空腹血清果糖暴露對(duì)老年人群骨代謝細(xì)胞因子的影響

蘇威武, 劉效成, 覃心如, 王穆,

1.長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)疾病預(yù)防控制中心,湖南長(zhǎng)沙 410013;2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院臨床研究所,湖南衡陽 421002;3.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,湖南衡陽 421001

自1967年引入高果糖玉米糖漿(high fructose corn syrup,HFCS)以來,果糖的消費(fèi)量迅速增加[1-5]。果糖攝入對(duì)骨骼健康的影響日益受到重視[6-8]。但目前在人群水平上的研究甚少。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了老年果糖暴露人群和非暴露對(duì)照人群血清13種骨代謝細(xì)胞因子的含量,包括骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、血小板衍生因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、肝/骨/腎堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)、抗酒石酸酸性磷酸酶5(tartaric acid resistant acid phosphatase 5,ACP5)、瘦素(leptin)、核因子-κB受體活化因子配體(nuclear factor-κB receptor activating factor ligand,RANKL)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)、IL-1β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和dickkopf WNT信號(hào)通路抑制劑-1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1,DKK-1),并分析兩組人群中這些骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子的差異,以期為老年人群骨代謝相關(guān)疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

骨代謝流式多因子檢測(cè)試劑盒購自美國LEGENDplexTM公司(Cat.No.741360);果糖檢測(cè)試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司(Cat.No.G20221010H);雙激光6色流式細(xì)胞儀購自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司(型號(hào):EXFLOW-206-0016)。

1.2 人群的選擇

課題組前期對(duì)湖南省衡陽市某社區(qū)約2 000人空腹血清進(jìn)行了果糖檢測(cè)。從中隨機(jī)抽取37名果糖高暴露老年人及37名未檢出血清果糖且嚴(yán)格匹配年齡和性別的老年人為本研究的對(duì)象,并檢測(cè)兩組研究對(duì)象血清13個(gè)骨代謝細(xì)胞因子的含量。所有研究對(duì)象均填寫了知情同意書。本研究方案經(jīng)南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào)2022-KY-167)。所有試驗(yàn)根據(jù)《赫爾辛基宣言》或其他相關(guān)指南和法規(guī)的原則進(jìn)行。

1.3 血清果糖檢測(cè)

采用微板法檢測(cè)晨起空腹血清果糖質(zhì)量濃度。主要原理:果糖經(jīng)特異性酶的作用后轉(zhuǎn)化為葡糖糖,葡萄糖在己糖激酶等酶復(fù)合物的作用下,使還原型輔酶Ⅱ的量不斷增加,用酶標(biāo)儀檢測(cè)340 nm下該物質(zhì)的增加量,進(jìn)而計(jì)算得到果糖質(zhì)量濃度。

1.4 血清骨代謝細(xì)胞因子檢測(cè)

首先將預(yù)混合珠瓶在超聲儀浴中超聲處理1 min,并在渦旋中超聲處理30 s;將20×洗滌緩沖液加熱至室溫,混勻使所有鹽溶解;用475 mL去離子水稀釋25 mL 20×洗滌緩沖液,未使用的部分儲(chǔ)存在2～8 ℃,最長(zhǎng)可儲(chǔ)存1個(gè)月。添加5.0 mL LEGENDplexTM測(cè)定緩沖液至裝有凍干Matrix A的瓶子中,渦旋≥15 min以使其完全溶解,剩余的Matrix A在≤-70 ℃下保存不能超過1個(gè)月。取50 μL空腹血清樣本加入50 μL測(cè)試緩沖液,將所有試劑放至室溫后加入“V”形底板。流式細(xì)胞儀主要設(shè)置參數(shù)為報(bào)告通道FL2;通道發(fā)射激光575 nm;分類通道FL4;通道發(fā)射激光660 nm。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。正態(tài)分布資料采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn),非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗(yàn);兩樣本率的比較采用卡方檢驗(yàn);果糖與骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子間的關(guān)聯(lián)關(guān)系采用多變量Logistics回歸模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 果糖暴露與非暴露人群的一般資料比較

與未檢出血清果糖的人群相比,果糖暴露人群高密度脂蛋白顯著降低、心率顯著升高(P<0.05;表1)。

表1 果糖暴露與非暴露人群一般資料比較(n=37)

2.2 13種骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合情況

如圖1所示,空腹血清13種骨代謝細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好(R2>0.99),其中,OPG、OPN、PDGF-BB、ALPL、ACP5、leptin、PTH、DKK-1等因子的擬合曲線的R2>0.999。

圖1 13種骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合情況

2.3 果糖高暴露老年人群與對(duì)照人群血清骨代謝細(xì)胞因子的水平差異分析

與未檢出血清果糖的人群相比,果糖高暴露人群血清OPN、ALPL、IL-6、DKK-1等細(xì)胞因子顯著升高(P<0.05;表2),其中,OPN增加最顯著,增加2.39倍。

