5 種致瀉大腸埃希氏菌不同濃度下的國(guó)標(biāo)法檢出率分析

胡春紅，陸其聰

（四川省輕工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司，四川成都 610081）

致瀉大腸埃希氏菌是一類重要的食源性病原體，是引起腸道疾病相關(guān)的食源性疾病的主要病原菌，可導(dǎo)致人或動(dòng)物腹瀉、腹痛甚至出血性腹瀉[1-2]。常見(jiàn)的引起人類發(fā)病的致瀉大腸埃希氏菌有5 種，包括腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌（或稱為腸出血性大腸埃希氏菌）與腸道聚集性大腸埃希氏菌[3-4]。致瀉大腸埃希氏菌存在于人和動(dòng)物的腸道中，人群普遍易感，會(huì)引起急性胃炎、急性菌痢、出血性腸炎等多種疾病，傳播方式多種多樣，包括飲用水、食物、日常生活用品、蚊蠅昆蟲(chóng)傳播等[5]。

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[6]規(guī)定肉制品（僅適用于牛肉制品、即食生肉制品、發(fā)酵肉制品類）、即食果蔬制品（僅適用于去皮或預(yù)切的水果及上述類別混合食品）中，致瀉大腸埃希氏菌不得檢出。此類食品易受食品從業(yè)人員和食材本身的微生物污染，且一旦污染，微生物繁殖速度較快。在對(duì)食品從業(yè)人員和公共場(chǎng)所從業(yè)人員進(jìn)行衛(wèi)生檢測(cè)時(shí)，致瀉大腸埃希氏菌的檢出率明顯高于沙門(mén)氏菌和志賀氏菌[7]。近年來(lái)，致瀉性大腸埃希氏菌在急性腹瀉糞標(biāo)本中的檢出率有所增加[8-9]。致瀉性大腸埃希氏菌引起的食品安全問(wèn)題對(duì)人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重的影響[10]。食品中致瀉大腸埃希氏菌的檢測(cè)是預(yù)防和控制由該菌引起的食源性疾病的關(guān)鍵[11]。近年來(lái)，大多學(xué)者致力于研究致瀉大腸埃希氏菌的致病機(jī)制和分子生物技術(shù)，而對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中樣品前處理方法的研究較少，有文獻(xiàn)中寫(xiě)明當(dāng)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，染菌量應(yīng)控制在每25 g 樣品中含10 ～100 CFU 活菌，但對(duì)選擇此濃度的原因沒(méi)有提及[12]。本次實(shí)驗(yàn)主要研究采用《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.6—2016）（以下簡(jiǎn)稱國(guó)標(biāo)法）檢測(cè)時(shí)染菌量的范圍，以及在較低染菌量時(shí)是否能檢出病原菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)菌株： 產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌ETEC（CICC24190）、 腸道侵襲性大腸埃希菌EIEC（CICC24188）、 腸道致病性大腸埃希菌EPEC（CICC24189）、腸道集聚性大腸埃希菌EAEC（CICC24186）、 腸出血性大腸埃希菌EHEC（CICC24187），均購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion，BHI）、營(yíng)養(yǎng)肉湯、腸道增菌肉湯、麥康凱瓊脂（MacConkey Agar，MAC）、 伊紅美藍(lán)瓊脂（Eosin-Methylene Blue，EMB），均購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Bio-II-Advance4 生物安全柜，Telstar；微量移液槍（10 ～100 μL、100 ～1 000 μL），eppendorf。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 前增菌

將5 種致瀉大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于BHI，（36±1）℃培養(yǎng)18 h。用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液將5 種致瀉大腸埃希氏菌的菌液濃度稀釋至1 ～3 CFU·mL-1、10 ～30 CFU·mL-1、100 ～300 CFU·mL-1，視為樣品原液。分別取上述3 種濃度的樣品原液1 mL 加于250 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于（36±1） ℃培養(yǎng)6 h 后，取預(yù)增菌液接種于30 mL腸道增菌肉湯管中，接種體積為10 μL、50 μL、100 μL、500 μL、1 000 μL，每個(gè)體積接種10 管，于（42±1）℃培養(yǎng)18 h。

