明靶向沉默miR-6771-3p對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病可能具有改善功能。miRNA主要通過(guò)靶向結(jié)合靶基因3’非翻譯區(qū),特異性降低靶基因的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為[19-21]。本研究通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí),miR-6771-3p靶向結(jié)合AXIN2 mRNA。AXIN2蛋白是經(jīng)典分子通路Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子,其在細(xì)胞的分化、發(fā)育、遷移和增殖等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[22]。研究[23]表明,AXIN2蛋白能夠有效抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中AXIN2蛋白表達(dá)明顯小于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。AXIN2蛋白通過(guò)磷酸化β-catenin蛋白,加速其被泛蛋白酶降解,有效抑制β-catenin蛋白的表達(dá),從而干擾Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。因此,AXIN2蛋白能夠通過(guò)干擾Wnt信號(hào)通路,抑制子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。在本研究中,沉默miR-6771-3p表達(dá),降低了異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中AXIN2基因水平,阻滯Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述,miR-6771-3p在子宮異位內(nèi)膜組織中高表達(dá),沉默miR-6771-3p可以靶向上調(diào)AXIN2基因表達(dá)并且降低Wnt信號(hào)通路活性,抑制異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移。miR-6771-3p可能是子宮內(nèi)膜異位癥治療的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。