基于二代測(cè)序技術(shù)探究葛根素治療酒精性肝炎的潛在分子靶點(diǎn)

張霞霞, 郎艷飛, 徐有青

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科,北京 100070;2.北京大學(xué)第三醫(yī)院消化內(nèi)科,北京 100191

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis,AH)導(dǎo)致約10%～20%患者肝硬化,而酒精性肝硬化是肝臟相關(guān)病例死亡的主要原因[1]。目前臨床上AH的有效治療手段欠缺,因此,積極尋找其有效治療AH的臨床藥物甚為急迫[2-3]。葛根素是從葛根中分離的天然異黃酮類衍生物活性物質(zhì),具有抗腫瘤和抗病毒的作用,可解諸毒,尤善解酒醒脾[4-6]。本課題組前期研究已論證葛根素對(duì)酒精性肝炎具有較好的治療作用,但具體作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)尚未明確[7-8]。本研究基于分子二代測(cè)序技術(shù)探究葛根素治療AH的潛在分子靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

C57BL/6雄性小鼠(維通利華公司);葛根素(山西西安瑞林生物科技有限公司);TRIzol試劑盒(Invitrogen公司,美國(guó));反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司,日本);分光光度計(jì)及Qubit3.0熒光定量?jī)x(賽默飛世爾科學(xué)公司);全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi-7180);Illumina平臺(tái)(型號(hào)DR08502,武漢)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

8周齡健康雄性C57BL/6小鼠9只,飼養(yǎng)于(23±2)℃、濕度40%～70%,12 h黑夜/白晝標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中,自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)均分為對(duì)照組、AH組、葛根素組。AH組及葛根素組予含5%Lieber-DeCarli酒精液體飼料飼養(yǎng),第6周予乙醇灌胃1次(5 g/kg),葛根素組在酒精飼養(yǎng)同時(shí),尾靜脈注射葛根素(4.2 mg/kg,1次/日),對(duì)照組予同等熱量液體飼料飼養(yǎng)。第8周末各組小鼠進(jìn)行安樂死,留取血清及組織標(biāo)本。

1.3 肝功能指標(biāo)測(cè)定

待血液凝固后,離心5～10 min,3 000 r/min,取上層血清置于全自動(dòng)生化分析儀設(shè)定位置上,進(jìn)入“校準(zhǔn)登記”后,測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)。

1.4 RNA提取與質(zhì)檢

研磨的肝組織標(biāo)本加入1 mL TRIzol渦旋混勻;置于冰上數(shù)分鐘至溶液澄清,加200 μL氯仿,搖晃15 s,冰上放置2～3 min;離心后取上層轉(zhuǎn)移至EP管中,加入1倍體積異丙醇,混勻,-20 ℃放置30 min,離心后棄上清,加入1 mL 75%乙醇洗滌、離心,重復(fù)上一步驟,棄上清,小槍頭吸凈管中液體,室溫干燥2 min,加適量DEPC水溶解RNA,Nanodrop儀器對(duì)RNA濃度和純度進(jìn)行測(cè)定,使用Qesp1000(RQN值)檢測(cè)RNA的完整性。

1.5 肝臟組織HE染色

將肝臟組織標(biāo)本浸泡于福爾馬林中4～6 h,OCT包埋盒固定樣本,流水沖洗過夜10 h。將組織裝入包埋盒中,應(yīng)用Leica ASP300S全自動(dòng)脫水機(jī)脫水、透明和浸蠟,切片后進(jìn)行HE染色,中性樹膠封片,于光學(xué)顯微鏡下觀察,采集圖像。其中肝臟組織學(xué)活動(dòng)性采用Knodell組織活性指數(shù)(histological activity index,HAI)評(píng)估[9],總分22分,分?jǐn)?shù)越高表示壞死越嚴(yán)重。

1.6 肝臟組織油紅O染色

取新鮮肝臟組織液氮速凍后,OCT包埋,6～8 μm切片,蒸餾水充分洗滌,油紅染色10～15 min,HE染核1～2 min,水洗,鹽酸酒精分化,返藍(lán),水洗,甘油明膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察,采集圖像。脂肪變性評(píng)分參考文獻(xiàn)[10],總分4分,分值越高表示脂肪變性程度越高。

1.7 RNA-Seq測(cè)序及分析

取5 μg總RNA建庫,利用磁珠回收目的大小片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,質(zhì)檢合格后上機(jī)測(cè)序。使用FastQC進(jìn)行質(zhì)量控制,具有≥90%覆蓋度的參考序列比對(duì)的讀數(shù)保留,通過質(zhì)量過濾器(CLC Genomics Workbench v4.9)的序列使用。獲得高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù),將數(shù)據(jù)比對(duì)到項(xiàng)目物種的參考基因組上,獲得全面轉(zhuǎn)錄本信息,采用Trimmomatic 0.36軟件獲取質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)和edgeR 3.12.1軟件(http://bioconductor.org)識(shí)別組間差異表達(dá)基因,使用KOBAS 2.2.1軟件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn.)進(jìn)行基因表達(dá)定量及GO、KEGG分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),GO及KEGG富集條目P通過Fisher精確檢驗(yàn),相關(guān)性分析通過Pearson法進(jìn)行計(jì)算。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肝組織學(xué)形態(tài)及血清GPT、GOT變化

HE及油紅O染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)完整、細(xì)胞核無增大、肝小葉形態(tài)完整;AH組小鼠彌漫性脂滴堆積和局灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);葛根素組肝組織炎癥較AH組改善,脂肪變性明顯減輕。葛根素組HAI評(píng)分較AH組明顯下降(P<0.05)。AH組較對(duì)照組GPT、GOT水平明顯升高(P<0.05),而葛根素組較AH組GPT、GOT水平則明顯下降(P<0.05;圖1)。