1.3.2 分離培養(yǎng)

將增菌液分別劃線于EMB 和MAC 平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄平板上的菌落生長(zhǎng)情況。在MAC 瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色，不分解乳糖的菌落為無(wú)色或淡粉色；在EMB 瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤，不分解乳糖的菌落為無(wú)色或淡粉色，有典型菌落生長(zhǎng)即視為檢出。因本次實(shí)驗(yàn)中只加入標(biāo)準(zhǔn)菌株，所用耗材、培養(yǎng)基均按規(guī)定要求滅菌處理，沒(méi)有雜菌干擾，故不再進(jìn)行后續(xù)生化鑒定和PCR 確證實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)1 次。

2 結(jié)果與分析

兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中5 種致瀉大腸埃希氏菌接種量為10 ～30 CFU 和100 ～300 CFU 時(shí)，二次增菌的接種體積在10 μL、50 μL、100 μL、500 μL、1 000 μL 時(shí)均能檢出。因此，當(dāng)其接種量大于10 CFU 時(shí)，按國(guó)標(biāo)法二次增菌取10 μL 的接種量均能檢出。5 種致瀉大腸埃希氏菌接種量為1 ～3 CFU 時(shí)，二次增菌時(shí)的接種體積只在500 μL、1 000 μL 時(shí)能全部檢出，檢出率為100%。5 種致瀉大腸埃希氏菌接種量為1 ～3 CFU，接種體積為10 μL、50 μL、100 μL 的檢出結(jié)果見(jiàn)表1，二次增菌時(shí)取10 μL 或50 μL 預(yù)增菌液至腸道增菌肉湯中，其平均檢出率均不能達(dá)到100%；二次增菌接種體積增加到100 μL時(shí)，EAEC（CICC24186）、EHEC（CICC24187）、ETEC（CICC24190）的檢出率能達(dá)到100%，而EIEC（CICC24188）、EPEC（CICC24189）的檢出率仍不能達(dá)到100%。由此，當(dāng)所檢樣品中致瀉大腸埃希氏菌含量較低時(shí)，采用國(guó)標(biāo)中規(guī)定的取10 μL預(yù)增菌液接種于腸道增菌肉湯中進(jìn)行二次增菌，漏檢可能性較大。

表1 5 種致瀉大腸埃希氏菌不同接種體積下的檢出率

3 結(jié)論與討論

國(guó)標(biāo)中預(yù)增菌培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯（用于一般細(xì)菌培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種、復(fù)壯、增菌等）無(wú)選擇性，其預(yù)增菌時(shí)間6 h 較短，有利于目標(biāo)菌的篩選，二次增菌培養(yǎng)基為腸道增菌肉湯（用于腸道菌的增菌培養(yǎng)，可以抑制非腸桿菌科細(xì)菌的生長(zhǎng)），增菌時(shí)間18 h 較長(zhǎng)，可以修復(fù)有損傷的目標(biāo)菌，但也可能導(dǎo)致雜菌過(guò)多，不利于目標(biāo)菌檢出[13]。二次增菌取樣量只取10 μL 也可能是基于為增加目標(biāo)菌檢出率的考慮，但當(dāng)檢測(cè)樣品中致瀉大腸埃希氏菌的含量比較低時(shí)，二次增菌取10 μL 的接種體積存在漏檢可能。此次實(shí)驗(yàn)中只考慮了接種標(biāo)準(zhǔn)菌株時(shí)的檢出率，而實(shí)際樣品中可能包含若干種其他微生物，各種微生物在檢測(cè)過(guò)程中都會(huì)繁衍增殖，其實(shí)際檢出率受其他微生物影響可能會(huì)更低。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，在所檢樣品中微生物含量較低時(shí)，可考慮增加二次增菌的接種量，減少漏檢可能。在實(shí)際檢測(cè)工作中，由于樣品中多種微生物的干擾，還需要進(jìn)行后續(xù)生化鑒定和PCR 確證實(shí)驗(yàn)才能判定。