液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定徽州毛豆腐中18 種氨基酸

郝玉玲，盛新穎*，武文文，徐雅芫，程江華，張 雷

（1.安徽科博產(chǎn)品檢測研究院有限公司，安徽合肥 230001；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽合肥 230031；3.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230021)

徽州毛豆腐因其長毛和口感獨特等特征，成為我國著名的素食佳肴。豆腐經(jīng)過特殊處理，在獨特的環(huán)境條件下進行發(fā)酵處理，表面會長出一層白灰色絨毛狀菌絲，在豆腐的發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)被分解成各種不同的氨基酸，并因此形成了獨特的風(fēng)味，食后味道鮮醇爽口、芬芳誘人、軟糯鮮美，是中國徽菜中最具地方特色傳統(tǒng)風(fēng)味菜肴之一[1]。毛豆腐的主要原材料為大豆，大豆具有很高且全面的營養(yǎng)素[2-4]。發(fā)酵豆制品隨著有益菌種的增加，不僅產(chǎn)生了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也具備了許多生理功能效果[5]，研究表明發(fā)酵豆制品具有抗癌、溶解血栓、降血壓、抗氧化、抗菌等生理功能[6]。

在大豆發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下水解為多肽，小分子肽鏈水解為游離氨基酸，它的生成大大提高了蛋白質(zhì)的消化率[7]，更有利于人體對蛋白質(zhì)的消化、吸收和利用。氨基酸不但營養(yǎng)價值高[8]，也是重要的呈味物質(zhì)，是發(fā)酵豆制品獨特風(fēng)味形成的因素[9]。其中，天冬氨酸和谷氨酸是重要的鮮味物質(zhì)，而亮氨酸和異亮氨酸則是苦味氨基酸，甘氨酸和色氨酸則是很好的甜味氨基酸[10-11]。目前有關(guān)氨基酸檢測方法較多，然而傳統(tǒng)的衍生化法等存在分析檢測限高以及測定速度慢等缺點，使其在氨基酸檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用受到了較大限制[12]。因此，建立快速、準確和重現(xiàn)性好的測定氨基酸的方法具有重要的實用意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

徽州毛豆腐樣品由安徽省某科研院所提供。氨基酸的標準品：18 種氨基酸混標溶液，其中胱氨酸為1.25 μmol·L-1，其他17 種均為2.5 μmol·L-1，天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，LC-MS 島津（中國）有限公司；實驗室純水系統(tǒng)（Medium-S300），上海和泰儀器有限公司；垂直多用振蕩器（HY-1A），金壇市金城國勝實驗儀器廠；多管渦旋混勻器（MIX-200），拓赫機電科技（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

采用Discovery HS F5-3（150 mm×2.1 mm，3 μm）色譜柱，柱溫為35 ℃，流速為0.3 mL·min-1，進樣量為2 μL，洗脫時間為10.5 min，流動相A 為0.1%甲酸-水，流動相B 為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫過程流動相的比例變化

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子（ESI）源，正電離模式；干燥氣溫度：400 ℃；干燥氣流速：10 L·min-1；霧化氣流量：3 L·min-1；反應(yīng)模式：MRM；離子對、碰撞能量見表2。

1.3.3 標準溶液的制備

（1）混合氨基酸標準中間液配制。準確吸取1.0 mL 的18 種混合氨基酸標準儲備液于10 mL 容量瓶中，用0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋并定容至刻度，混勻，其中胱氨酸的質(zhì)量濃度為125 nmol·mL-1，其余的17 種混合氨基酸標準溶液，配制質(zhì)量濃度均為250 nmol·mL-1。

（2）混合氨基酸標準工作溶液配制。準確吸取1.0 mL 的18 種混合氨基酸標準中間液于10 mL 容量瓶中，用50%乙腈溶液稀釋并定容至刻度，混勻后即得第一份標準溶液，隨后用50%乙腈溶液逐級稀釋，制成共7 個不同濃度的系列混合標準工作溶液，質(zhì)量濃度分別為0.1 nmol·mL-1、0.2 nmol·mL-1、0.5 nmol·mL-1、0.8 nmol·mL-1、1.0 nmol·mL-1、1.5 nmol·mL-1、2.0 nmol·mL-1，其中胱氨酸的質(zhì)量濃度分別為0.05 nmol·mL-1、0.10 nmol·mL-1、0.25 nmol·mL-1、0.40 nmol·mL-1、0.50 nmol·mL-1、0.75 nmol·mL-1、1.0 nmol·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 樣品氨基酸提取制備

