5 種致瀉大腸埃希氏菌不同濃度下的國標法檢出率分析

胡春紅，陸其聰

（四川省輕工業(yè)研究設(shè)計院有限公司，四川成都 610081）

致瀉大腸埃希氏菌是一類重要的食源性病原體，是引起腸道疾病相關(guān)的食源性疾病的主要病原菌，可導致人或動物腹瀉、腹痛甚至出血性腹瀉[1-2]。常見的引起人類發(fā)病的致瀉大腸埃希氏菌有5 種，包括腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌（或稱為腸出血性大腸埃希氏菌）與腸道聚集性大腸埃希氏菌[3-4]。致瀉大腸埃希氏菌存在于人和動物的腸道中，人群普遍易感，會引起急性胃炎、急性菌痢、出血性腸炎等多種疾病，傳播方式多種多樣，包括飲用水、食物、日常生活用品、蚊蠅昆蟲傳播等[5]。

《食品安全國家標準 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[6]規(guī)定肉制品（僅適用于牛肉制品、即食生肉制品、發(fā)酵肉制品類）、即食果蔬制品（僅適用于去皮或預(yù)切的水果及上述類別混合食品）中，致瀉大腸埃希氏菌不得檢出。此類食品易受食品從業(yè)人員和食材本身的微生物污染，且一旦污染，微生物繁殖速度較快。在對食品從業(yè)人員和公共場所從業(yè)人員進行衛(wèi)生檢測時，致瀉大腸埃希氏菌的檢出率明顯高于沙門氏菌和志賀氏菌[7]。近年來，致瀉性大腸埃希氏菌在急性腹瀉糞標本中的檢出率有所增加[8-9]。致瀉性大腸埃希氏菌引起的食品安全問題對人類健康和社會經(jīng)濟造成了嚴重的影響[10]。食品中致瀉大腸埃希氏菌的檢測是預(yù)防和控制由該菌引起的食源性疾病的關(guān)鍵[11]。近年來，大多學者致力于研究致瀉大腸埃希氏菌的致病機制和分子生物技術(shù)，而對標準中樣品前處理方法的研究較少，有文獻中寫明當進行陽性對照時，染菌量應(yīng)控制在每25 g 樣品中含10 ～100 CFU 活菌，但對選擇此濃度的原因沒有提及[12]。本次實驗主要研究采用《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》（GB 4789.6—2016）（以下簡稱國標法）檢測時染菌量的范圍，以及在較低染菌量時是否能檢出病原菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準菌株： 產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌ETEC（CICC24190）、 腸道侵襲性大腸埃希菌EIEC（CICC24188）、 腸道致病性大腸埃希菌EPEC（CICC24189）、腸道集聚性大腸埃希菌EAEC（CICC24186）、 腸出血性大腸埃希菌EHEC（CICC24187），均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion，BHI）、營養(yǎng)肉湯、腸道增菌肉湯、麥康凱瓊脂（MacConkey Agar，MAC）、 伊紅美藍瓊脂（Eosin-Methylene Blue，EMB），均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；Bio-II-Advance4 生物安全柜，Telstar；微量移液槍（10 ～100 μL、100 ～1 000 μL），eppendorf。

1.3 實驗方法

1.3.1 前增菌

將5 種致瀉大腸埃希氏菌標準菌株分別接種于BHI，（36±1）℃培養(yǎng)18 h。用無菌磷酸鹽緩沖液將5 種致瀉大腸埃希氏菌的菌液濃度稀釋至1 ～3 CFU·mL-1、10 ～30 CFU·mL-1、100 ～300 CFU·mL-1，視為樣品原液。分別取上述3 種濃度的樣品原液1 mL 加于250 mL 營養(yǎng)肉湯中，于（36±1） ℃培養(yǎng)6 h 后，取預(yù)增菌液接種于30 mL腸道增菌肉湯管中，接種體積為10 μL、50 μL、100 μL、500 μL、1 000 μL，每個體積接種10 管，于（42±1）℃培養(yǎng)18 h。

1.3.2 分離培養(yǎng)

將增菌液分別劃線于EMB 和MAC 平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄平板上的菌落生長情況。在MAC 瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色；在EMB 瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色，有典型菌落生長即視為檢出。因本次實驗中只加入標準菌株，所用耗材、培養(yǎng)基均按規(guī)定要求滅菌處理，沒有雜菌干擾，故不再進行后續(xù)生化鑒定和PCR 確證實驗。實驗重復1 次。

2 結(jié)果與分析

兩次實驗結(jié)果中5 種致瀉大腸埃希氏菌接種量為10 ～30 CFU 和100 ～300 CFU 時，二次增菌的接種體積在10 μL、50 μL、100 μL、500 μL、1 000 μL 時均能檢出。因此，當其接種量大于10 CFU 時，按國標法二次增菌取10 μL 的接種量均能檢出。5 種致瀉大腸埃希氏菌接種量為1 ～3 CFU 時，二次增菌時的接種體積只在500 μL、1 000 μL 時能全部檢出，檢出率為100%。5 種致瀉大腸埃希氏菌接種量為1 ～3 CFU，接種體積為10 μL、50 μL、100 μL 的檢出結(jié)果見表1，二次增菌時取10 μL 或50 μL 預(yù)增菌液至腸道增菌肉湯中，其平均檢出率均不能達到100%；二次增菌接種體積增加到100 μL時，EAEC（CICC24186）、EHEC（CICC24187）、ETEC（CICC24190）的檢出率能達到100%，而EIEC（CICC24188）、EPEC（CICC24189）的檢出率仍不能達到100%。由此，當所檢樣品中致瀉大腸埃希氏菌含量較低時，采用國標中規(guī)定的取10 μL預(yù)增菌液接種于腸道增菌肉湯中進行二次增菌，漏檢可能性較大。

表1 5 種致瀉大腸埃希氏菌不同接種體積下的檢出率

3 結(jié)論與討論

國標中預(yù)增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯（用于一般細菌培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種、復壯、增菌等）無選擇性，其預(yù)增菌時間6 h 較短，有利于目標菌的篩選，二次增菌培養(yǎng)基為腸道增菌肉湯（用于腸道菌的增菌培養(yǎng)，可以抑制非腸桿菌科細菌的生長），增菌時間18 h 較長，可以修復有損傷的目標菌，但也可能導致雜菌過多，不利于目標菌檢出[13]。二次增菌取樣量只取10 μL 也可能是基于為增加目標菌檢出率的考慮，但當檢測樣品中致瀉大腸埃希氏菌的含量比較低時，二次增菌取10 μL 的接種體積存在漏檢可能。此次實驗中只考慮了接種標準菌株時的檢出率，而實際樣品中可能包含若干種其他微生物，各種微生物在檢測過程中都會繁衍增殖，其實際檢出率受其他微生物影響可能會更低。因此，在實際檢測工作中，在所檢樣品中微生物含量較低時，可考慮增加二次增菌的接種量，減少漏檢可能。在實際檢測工作中，由于樣品中多種微生物的干擾，還需要進行后續(xù)生化鑒定和PCR 確證實驗才能判定。