圖1 各組小鼠肝組織學(xué)形態(tài)及血清學(xué)變化a為P<0.05,與AH組比較;b為P<0.05,與對(duì)照組比較;c為P<0.05,與葛根素組比較。

2.2 RNA提取及質(zhì)檢結(jié)果

OD260/280、OD260/230均大于1.8,完整性檢測(cè)較好(RQN值均大于7.0),瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA文庫插入片段大小在400 bp左右(圖2A)。3例AH組和3例葛根素組分別獲得55 601 831個(gè)和52 934 410個(gè)矯正后短測(cè)序片段,主要分布在外顯子區(qū),其次是內(nèi)含子區(qū)及基因區(qū)間區(qū)(圖2B)。

圖2 RNA提取及質(zhì)控結(jié)果A為瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫插入片段大小;B為各標(biāo)本測(cè)序片段在參考基因組上不同區(qū)域的占比圖;C為AH組;T為葛根素組。

2.3 基因表達(dá)的層次聚類結(jié)果

采用RPKM值作為基因表達(dá)量的衡量指標(biāo)消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響?；虮磉_(dá)的層次聚類結(jié)果如圖3所示,綠色、紅色分別代表通過基因表達(dá)水平獲得較低的樣品間相關(guān)性和較高的樣品間相關(guān)性。由同一節(jié)點(diǎn)產(chǎn)生的分支線段代表對(duì)應(yīng)的樣品可以聚到一類,分支的長(zhǎng)度代表樣本的相似度:長(zhǎng)度越短,樣本間相似度越高;長(zhǎng)度越長(zhǎng),樣本間相似度越低。

圖3 基因表達(dá)的層次聚類結(jié)果圖(C為AH組,T為葛根素組)

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路分析

AH組和葛根素組間有較多差異表達(dá)基因,上調(diào)178個(gè),下調(diào)258個(gè)(圖4)。在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO功能條目包括574個(gè)為生物過程,141個(gè)為分子功能,64個(gè)為細(xì)胞組分。涉及的GO富集量主要集中在脂質(zhì)分解代謝過程的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成、微管等方面(圖5)。研究顯示兩組間差異表達(dá)基因被分為45條KEGG通路。兩組間上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因前10條KEGG通路見圖6。

圖4 AH組及葛根素組間差異表達(dá)基因散點(diǎn)圖

圖5 差異表達(dá)基因中顯著富集的GO功能條目

圖6 KEGG通路結(jié)果

3 討 論

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及生活方式的改變,酒精性肝病的發(fā)病率逐年上升;全球每年大約250萬人死于過量飲酒,是15～49歲年齡段壯年男性的主要致殘病因,造成巨大社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[11-12]。研究表明,除戒酒及肝移植外,糖皮質(zhì)激素僅被認(rèn)為對(duì)晚期酒精性肝硬化有效,但對(duì)長(zhǎng)期生存率的改善度尚未可知,同時(shí)禁忌證較多限制了其臨床應(yīng)用[13]。

葛根素在較多疾病中的抗炎作用已得到初步證實(shí),如在結(jié)腸炎[14]及腎損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[4],在酒精性肝損傷中可促進(jìn)酒精代謝作用,也可通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化改善肝纖維化[8,15-17];但其抗酒精性肝損傷的機(jī)制研究甚少,治療作用靶點(diǎn)尚未明確。本研究對(duì)葛根素治療的AH小鼠進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄組二代測(cè)序,探究其潛在作用靶點(diǎn),為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[18]。

本研究顯示AH小鼠造模成功,同時(shí)葛根素治療組較AH組轉(zhuǎn)氨酶明顯下降,HAI評(píng)分及脂肪變性評(píng)分均明顯改善,提示葛根素對(duì)酒精性肝炎具有一定的保護(hù)作用。鑒于目前可獲取的臨床治療酒精性肝炎的藥物有限,葛根素可作為潛在治療酒精性肝炎的臨床用藥。本研究進(jìn)一步通過二代測(cè)序技術(shù)探究葛根素治療酒精性肝炎的可能靶點(diǎn),測(cè)序結(jié)果顯示,AH組、葛根素組分別平均獲得55 601 831個(gè)和52 934 410個(gè)矯正后短測(cè)序片段,測(cè)序片段主要分布在外顯子區(qū),其次是內(nèi)含子區(qū)及基因區(qū)間區(qū)。AH組和葛根素組間差異表達(dá)基因中,下調(diào)258個(gè),上調(diào)178個(gè)。通過GO成功注釋,574個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)樯镞^程,141個(gè)為分子功能,64個(gè)為細(xì)胞成分。特異性差異表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行了詳細(xì)的GO項(xiàng)富集分析,主要涉及到有機(jī)酸代謝、細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成、雙鏈RNA結(jié)合、微管、髓鞘、外泌體等。兩組間上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG富集分析,主要富集在氨基酸代謝途徑以及縫隙鏈接、吞噬體、谷胱甘肽代謝、P53信號(hào)通路等,其中氨基酸代謝(酪氨酸代謝、精氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝)途徑可能是葛根素作用治療的潛在靶點(diǎn),為后續(xù)進(jìn)一步研究提供了有利證據(jù)。

綜上所述,葛根素對(duì)改善酒精性性肝炎具有一定療效,可能作為潛在的酒精性肝病的臨床治療用藥,本研究使用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)葛根素治療酒精性肝炎小鼠的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面分析,探究葛根素治療潛在靶點(diǎn),為葛根素藥物在酒精性肝病治療方面提供理論基礎(chǔ),為酒精性肝病提供新的臨床治療藥物。