參照方法GB/T 30987—2020[13]，根據(jù)樣品特點加以改進和優(yōu)化，稱取2.0 g 徽州毛豆腐樣品（精確至0.01 g）于250 mL 錐形瓶中，加入200 mL 沸水浸提，95 ℃水浴加熱，每隔5 min 混勻一次，10 min后取出，趁熱抽濾，濾液冷卻至室溫后，用水定容至250 mL，混勻后移取1 mL 提取液于10 mL 容量瓶中，用50%乙腈溶液稀釋并至刻度混勻，取2 mL 稀釋液于5 000 r·min-1下離心10 min，取上清液過0.45 μm水相濾膜，待測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸的色譜圖

18 種氨基酸的色譜圖見圖1，各氨基酸按照出峰順序依次為1 胱氨酸（1.370 min）、2 絲氨酸（1.412 min）、3 天冬氨酸（1.415 min）、4 甘氨酸（1.448 min）、5 蘇氨酸（1.559 min）、6 丙氨酸（1.640 min）、7 谷氨酸（1.644 min）、8 賴氨酸（1.977 min）、9 脯氨酸（1.980 min）、10 組氨酸（2.032 min）、11 精氨酸（2.334 min）、12 纈氨酸（3.707 min）、13 蛋氨酸（4.163 min）、14 酪氨酸（5.189 min）、15 異亮氨酸（5.608 min）、16 亮氨酸（5.808 min）、17 苯丙氨酸（6.190 min）、18 色氨酸（7.693 min）。

圖1 18 種氨基酸的色譜圖

2.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

使用初始流動相將混合標準溶液稀釋，形成不同質(zhì)量濃度的標準溶液，然后再進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。以標準工作液質(zhì)量為橫坐標，以各氨基酸峰面積為縱坐標制作標準曲線，見表3，各分析物的標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2均＞0.995，線性相關(guān)性較好；取混合標準溶液用50%乙腈水溶液稀釋后測定，以3 倍信噪比作為方法的檢出限，以10 倍信噪比作為方法的定量限，獲得目標物的檢出限和定量限[14]，本方法18 種氨基酸的檢出限為2.44 ～6.36 μg·kg-1，定量限為8.05 ～20.99 μg·kg-1。

表3 18 種游離氨基酸的線性范圍和線性關(guān)系

2.3 回收率和精密度

取一組徽州毛豆腐中樣品，先用本試驗建立的方法測定其18 種氨基酸的含量，再向該樣品中添加量為20 mg·kg-1的氨基酸混合標準溶液，扣除樣品空白試驗的各氨基酸含量，求得各氨基酸的加標回收率。由表4 可知，加標回收率在83.60%～101.20%，相對標準偏差在0.27%～2.61%。

表4 18 種氨基酸的回收率及方法精密度

2.4 實際樣品中氨基酸的檢測

采用本方法對6 批次不同發(fā)酵時期的徽州毛豆腐中的18 種氨基酸含量進行測定，由表5 可知，徽州毛豆腐樣品中均檢測到了18 種氨基酸，主要氨基酸是精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等，發(fā)酵時間對游離氨基酸含量影響較大[15]。研究表明，發(fā)酵豆制品中的咸、鮮特征滋味主要來源于氨基酸及短肽，如谷氨酸與氯化鈉協(xié)同作用可提升鮮味[16-17]，部分短肽如丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸對發(fā)酵豆制品有提鮮作用[18]，因此快速檢測徽州毛豆腐中的18 種氨基酸對于毛豆腐的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

表5 徽州毛豆腐發(fā)酵過程中氨基酸含量測定

3 結(jié)論與討論

實驗使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定毛豆腐中的氨基酸，結(jié)果顯示，此方法檢測時間較短（10.5 min），檢出濃度更低，檢出限為2.44 ～6.36 μg·kg-1，定量限為8.05 ～20.99 μg·kg-1，18 種游離氨基酸的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，加標回收率在83.60%～101.20%，相對標準偏差在0.27%～2.61%，本方法適用于徽州毛豆腐等發(fā)酵豆制品中18 種氨基酸含量的檢測。

利用新建方法提取簡單、快速和準確的優(yōu)勢對6批次毛豆腐進行檢測，發(fā)現(xiàn)樣品中均檢測到了18 種氨基酸，其含量隨著發(fā)酵時間延長而增加。該方法還可作為醬油、豆醬、腐乳等其他發(fā)酵食品中氨基酸的檢測，具有較好的實用性。