表2 果糖暴露對(duì)空腹血清骨代謝細(xì)胞因子的影響(n=37) ng/L

2.4 老年人群果糖暴露與血清骨代謝細(xì)胞因子的關(guān)聯(lián)關(guān)系分析

采用Logistic回歸模型分析了空腹血清果糖與骨代謝細(xì)胞因子之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系,發(fā)現(xiàn)血清果糖與上述13個(gè)骨代謝細(xì)胞因子之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表3)。

表3 血清果糖對(duì)骨代謝細(xì)胞因子影響的OR值和95%置信區(qū)間

3 討 論

隨著年齡的增加,骨骼疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加,絕經(jīng)后女性及老年群體患病風(fēng)險(xiǎn)更高。2006年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,中國已經(jīng)有接近7 000萬骨質(zhì)疏松患者及超過2億的骨量減少患者[9]。隨著人口老齡化的加劇,中國骨代謝相關(guān)疾病患者的數(shù)量還將上升。

果糖有兩大代謝特征:首先,果糖顯著增強(qiáng)糖酵解,抑制能量消耗、促進(jìn)脂肪及糖原的生成;其次,果糖在進(jìn)入細(xì)胞后被快速磷酸化,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽急劇下降,從而激活一磷酸腺苷脫氨酶-2,促使一磷酸腺苷降解為肌苷酸并最終降解為尿酸[10]。在食物缺乏的條件下,果糖獨(dú)特的代謝機(jī)制增強(qiáng)了人類祖先的生存能力;但在當(dāng)前普遍能量過剩的情況下,果糖可能增加肥胖、代謝綜合征及高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[10]。然而,果糖對(duì)骨代謝的影響目前還缺乏人群水平的證據(jù)。本研究應(yīng)用小樣本人群探索性分析發(fā)現(xiàn)果糖高暴露人群血清OPN、ALPL、IL-6和DKK-1顯著升高。

成骨細(xì)胞表面的RANKL、NF-κB受體的活化因子(RANK)和OPG是破骨細(xì)胞發(fā)生和調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵決定因素[11]。在去卵巢大鼠模型中,給予10%的果糖喂食能顯著升高RANKL[12]。本研究在人群水平上并沒有發(fā)現(xiàn)果糖暴露對(duì)RANKL和OPG有顯著影響。

IL-6能上調(diào)成骨細(xì)胞表面RANKL的表達(dá)和加速RANK信號(hào),從而直接導(dǎo)致骨質(zhì)破壞[13]。本研究中,IL-6顯著升高但RANKL沒有明顯變化,表明果糖暴露能增加機(jī)體的炎癥水平。成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均可分泌OPN,在骨基質(zhì)的礦化和吸收過程中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清OPN顯著升高,其中,伴有骨侵蝕的患者血清OPN更高[14]。OPN在正常細(xì)胞和組織中的表達(dá)受抑制,只有在炎癥或組織損傷時(shí)其表達(dá)才增強(qiáng)。果糖暴露導(dǎo)致OPN顯著升高,可能與果糖暴露升高機(jī)體炎癥水平有關(guān)系。

DKK-1是dickkopf家族的成員。研究發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者循環(huán)DKK-1水平顯著升高,且DKK-1的異常表達(dá)引起的骨代謝功能障礙參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中病理性骨侵蝕的發(fā)病[15]。本研究結(jié)果顯示,果糖高暴露人群血清DKK-1顯著增高,提示果糖暴露可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有關(guān),但還需進(jìn)一步的證據(jù)。

ALPL在肝臟、骨骼和腎臟中分布最多,在堿性條件下(pH 8～10)能水解磷酸單酯,從而參與骨骼的礦化過程[16]。果糖暴露人群ALPL水平的升高并不代表果糖暴露能增加骨骼的礦化,還應(yīng)檢測(cè)ALPL的活性。

本文結(jié)果顯示,果糖暴露顯著降低高密度脂蛋白、顯著升高心率。高密度脂蛋白具有抗炎、抗氧化及血管保護(hù)等生物學(xué)作用[17]。既往一項(xiàng)大型隨機(jī)對(duì)照研究也報(bào)道了果糖暴露與高密度脂蛋白顯著降低有關(guān)[18];在慢性腎病患者中也觀察到果糖能降低高密度脂蛋白[19]。果糖對(duì)高密度脂蛋白的降低作用可能與其能加強(qiáng)脂肪生成有關(guān)[10]。在果糖升高心率方面,既往有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致[20],可能與果糖的血壓保持作用有關(guān)[10]。

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了37名高果糖暴露人群和37名對(duì)照人群血清骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子的改變情況,發(fā)現(xiàn)OPN、ALPL、IL-6和DKK-1四種細(xì)胞因子與果糖暴露顯著相關(guān)。但所納入的樣本量相對(duì)較小,回歸分析的結(jié)果為陰性可能與此有關(guān),后期應(yīng)該在此研究的基礎(chǔ)上開展更大規(guī)模的人群流行病學(xué)研究進(jìn)行驗(yàn)證。